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方法文章

开放场塔迷宫中的位置学习与反应学习

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DOI：

10.3791/53227

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2015年10月28日

 ,  ,  , 
1Department of Psychology, Christopher Newport University, 2Department of Psychological Science, University of Vermont

本文内容

摘要

开放旷场塔迷宫（OFTM）是一种用于研究空间学习行为与神经机制的迷宫例如，用于研究大鼠的地点学习或反应学习。该迷宫特别适用于希望采用非应激性迷宫范式来探究空间学习的研究人员。

摘要

本实验方案描述了如何利用开放式旷场塔迷宫（OFTM）范式研究啮齿类动物的空间学习能力。该迷宫特别适用于考察大鼠如何通过位置学习或反应学习在开放式旷场环境中成功导航。此外，本方案还阐述了OFTM与其他常用于研究啮齿类动物空间学习的行为迷宫范式之间的差异。本文所述的OFTM改编自Cole、Clipperton和Walt（2007年）先前描述的版本。具体而言，OFTM的设计旨在测试啮齿类动物的空间学习能力，同时无需实验者将“应激”作为混杂变量加以考虑。已有实验证明，仅应激因素即可显著影响认知功能1。代表性结果部分展示了利用OFTM研究雌二醇处理对成年雌性Sprague Dawley大鼠位置学习与反应学习影响的实验数据2。未来的研究将致力于探讨海马和纹状体在OFTM中位置学习与反应学习中的作用。

引言

开放旷场塔式迷宫（OFTM）可用于研究啮齿类动物空间学习的行为与神经生物学机制。重要的是，OFTM 可使研究人员同时研究“基于位置的学习”和“基于反应的学习”两种学习类型。在位置学习过程中，动物利用周围环境中的空间线索在迷宫中导航（例如，食物奖励位于一个高大信标附近）。而在反应学习过程中，动物无论其相对于空间线索的位置如何，均执行特定的转向反应（例如，向左或向右转以找到食物奖励）。已有研究报道，反应学习和位置学习依赖于两种不同的记忆系统3, 4，解析其神经机制一直是科学研究的重要方向2, 5-7。OFTM 的设计改编自先前描述的一种迷宫结构8。

旷场实验范式（OFTM 的一个组成部分）常用于研究啮齿类动物的焦虑行为9。在典型的旷场焦虑测试中，停留在旷场中央区域时间较长的大鼠，其应激和焦虑水平低于更多时间停留在边缘区域的大鼠。在 OFTM 中，大鼠必须进入迷宫的中心区域才能获得食物奖励。因此，成功完成 OFTM 导航表明这些大鼠处于非应激状态。大鼠在训练过程中之所以处于非应激状态，其中一个原因是：与标准的旷场焦虑测试不同，OFTM 包含一个预训练阶段，在此阶段中，大鼠会经过长时间反复暴露于迷宫环境中。此外，训练在光线较暗的环境中进行，进一步降低了旷场环境引发的焦虑反应——而标准旷场测试通常在明亮光照条件下进行。

与某些其他迷宫相比，OFTM 的另一个独特之处在于其学习能力的测量方式。使用莫里斯水迷宫或巴恩斯迷宫的研究人员通常通过分析大鼠到达目标位置的速度和（或）路径长度来衡量学习效果。这些因变量可能受到非学习因素的影响，例如大鼠整体运动活动的变化。然而，OFTM 通过测量大鼠首次选择正确路径以找到食物奖励的百分比来评估学习效果。这种因变量不受运动表现变化的影响，因此比速度和距离的测量更能准确地评估学习能力。尽管如此，实验人员也可以使用视频追踪软件测量大鼠在 OFTM 中的移动速度和行进距离。

