体外 生理与病理血流模型及其在血管细胞重塑研究中的应用

摘要

该方案可模拟生理或病理条件下的血流 体外 有助于确定细胞在疾病病理条件下的反应。通过在血泵下游引入一个压力缓冲室，可模拟血管系统中的血流，并施加于血管内皮单层细胞或模拟共培养体系上。

摘要

血管疾病是美国境内常见的死亡原因。本文介绍一种用于研究血流动力学对血管疾病病理影响的方法。不健康的动脉常表现为管壁僵硬、瘢痕形成或部分狭窄，这些变化均可影响血流速率以及脉动血流的幅度，即脉动指数。通过调节血泵下游的流体压力阻尼腔，可实现对不同流动条件的模拟。在封闭的流动系统中引入空气，可提供一种可压缩介质以吸收来自血泵的脉动压力，从而调节脉动指数。本文所述方法易于重复，输入参数高度可控，结果易于测量。其局限性在于难以完全重现复杂的生理脉冲波形，系统仅能对其进行近似模拟。动脉内的内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞均受到血流的影响。血流的动力学成分由心输出量和动脉壁顺应性决定。血管细胞对血流动力学的机械转导可能触发细胞因子释放以及动脉内不同类型细胞之间的相互作用。血管细胞的共培养能够更真实地反映血管壁上细胞间的相互作用及其对机械信号的响应。因此，血流动力学的作用，包括细胞对流动动态成分和平均（或稳态）成分的响应，是评估疾病病理及治疗效果的重要指标。通过引入 体外 共培养模型及血泵下游的压力缓冲装置可产生模拟心输出量，用于研究多种动脉疾病病理。

引言

美国心血管疾病的发病率居高不下，其中许多疾病源于血管系统不健康。健康的动脉含有弹性组织，其管腔表面柔软，并覆盖有一层内皮细胞（EC）单层。动脉血流可被建模为具有正向平均流速的振荡波函数。搏动性指数（PI）是振荡幅度与平均血流的比值。PI = （最大值 - 最小值）/ 均值),¹ 并且已被建模 体外 血管弹性可变。² 动脉弹性在储存心脏收缩产生的血流能量方面具有重要作用，能够在收缩压下扩张，并对调节血流搏动指数（PI）发挥关键作用。由于心脏维持着稳定且具有脉动性的容积血流，动脉的扩张可增加其横截面积，通过降低血流速度、剪切应力和搏动指数来增强血流的稳定性。通常，不健康的动脉会出现弹性或顺应性改变，表现为因血管重构、瘢痕组织形成或钙化而导致的僵硬。^3,4此外，其他血管疾病，如新生内膜增生（NIH），⁵ 动脉瘤和高血压⁶ 和血管纤维化⁴，可能会导致血管直径变窄。然而，目前对血管疾病的药物治疗和器械治疗常常忽视了血管壁顺应性或血流动力学在血管疾病中的重要性，而血管疾病常伴随血管形态和性质的改变。无论是球囊血管成形术还是支架植入术，均未能解决血管壁弹性异常所带来的并发症⁷因此， 体外 由动脉疾病及其治疗引起的血流建模对于研究疾病的病理机制以及治疗方案的未来疗效具有重要意义。本文介绍一种用于模拟....

方案

1. 载玻片或聚碳酸酯膜的硅烷化及生物分子功能化

注意：本方案中的许多化学试剂和溶液具有较高的蒸发速率（乙醇（EtOH）、丙酮）， 等等。）。其他步骤需要长时间孵育以降低蒸发速率。建议使用石蜡膜密封容器。注意：多种化学品（包括：硫酸、丙酮、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷、戊二醛、乙醇）具有危害性或易挥发。使用前请查阅每种材料的安全数据表（MSDS），以了解正确的储存、操作和处置方法。

1. 将尺寸为 75 mm × 50 mm × 1 mm 的新玻璃载玻片放入洁净的玻璃载玻片染色缸中，无需考虑方向，确保完全浸没。此容器用于步骤 1.1–1.12。
   注意：若进行共培养实验，在后续所有步骤中均需包含尺寸为 75 mm × 50 mm、孔径为 0.4 微米的聚碳酸酯（PC）膜，用于 PC 功能化及内皮细胞接种。
2. 将载玻片浸入 20% 硫酸中，过夜处理。
   注意：使用硫酸前，请查阅其材料安全数据表（MSDS）。
3. 用去离子水（DI）浸泡载玻片 5 分钟，重复三次，每次更换去离子水。
4. 将载玻片浸入丙酮中 30 分钟。
   注意：使用丙酮前，请查阅其材料安全数据表（MSDS）。
5. 将载玻片浸入 6%（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷/丙酮溶液中，过夜处理。
   注意：使用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷和丙酮前，请查阅其材料安全数据表（MSDS）。
....

