该方案可模拟生理或病理条件下的血流 体外 有助于确定细胞在疾病病理条件下的反应。通过在血泵下游引入一个压力缓冲室，可模拟血管系统中的血流，并施加于血管内皮单层细胞或模拟共培养体系上。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
血管疾病是美国境内常见的死亡原因。本文介绍一种用于研究血流动力学对血管疾病病理影响的方法。不健康的动脉常表现为管壁僵硬、瘢痕形成或部分狭窄，这些变化均可影响血流速率以及脉动血流的幅度，即脉动指数。通过调节血泵下游的流体压力阻尼腔，可实现对不同流动条件的模拟。在封闭的流动系统中引入空气，可提供一种可压缩介质以吸收来自血泵的脉动压力，从而调节脉动指数。本文所述方法易于重复，输入参数高度可控，结果易于测量。其局限性在于难以完全重现复杂的生理脉冲波形，系统仅能对其进行近似模拟。动脉内的内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞均受到血流的影响。血流的动力学成分由心输出量和动脉壁顺应性决定。血管细胞对血流动力学的机械转导可能触发细胞因子释放以及动脉内不同类型细胞之间的相互作用。血管细胞的共培养能够更真实地反映血管壁上细胞间的相互作用及其对机械信号的响应。因此，血流动力学的作用，包括细胞对流动动态成分和平均（或稳态）成分的响应，是评估疾病病理及治疗效果的重要指标。通过引入 体外 共培养模型及血泵下游的压力缓冲装置可产生模拟心输出量，用于研究多种动脉疾病病理。
引言
美国心血管疾病的发病率居高不下，其中许多疾病源于血管系统不健康。健康的动脉含有弹性组织，其管腔表面柔软，并覆盖有一层内皮细胞（EC）单层。动脉血流可被建模为具有正向平均流速的振荡波函数。搏动性指数（PI）是振荡幅度与平均血流的比值。PI = （最大值 - 最小值）/ 均值),1 并且已被建模 体外 血管弹性可变。2 动脉弹性在储存心脏收缩产生的血流能量方面具有重要作用，能够在收缩压下扩张，并对调节血流搏动指数（PI）发挥关键作用。由于心脏维持着稳定且具有脉动性的容积血流，动脉的扩张可增加其横截面积，通过降低血流速度、剪切应力和搏动指数来增强血流的稳定性。通常，不健康的动脉会出现弹性或顺应性改变，表现为因血管重构、瘢痕组织形成或钙化而导致的僵硬。3,4此外，其他血管疾病，如新生内膜增生（NIH），5 动脉瘤和高血压6 和血管纤维化4，可能会导致血管直径变窄。然而，目前对血管疾病的药物治疗和器械治疗常常忽视了血管壁顺应性或血流动力学在血管疾病中的重要性，而血管疾病常伴随血管形态和性质的改变。无论是球囊血管成形术还是支架植入术，均未能解决血管壁弹性异常所带来的并发症7因此， 体外 由动脉疾病及其治疗引起的血流建模对于研究疾病的病理机制以及治疗方案的未来疗效具有重要意义。本文介绍一种用于模拟生理和病理状态下血流的方法，旨在探究血管疾病病理过程中细胞的响应机制。流体流动会在血管壁处产生剪切应力，这是一种重要的力学信号，影响血管系统内所有细胞，与血管健康密切相关。目前已在血管内皮细胞上鉴定出多种感知流体剪切力的力学感受器，包括近年来研究发现参与内皮细胞机械感知的初级纤毛。8内皮细胞的活性和形态受流速、流向和脉动性的影响。此外，低速流动通过组织液产生的机械信号还可影响平滑肌细胞（SMC）的迁移。9，也可通过内皮细胞对血流的响应以及通过细胞因子释放实现血流信号的机械转导，从而介导旁分泌信号传导10平均剪切力、PI以及旁分泌信号之间的“剂量”依赖性也可能相互关联。为此，需在单层培养或共培养条件下，确定血管细胞对不同“剂量”流体剪切力的响应。 体外 可为血管重塑的机制提供深入见解，并改善对疾病进展和治疗效果的预测。本实验所用的流动系统包括血液泵、上游流量阻尼空气储液罐、仅在实验设置期间使用的下游流量计、下游细胞培养装置、平行板流动腔室以及培养基储液罐。通过调控流速、脉冲频率及引入压力阻尼，可实现对血管流动参数（如平均流速、每分钟搏动次数和搏动指数PI）的控制。脉动式血液泵具备可变冲程排量，并在受控的冲程频率下运行，直接对应于平均体积流速和脉冲频率。在流动回路中引入空气储液罐可实现压力阻尼，降低流动振荡幅度。培养基为不可压缩流体，而阻尼腔室中的空气具有可压缩性，因此流动波产生的过量压力可通过空气压缩被吸收。空气与培养基的比例决定了阻尼程度。定制的细胞培养流动腔室由丙烯酸材料制成，尺寸为长75 mm、宽50 mm。流动通过入口进入，经入口歧管扩展，从而在整个流动腔室内实现均匀流动。腔室出口处具有类似的流动特性和结构设计。细胞接种于功能化载玻片上，随后固定至流动腔室，便于实验后大量细胞的收集。共培养实验可使用多孔聚碳酸酯膜，以在允许细胞因子/流动物质传输的同时，避免细胞间的直接接触。该系统此前已被用于模拟高搏动指数（PI）血流及其对内皮单层细胞培养以及内皮细胞/平滑肌细胞（EC/SMC）共培养的影响。1,10，以研究细胞对病理性高PI疾病状态的响应。通过描述用于模拟这些流动条件的实验方案，我们希望有助于其他研究者确定流体信号在细胞响应中的作用。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 载玻片或聚碳酸酯膜的硅烷化及生物分子功能化