其他类型的迷宫，例如T迷宫、莫里斯水迷宫和巴恩斯迷宫，可用于研究位置学习和反应学习。然而，开放场四臂迷宫（OFTM）在几个显著方面具有独特性。首先，OFTM比T迷宫具有更高的行为检测敏感性，因为OFTM的随机正确率为25%，而T迷宫的随机正确率为50%。其次，大鼠在T迷宫中只能选择两个方向之一进行转向，而在OFTM中导航时则具有不受限制的路径选择。第三，与莫里斯水迷宫和巴恩斯迷宫任务（这两者与OFTM一样具有自由路径选择）不同，使用OFTM的实验不需要大鼠经历厌恶情境。大鼠在莫里斯水迷宫中的动机是逃离在水中游泳的状态，而在巴恩斯迷宫中的动机则是避免处于开阔且明亮的环境中。已有研究表明，暴露于莫里斯水迷宫或巴恩斯迷宫会诱导啮齿类动物释放应激激素（即，皮质酮）10。然而，大鼠在OFTM中进行导航的动机是为了获取食物奖励，且训练过程在昏暗的环境光照下进行。因此，OFTM是一种非厌恶性的趋近性任务。使用具有应激性的迷宫范式来研究药物、激素、运动或饮食等干预对学习和记忆机制影响的实验结果可能难以解释，因为“应激”本身可能会影响认知功能11。

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方案

本方案已获得克里斯托弗纽波特大学机构动物护理与使用委员会的批准。

1. OFTM 装置的构建

  1. 用三块白色层压板构建边界墙（高 40 cm，直径 183 cm）。用黑色层压板制作圆形迷宫底面（直径 183 cm），并将其粘合到塑料桌面上。用螺丝和胶水将边界墙固定在桌面边缘。
  2. 装饰边界墙的内表面：将其中四分之一保持纯白色；将另一个四分之一涂成纯黑色；将第三个四分之一涂上黑色条纹；将第四个四分之一涂上黑色圆圈。
  3. 用方形白色 PVC 立柱制作四个“食物塔”（8 cm × 8 cm × 20 cm；图 1A）。将一块黑色层压板（8 cm × 8 cm）粘在每座塔的顶部。使用强力胶将它们固定在迷宫底面上，彼此相距 54 cm。
  4. 用方形白色 PVC 立柱制作三个“预训练塔”（高度分别为 5 cm、10 cm 和 15 cm；图 1B）。将一块黑色层压板（8 cm × 8 cm）粘在每座塔的顶部。这些塔仅在预训练阶段（如下所述）用胶带固定在迷宫底面上。
  5. 将一个黑色不透明塑料食物杯（带螺纹盖 = 涂成黑色的透明塑料珠子容器；高 1.75 cm，直径 3.75 cm）用胶粘在每个食物塔的顶部。在每个盖子上钻三个小通气孔（直径 3 mm）。这些孔可确保大鼠无法通过嗅觉线索找到“正确”的食物塔。训练塔的高度确保大鼠无法通过未加盖的食物杯作为视觉线索来定位“正确”塔。

开放场塔迷宫装置示意图；空间导航，啮齿类动物研究的预训练塔。
图1. 开放场塔迷宫（OFTM）的照片。 (A) 在习得阶段以及所有后续的训练和测试中，大鼠仅能从一个放置食物奖励的“训练塔”中找到并获取食物奖励。(B) 在预训练期间，三个“预训练塔”被放置在迷宫区域的中央。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. OFTM 迷宫室

  1. 使用带有60 W灯泡（流明：800）的灯具对迷宫房间进行微弱照明。灯具位于地面以上3英尺处，距离迷宫侧面2英尺，灯头朝向天花板。使用声源设备播放背景白噪声（约70 dB）。
  2. 将一台数码摄像机安装在迷宫正上方的天花板上，以将视频传输至计算机。悬挂不透明帘子，将迷宫区域与计算机监控区域隔开。