结果

流体条件的维持依赖于流路系统的正确组装（图1）。在组装过程中，管路直径的选择至关重要，较大的直径可降低流阻，从而减少培养室前后端的压力降。为确保预期的压力和流速，应在实验前使用目标管路并配合流量计对系统进行组装。培养室的真空通道（图2）需与硅胶垫片上的穿孔对齐（图中未示出），以维持流路系统内的密封性。为确保密封效果，可使用弹簧夹对垫片施加额外压力。玻璃载片应由聚碳酸酯板保护，该板材需裁剪至与培养室区域匹配（图6）。由于流速可能进一步影响密封的稳定性，可通过添加葡聚糖以提高培养基黏度，从而调整培养基性质。通过提高黏度，可在较低流速下维持所需的流体剪切力。实验过程中，可通过观察阻尼室和储液罐中的液位及液体颜色来检查系统的响应性和完整性（图3）。液位应保持恒定，初始液位应在储液罐和阻尼室上标记，以便后续比对检查。可在实验开始时通过添加培养基或向阻尼室引入空气来进行调节。图4展示了一次典型的流速记录结果。实验过程中，酚红的颜色应逐渐变浅。实验结束后，应让培养基从流路系统中排出，.......

讨论

本方案描述了一种重现脉动流的方法 体外 可能是确定血流条件对疾病病理学影响的首要步骤。采用本方案的前期研究已发现，血流条件可影响血管炎症反应。^1,10 此外，本方案适用于具有丰富经验的实验室，因此未在此详述流体力学或生物化学分析的深层原理。对于更复杂的流体动力学研究，¹ 并参考相关文献以了解先进技术和方法。² 在长时间流体剪切力条件下培养细胞时，关键因素包括：1）除储液器外，保持流体回路的密封性；2）在整个实验过程中防止污染。流体回路的密封对于维持培养基体积和正确的脉动指数（PI）水平至关重要，意外引入空气会影响预期的流动参数。系统中额外的空气可能部分阻塞流道，干扰流动路径，并增加整个系统的顺应性。尽管体积流量保持不变，但由于部分阻塞导致的横截面积减小，会引起局部流速升高和表面不连续性。流动速度的变化和表面不连续性均会导致流动失稳，甚至可能引发湍流。最后，任何进入加压流体系统的滞留空气都会作为可压缩阻尼，降低实际PI至低于设定值。由于流体回路体积恒定，滞留空气还可能导致培养基泄漏，从而对细胞产生不利影响，并随时间推移导致代谢产物浓度.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮	Sigma-Aldrich	34850
硫酸	Sigma-Aldrich	320501
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷	Sigma-Aldrich	440140
戊二醛溶液	Sigma-Aldrich	G5882
乙醇	Sigma-Aldrich	459844
载玻片 (70 mm x 50 mm)	Sigma-Aldrich	CLS294775X50
聚碳酸酯膜	Millipore Corp.	HTTP09030
硅胶垫圈	Grace Bio-Labs	RD 475464
纤连蛋白 (25 μg/ml)	Sigma-Aldrich	F1141
I型胶原蛋白	Sigma-Aldrich	C3867
NaHCO3	Fluka	36486
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
阻尼室			该装置为定制加工，可根据图3所示工程图纸提出加工要求。
血泵	Harvard Apparatus	529552
聚乙烯碳酸酯管	US Plastic	65066, 65063, 65062	可能需要多种规格
鲁尔接头	Nordson Medical	Various	需要多种规格，并应购买若干备用件。
培养室	自行加工	Custom	可购买亚克力板材按需加工。可依据图2所示工程图纸重新制作该装置。
方形培养皿	Cole-Parmer	EW-14007-10
载玻片架	Capitol Scientific	WHE-900303
胎牛血清	Mediatech, Inc.	35-010-CV
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Mediatech, Inc.	10-013-CV
流量计	Sonotec, GmbH	Sonoflow co.55/060
Sylgard 弹性体试剂盒	Sigma-Aldrich	761036-5EA
14 G 钢制套管	General Laboratory Supply	S8365-1