注意：本方案中的许多化学试剂和溶液具有较高的蒸发速率（乙醇（EtOH）、丙酮）， 等等。）。其他步骤需要长时间孵育以降低蒸发速率。建议使用石蜡膜密封容器。注意：多种化学品（包括：硫酸、丙酮、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷、戊二醛、乙醇）具有危害性或易挥发。使用前请查阅每种材料的安全数据表（MSDS），以了解正确的储存、操作和处置方法。
- 将尺寸为 75 mm × 50 mm × 1 mm 的新玻璃载玻片放入洁净的玻璃载玻片染色缸中，无需考虑方向，确保完全浸没。此容器用于步骤 1.1–1.12。
注意：若进行共培养实验，在后续所有步骤中均需包含尺寸为 75 mm × 50 mm、孔径为 0.4 微米的聚碳酸酯（PC）膜，用于 PC 功能化及内皮细胞接种。 - 将载玻片浸入 20% 硫酸中，过夜处理。
注意：使用硫酸前，请查阅其材料安全数据表（MSDS）。 - 用去离子水（DI）浸泡载玻片 5 分钟，重复三次，每次更换去离子水。
- 将载玻片浸入丙酮中 30 分钟。
注意：使用丙酮前，请查阅其材料安全数据表（MSDS）。 - 将载玻片浸入 6%（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷/丙酮溶液中，过夜处理。
注意：使用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷和丙酮前，请查阅其材料安全数据表（MSDS）。 - 将载玻片浸入丙酮中 5 分钟，重复三次，每次更换丙酮。
注意：使用丙酮前，请查阅其材料安全数据表（MSDS）。 - 用去离子水（DI）浸泡载玻片 5 分钟，重复三次，每次更换去离子水。
- 将载玻片浸入 1.5% 戊二醛/去离子水溶液中 60 分钟。
注意：使用戊二醛前，请查阅其材料安全数据表（MSDS）。 - 用去离子水（DI）浸泡载玻片 5 分钟，重复两次，每次更换去离子水。
- 将载玻片放入无菌超净工作台中的 70% 乙醇（EtOH）中，处理 30 分钟。
- 移除乙醇，使残留液体自然挥发。将载玻片浸入无菌去离子水中，随后沥干，以重新水化载玻片。
注意：载玻片或 PC 膜可密封于载玻片盒中，在 4 °C 下保存最多一周。用于细胞培养时，需重复步骤 1.10 和 1.11。 - 从载玻片盒中取出载玻片，置于超净工作台内的 100 mm × 100 mm 方形培养皿中。
注意：此容器将用于后续所有步骤。- 为单层培养实验准备载玻片或 PC 膜以接种内皮细胞。
- 在功能化处理的载玻片或 PC 膜（步骤 1.11）的一侧，加入 1 ml 纤连蛋白溶液（25 μg/ml），覆盖大致暴露于细胞培养腔的区域。
- 将载玻片或 PC 膜置于设定为 37 °C 的无菌培养箱中孵育 1–2 小时。
- 孵育结束后，使用连接真空泵的玻璃吸管吸除剩余溶液。
注意：载玻片现可于 4 °C 下过夜保存，以备后续使用。
- 仅在准备 EC/SMC 共培养时执行步骤 1.12.2。为共培养实验准备并接种平滑肌细胞（SMC）。
- 将硅胶垫片置于载玻片（步骤 1.11）上方，其外径为 75 mm × 50 mm，内径为 50 mm × 30 mm，厚度为 0.5 mm，且带有与流室真空孔对齐的穿孔。
- 制备 1 ml 含 10% FBS/DMEM 的 SMC 悬液。用 7% NaHCO3 和 0.1 M NaOH 溶液将 1 ml 浓度为 2 mg/ml 的 I 型胶原溶液中和至 pH 7.4，并与 SMC 悬液混合，最终细胞密度为 2 × 106 个细胞/ml。
- 将 SMC 溶液均匀涂布于垫片区域内，将载玻片置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟。
- 孵育结束后，用 25 ml 含 0.1% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）覆盖载玻片，继续培养 72 小时。
- 为单层培养实验准备载玻片或 PC 膜以接种内皮细胞。
- 在玻璃载玻片或聚碳酸酯膜上培养内皮细胞（ECs）。
- 在玻璃载玻片或聚碳酸酯膜的纤连蛋白表面接种 1 ml 含 10% FBS/DMEM 的 ECs，初始浓度为 6.0 × 105 个细胞/ml。
- 将细胞置于 37 °C、5% CO2、10% FBS 条件下的培养箱中孵育 120 分钟。
- 向含细胞的载玻片中加入额外的 10% FBS/DMEM 培养基，置于 37 °C、5% CO2 条件下过夜培养，直至细胞融合度达到 70%–80%。
2. 流体黏度与体积流量的测定