3. 大鼠操作、食物限制与饲养

  1. 在预训练前，每位实验人员应每天与所有大鼠互动 4 分钟，持续 7 天。
  2. 将大鼠置于食物限制饮食方案中（每天自由进食 1 小时）。该饮食方案可确保大鼠在训练期间有获取奖励的动机，同时维持健康体重（约为自由进食体重的 90%）。
  3. 在整个实验过程中，将雌性大鼠成对同笼饲养（若使用雌性大鼠）。成对饲养的雌性大鼠比单独饲养的雌性大鼠焦虑程度更低12。

4. 预训练步骤

  1. 在七个塔的每个未加盖的食物杯中放入食物奖励（例如，一片谷物果脆）作为诱饵。
  2. 将一只大鼠随机放入迷宫中，使其寻找并吃掉全部七份食物奖励后，再将其移出。
    1. 如果大鼠在10分钟内未能取回并吃完所有食物奖励，则将其从迷宫中移出，并于次日再次进行预训练程序。注意：部分大鼠初次学习从塔顶获取食物奖励所需时间较长。
    2. 如果大鼠在预训练的前两天内未能从塔上取回并吃完全部七份食物奖励，则需在开放式塔迷宫（OFTM）中额外进行每次30分钟的训练 session，直至其成功获取所有食物奖励。通常情况下，大鼠在经历一至两次此类30分钟训练后即可找到并吃完所有食物奖励。

5. 定位训练与反应训练程序

  1. 为每只大鼠分配四个起始位置中的两个。在每次训练日及训练日之间，需平衡以下因素：起始位置的释放点；学习类型（位置学习 vs. 反应学习）；所有位置学习大鼠的“正确目标塔”；以及每只反应学习大鼠被训练所转的方向（右转 vs. 左转）。
  2. 每天训练开始时，打开噪音发生器并启动视频记录程序。在四个塔上均放置诱饵，但覆盖其中三个食物杯，仅让“正确目标塔”上的食物奖励暴露在外。
  3. 在每次试验中，先开始视频记录（操作说明请参阅设备制造商的用户手册），然后将大鼠放置于迷宫中指定的起始位置。随后，走到帘子后方，通过计算机显示器观察大鼠的行为。一旦大鼠获取奖励，或3分钟时间已到，立即将其从迷宫中移出，并停止视频记录。
    1. 对于位置学习大鼠，始终使用同一个“正确”食物塔，并将大鼠从两个起始位置之一放入。位置学习大鼠通过利用迷宫中提供的空间线索寻找特定位置来解决OFTM任务。例如，在塔D（=“正确”目标塔）放置食物，并从起始位置‘2’或‘3’释放大鼠（见图2A左侧的实线箭头）；或在塔A放置食物，并从起始位置‘1’或‘4’释放大鼠（见图2A左侧的虚线箭头）。
    2. 对于反应学习大鼠，根据起始位置更换“正确”食物塔。反应学习大鼠通过学习执行特定转向（例如，始终右转）来解决OFTM任务，而不考虑其在迷宫中的起始位置。例如，在塔D放置食物，并从起始位置‘3’释放大鼠；或在同一动物上，在塔B放置食物，并从起始位置‘2’释放（见图2B左侧的实线箭头）。对于另一只大鼠，在塔B放置食物并从位置‘1’释放，或在塔A放置食物并从位置‘4’释放（见图2B左侧的虚线箭头）。
  4. 所有大鼠在12天内共接受48次训练试验（每天4次试验）。

位置学习与反应学习示意图；训练与起始位置转换测试；迷宫导航模式。
图 2. 俯视示意图：显示位置学习与反应学习的训练及测试流程。 本图展示了位置学习组训练阶段的起始位置和食物奖励位置（A，左），以及反应学习组的相应位置（B，左）；同时展示了在起始位置转换测试中，位置学习组（A，右）和反应学习组（B，右）所使用的起始位置和奖励位置。数字表示大鼠的起始位置；灰色方块代表食物塔；实线和虚线指向有食物奖励的食物塔。每种训练条件内的起始位置均进行了平衡设计。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 开始位置切换测试流程

  1. 当所有大鼠的表现均达到稳定水平（正确首次选择反应率约80%）后，进行“起始位置转换测试”，以检验已习得行为的持续性。
  2. 平衡新的起始位置（即尚未被大鼠使用过的起始位置。
  3. 按照第5节方案中所述的每个训练试验步骤，使用新的起始位置进行操作。
    1. 对于一只原本从位置“2”或“3”出发、并将塔D作为“正确”目标塔的位置学习型大鼠，将其放置在新的起始位置“1”或“4”中的任意一个，同时仍以塔D作为 baiting 塔（图 2A，右侧。
    2. 对于一只原本从位置“2”或“3”出发、学会向右转以获得奖励（分别在B塔和D塔）的反应学习型大鼠，将其放置在新的起始位置“1”或“4”中的任意一个，并分别在A塔或C塔中投放诱饵（这仍然要求大鼠向右转才能找到食物奖励） 图2B，是的。
    3. 在两天内对所有大鼠进行八次起始位置转换测试试验（每天四次）。

7. 数据分析

  1. 由一名未接受过训练大鼠经验且不了解每只大鼠处理分组的实验人员，通过回放录像对试验进行评分：统计每只大鼠在每次试验中为寻找“正确”塔所做出的反应次数（以大鼠在食杯上方直立为标志）。
  2. 计算大鼠在每次训练日内首次选择即找到奖励的百分比（首次选择正确反应百分比）。根据各训练日的首次选择正确反应百分比绘制学习曲线。在统计分析中使用首次选择正确反应百分比作为指标。
  3. 计算大鼠到达目标所需的试验次数 先验的 设定获取任务的标准（即，连续10次试验中至少正确响应8次为首选标准）。未达到该标准的大鼠应排除在分析之外 先验的 标准

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结果

此处所述的代表性结果先前已发表于《学习神经生物学》 & 记忆，Elsevier2在本实验中，使用OFTM检测慢性和循环性雌二醇处理对雌性Sprague-Dawley大鼠（250 – 300 g；N = 48）位置学习和反应学习的影响。采用OFTM进行本实验主要有两个重要原因。首先，已有研究表明雌二醇对位置学习和反应学习具有不同的影响7其次，有必要在非应激环境中检测雌二醇对学习的影响，因为性腺激素在暴露于应激情境下的人群中会产生不同的效应13. 在 Lipatova 等 (2014) 年的实验中，对卵巢切除的雌性大鼠每日进行皮下注射雌二醇（estradiol）10 µg/kg）或载体溶液（花生油）。处于“持续”条件下的大鼠每日接受雌二醇注射，处于“载体”条件下的大鼠每日接受载体溶液注射。处于“循环”条件下的大鼠每4天接受一次雌二醇注射th 天，其余各天给予溶剂对照溶液。每种条件下的大鼠有一半接受位置训练程序，另一半接受反应训练程序。六只大鼠未达到 先验的 达到标准后停止训练，因此未纳入分析。最终分组为：Veh...

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讨论

有多种实验范式可用于研究啮齿类动物的学习与记忆，每种范式都有实验人员应遵循的重要步骤。在OFTM实验中，必须在整个实验过程中保持迷宫条件（例如，迷宫位置、迷宫内和迷宫外线索、昏暗的光照强度、背景噪音水平、每日训练时间）恒定。此外，必须尽量减少大鼠受试者的应激反应，以确保其在OFTM中的持续表现。通过将雌性大鼠成对饲养，以及在训练前由实验人员进行常规抓握操作，可将应激水平降至最低。为了准确评估大鼠在训练和测试期间的表现（即，大鼠选择正确或错误的食塔），应使用足够高的食塔，使大鼠必须“攀爬”上食塔并直立身体探入食杯才能获取奖励。食杯的盖子在大鼠“攀爬”食塔之前对其不可见。因此，大鼠所选择的食塔是明确无误的，实验人员可据此进行可靠评分。如果实验人员希望使用视频追踪软件分析大鼠的运动速度、移动距离和/或在迷宫特定区域停留的时间，则迷宫地面必须由与大鼠体色具有高对比度的材料制成。