注意：旋转黏度计为精密仪器，在进行校准、调零或测量之前，应参考黏度计的用户手册。
- 根据目标血管的实验文献确定所需的流体剪切力（τ）。
- 使用旋转粘度计测量1% FBS/DMEM的黏度（μ）。
- 根据泊肃叶方程确定所需的体积流量（Q）：
，
其中 τ = 流体剪切力，μ = 黏度，Q = 体积流量，w = 腔室宽度，h = 腔室高度）。 - 将泵设置为第2.3步中计算出的流速，并在后续所有步骤中使用该流速。
3. 搏动指数的测定
注意：系统内的所有连接端口应使用尺寸合适的带锁环的接头与卡套接头，或雌性鲁尔接头与卡套接头进行连接。随后可将PVC管连接至卡套接头，并完成管路连接。
- 按照图2连接流路，将阻尼腔（图3）和超声波流量计按正确的流动方向接入管路。
注意：超声波流量计为精密仪器，使用前应仔细阅读用户手册。 - 通过确保储液罐出口管（通向泵）浸没在储液罐液面以下，用去离子水（DI水）填充流路和储液罐。使用流量计观察流动波形。
- 打开阻尼腔上的排气阀，以调节液体/气体体积比。在不同液位间隔下关闭排气阀，并利用流量波形的峰值（VMax）、谷值（VMin）和均值（VMean）计算搏动指数（PI = (VMax - VMin) / VMean）。将PI值记录在实验记录本中。
- 使用记号笔在阻尼腔上标记对应的液位和PI值，以备后续使用。根据病理学文献11确定目标PI水平。
- 硅胶管成型——可选的、更高级的搏动控制方法
- 通过以不同比例混合硅橡胶基体与固化剂（例如，基体与交联剂比例从10:1至36:1），实现不同的目标弹性模量，具体方法如前所述2。
- 采用反复浸渍-固化工艺制备硅胶管，即将不锈钢套管（14 G）短暂浸入含有预定基体-交联剂比例的硅胶预聚物混合液中。
- 将涂覆预聚物的套管置于60 °C烘箱中固化4小时，使聚合物涂层在套管表面固化，并在固化过程中间翻转方向。
- 使用相同的硅橡胶混合物重复浸渍过程，并再次放入烘箱中额外固化4小时，最终形成厚度约为0.3 mm的管材。
- 将超薄硅胶管从不锈钢套管上取下。
- 将硅胶管接入流路以替代阻尼腔，并按照步骤3.3测试每根管的搏动指数（PI）。
4. 泵的灭菌
- 将流室（图2）、PVC 管路和垫圈浸入 10% 过氧化氢（H2O2）中。在步骤 4 之前用无菌去离子水冲洗。
- 将血泵放置在孵育箱的备用搁板上。
注意：孵育箱搁板应为不锈钢材质，并能承受整个流路系统的重量。 - 确保储液器出口管（连接泵）浸没于储液器液体中，将流路系统和储液器充满 10% H2O2。在超净台内开启紫外灯，通过泵驱动 H2O2 在系统中循环 20 分钟。
- 抽吸管路中全部 H2O2，并通过泵驱动无菌 PBS 经流路系统进行冲洗。
5. 流动腔室组装
注意：流室由一块定制的丙烯酸板构成，带有真空接口以及进液和出液流道（见图2）。流室的组装是将流室和垫圈正确对齐后放置在培养载玻片上，具体步骤如下所述。
- 将含1% FBS的DMEM预热至37 °C水浴中，并准备流动腔室。
- 从培养基中取出内皮细胞（EC）载玻片（来自步骤1.13），将垫圈置于其上，细胞面朝上。
- （可选）从培养基中取出周细胞（PC）膜（来自步骤1.13），将垫圈置于其上，细胞面朝上。将已接种平滑肌细胞（SMC）的共培养载玻片（步骤1.12.2）置于PC膜下方。
- 将流动腔室的真空通道与垫圈上的孔对齐（图2）。
- 将真空管连接至真空接口（图2），确保培养基不会泄漏至真空系统中。
- 在玻璃载玻片下方放置聚碳酸酯板，并用弹簧夹固定流动腔室组件，每侧各使用一个弹簧夹（图2和图5）。
- 将流动系统置于37 °C、5% CO2的培养箱中，通过低脉动泵送充满培养基的储液器向回路中灌注培养基。持续此流动状态4小时，以预处理细胞。
- 调节阻尼腔室中的液体体积至标记的PI水平，并继续培养至所需时间。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
流体条件的维持依赖于流路系统的正确组装（图1）。在组装过程中，管路直径的选择至关重要，较大的直径可降低流阻，从而减少培养室前后端的压力降。为确保预期的压力和流速，应在实验前使用目标管路并配合流量计对系统进行组装。培养室的真空通道（图2）需与硅胶垫片上的穿孔对齐（图中未示出），以维持流路系统内的密封性。为确保密封效果，可使用弹簧夹对垫片施加额外压力。玻璃载片应由聚碳酸酯板保护，该板材需裁剪至与培养室区域匹配（图6）。由于流速可能进一步影响密封的稳定性，可通过添加葡聚糖以提高培养基黏度，从而调整培养基性质。通过提高黏度，可在较低流速下维持所需的流体剪切力。实验过程中，可通过观察阻尼室和储液罐中的液位及液体颜色来检查系统的响应性和完整性（图3）。液位应保持恒定，初始液位应在储液罐和阻尼室上标记，以便后续比对检查。可在实验开始时通过添加培养基或向阻尼室引入空气来进行调节。图4展示了一次典型的流速记录结果。实验过程中，酚红的颜色应逐渐变浅。