可使用OFTM任务检测位置学习和反应学习的长期记忆保持能力。在完成48次训练试验后，所有大鼠可在其饲养笼中静置21天，期间不进行任何操作。这一21天的时间间隔常用于检测长期记忆的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢克里斯托弗纽波特大学为本稿件的撰写提供资金支持，以及佛蒙特大学为代表性结果部分所述实验提供资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
OFTM 建材
安全眼镜，透明，未镀膜格雷格纳4EY97用于迷宫建造期间的一般眼部防护
美纹纸胶带，米色，18 毫米 × 55 m格雷格纳15F739通用耗材
Wiss 万能剪刀家得宝 37103278647常规耗材
Lancaster 6英尺圆形折叠桌 - 重型白色花岗岩塑料 - 29" www.webstaurantstore.com384YCZ72RND用作迷宫的基底
白色哑光饰面层压板台面（48 x 96 x 0.039）家得宝 1573603504896用作迷宫的墙壁
黑色哑光饰面层压板台面（48 x 96 x 0.039）家得宝 1595603504896用作迷宫的底部
粘合剂，喷雾型，24 盎司，17.6 oz 网。3M格雷格纳3MA16用于将复合地板粘附于桌面，以及将各块复合地板相互粘合
16.6 盎司 #90 高强度 SLowe的193252用于将复合地板粘附到桌面
Superflex RTV，硅酮粘合密封剂，LoctiteVWR300040-068用于密封基座周围（迷宫的地板与墙壁之间）
工业密封剂；10.1 oz格雷格纳4UH06用于密封迷宫底部（迷宫地板与墙壁之间）
画家用遮蔽胶带；Shurtape；2 ×60 yd格雷格纳6FET7用于在迷宫墙壁上标记视觉图案
迷你/窄幅油漆托盘ACE Hardware1365105用于盛放油漆 
泡沫迷你滚筒刷 4" 6 pkACE Hardware1494871用于绘制图案 
Val 样品集 Nbase 染料ACE Hardware1505031用作迷宫墙壁图案的涂料
HP喷漆黑沃尔玛72450405005用于在迷宫墙壁上绘制图案
刷子沃尔玛81773801110用于在迷宫墙壁上绘制图案
Duct Tape, 2 ×60 yd, 10.5 毫升。黑色格雷格纳15F767用于包裹迷宫的外部
4x4 8 ft PT 松木 乙烯基-CTD 带帽立柱家得宝 40933070541用于构建迷宫的塔
20克Pro Super GlueLowe's125870用于粘合塔顶、将塔固定在迷宫底板上，以及将食杯粘在塔顶
珠子容器 9 - 1/2Michaels652695766978用作塔顶上的食物杯
喷漆，黑色，12罐 oz格雷格纳6KP22用于涂抹食物杯 &和覆盖物
房间准备
Conair SU1W 声音机；10 种声音家得宝 204493600用于背景噪声
灯沃尔玛5027698392用于迷宫房间的弱光照明
ES 14 4 瓦日光螺旋灯泡 pk家得宝 762148208433用于迷宫房间的昏暗照明
浴帘沃尔玛3429910901用于分隔迷宫与实验操作者
窗帘杆床铺与洗浴 &及更广泛的应用76598645104用于分隔迷宫与实验操作者
Froot Loops 麦片沃尔玛3800039122用作奖励
记录设备
Media Recorder 3:4 视频NoldusNMR4-0200用于记录训练试验
单色GigE相机NoldusXCFW-BG62用于记录训练试验
Precision M4800 笔记本电脑戴尔N/A用于运行视频软件

参考文献

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