实验结束后，应让培养基从流路系统中排出，...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案描述了一种重现脉动流的方法 体外 可能是确定血流条件对疾病病理学影响的首要步骤。采用本方案的前期研究已发现，血流条件可影响血管炎症反应。1,10 此外，本方案适用于具有丰富经验的实验室，因此未在此详述流体力学或生物化学分析的深层原理。对于更复杂的流体动力学研究，1 并参考相关文献以了解先进技术和方法。2 在长时间流体剪切力条件下培养细胞时，关键因素包括：1）除储液器外，保持流体回路的密封性；2）在整个实验过程中防止污染。流体回路的密封对于维持培养基体积和正确的脉动指数（PI）水平至关重要，意外引入空气会影响预期的流动参数。系统中额外的空气可能部分阻塞流道，干扰流动路径，并增加整个系统的顺应性。尽管体积流量保持不变，但由于部分阻塞导致的横截面积减小，会引起局部流速升高和表面不连续性。流动速度的变化和表面不连续性均会导致流动失稳，甚至可能引发湍流。最后，任何进入加压流体系统的滞留空气都会作为可压缩阻尼，降低实际PI至低于设定值。由于流体回路体积恒定，滞留空气还可能导致培养基泄漏，从而对细胞产生不利影响，并随时间推移导致代谢产物浓度...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者希望感谢以下资助来源，包括美国心脏协会（AHA）（13GRNT16990019 资助 W.T）和美国国家心肺血液研究所（NHLBI）（HL097246 和 HL119371 资助 W.T）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙酮 | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| 硫酸 | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| 戊二醛溶液 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| 载玻片 (70 mm x 50 mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| 聚碳酸酯膜 | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| 硅胶垫圈 | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| 纤连蛋白 (25 μg/ml) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| I型胶原蛋白 | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| 阻尼室 | 该装置为定制加工，可根据图3所示工程图纸提出加工要求。 | ||
| 血泵 | Harvard Apparatus | 529552 | |
| 聚乙烯碳酸酯管 | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | 可能需要多种规格 |
| 鲁尔接头 | Nordson Medical | Various | 需要多种规格，并应购买若干备用件。 |
| 培养室 | 自行加工 | Custom | 可购买亚克力板材按需加工。可依据图2所示工程图纸重新制作该装置。 |
| 方形培养皿 | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| 载玻片架 | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| 胎牛血清 | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| 流量计 | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard 弹性体试剂盒 | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G 钢制套管 | General Laboratory Supply | S8365-1 |
参考文献
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195(2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -H., Huang, X. -Q., Tan, H. -M. Vascular fibrosis in atherosclerosis. Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
