本手稿描述了如何利用双子叶杂草的离体叶片有效量化除草剂代谢速率，从而降低变异性，并消除在整株植物测定中通常观察到的除草剂吸收或转运可能带来的混杂效应。
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摘要
摘要
为了分离并准确测定一种严格异花授粉的双子叶杂草——水麻（Amaranthus tuberculatus）中除草剂的代谢速率，我们开发了一种离体叶片检测方法，并结合营养繁殖克隆策略，以标准化除草剂吸收，并消除在抗除草剂（R）和敏感型（S）水麻种群中除草剂转运对结果的干扰因素。植物体内有机农药的生物动力学分析通常包括对吸收、转运（向作用靶点的递送）、代谢归宿以及与靶点相互作用的测定。除草剂代谢是评估抗除草剂杂草和耐除草剂作物的重要参数，通常通过使用放射性标记除草剂的整株植物试验来完成。然而，解释来自整株植物方法所得生物动力学参数时存在一个难点：除草剂的代谢速率常常影响其转运过程，因为在除草剂解毒反应后生成的极性代谢产物通常在植物体内不具备移动性。本文所述实验方案的优势包括：可重复、准确且快速地测定R和S种群中除草剂的降解速率；显著减少放射性标记除草剂的用量；大幅降低需要后续处理和处置的放射性植物材料量；以及能够在实验室或人工气候室中开展放射性标记除草剂实验，而无需依赖温室条件。随着除草剂抗性在全球范围内双子叶杂草种群中持续发展和扩散，本文所建立和描述的离体叶片检测方法将为研究因除草剂代谢和解毒能力增强所导致的非靶标位点抗性提供一种极为宝贵的技术手段。
引言
杂草对除草剂的抗性对全球粮食和纤维的生产构成了严重威胁1,2。目前，全球已有记录并研究了来自一百多种杂草物种的数千个抗性种群和生物型3。植物中赋予除草剂抗性的一个主要机制是除草剂靶标位点基因和蛋白质的改变，包括影响除草剂-蛋白质结合动力学的基因突变或靶标位点基因的扩增2。通过细胞色素P450单加氧酶（P450）或谷胱甘肽S-转移酶（GST）酶活性升高介导的代谢解毒是杂草中赋予除草剂抗性的另一机制，该机制在多个方面与基于靶标位点的抗性机制不同2。基于代谢的抗性机制是否会导致植物适合度代价（亦称 适合度惩罚），以及单一解毒机制是否可能使杂草种群产生交叉或多重除草剂抗性，均具有重要意义1,2,4。通常，植物中的除草剂代谢可分为三个明确的阶段5。第一阶段涉及除草剂的转化或活化，例如由P450介导的芳香环或烷基的羟基化，或通过N-或O-去烷基化反应，从而增加分子极性并实现部分除草剂解毒5,6。第一阶段引入的新官能团可为第二阶段的结合反应提供位点，例如由GST催化与还原型谷胱甘肽结合，或由UDP依赖性糖基转移酶催化与葡萄糖结合5,7。例如，甲基嘧磺隆在玉米中的主要初始代谢产物为羟基甲基嘧磺隆8，其可进一步代谢为羟基甲基嘧磺隆-葡萄糖苷（第二阶段），随后被转运至液泡中进行长期储存或进一步代谢处理5,6（第三阶段）。
水麻（Amaranthus tuberculatus）是一种难以防治的双子叶一年生杂草，在美国严重阻碍玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）和棉花（Gossypium hirsutum）的生产。由于水麻为雌雄异株植物，且可通过远距离风媒传粉，因而具有高度的遗传多样性，单株雌性水麻植株可产生多达一百万粒种子9。这些种子体积小且易于传播，使其天然具备高效的扩散机制。水麻在整个生长季内持续出苗9，其种子在休眠数年后仍能萌发。水麻属于C4植物，其生长速率高于多数旱田阔叶杂草10。此外，大量水麻种群已对多种除草剂产生抗性3。
来自伊利诺伊州的一种水麻种群（命名为MCR）对4-羟基苯丙酮酸双加氧酶（HPPD）抑制类除草剂11（如硝磺草酮）以及莠去津和乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制类除草剂（包括甲酰氨基嘧磺隆）具有抗性，其抗性机制基于非靶标位点机制12,13。在先前的研究12和当前实验中（详见表1），我们还使用了另外两种水麻种群作为对照：一种是被命名为ACR14的种群，其对甲酰氨基嘧磺隆（因ALS基因发生突变）和莠去津具有抗性，但对硝磺草酮敏感；另一种是被命名为WCS14的种群，其对甲酰氨基嘧磺隆、硝磺草酮和莠去津均敏感。早期研究在MCR种群中未检测到HPPD基因序列或表达水平的改变，也未发现硝磺草酮吸收量减少12。然而，对整株植物的代谢研究表明，与ACR和WCS种群相比，MCR种群体内母体硝磺草酮除草剂的残留量显著更低，该结果与此前观察到的硝磺草酮表型反应一致11,12。
| 水麻种群 | 缩写 | 对甲基磺草酮的表型 | 甲基磺草酮抗性机制 | 对单嘧磺隆的表型 | 单嘧磺隆抗性机制 |
| McLean County-Resistant | MCR | 抗性 | 代谢作用* | 抗性 | 代谢作用 |
| Adams County-Resistant | ACR | 敏感 | - | 抗性 | ALS基因靶标位点突变14 |
| Wayne County-Sensitive | WCS | 敏感 | - | 敏感 | - |
* 除增强的代谢作用外，非靶标位点抗性机制也可能赋予MCR种群对硝磺草酮的抗性12。
表1： 本研究中使用的来自伊利诺伊州的水麻种群描述。
除了测定完整水麻幼苗中除草剂的代谢速率外，我们在先前的研究中还开发并采用了一种不同的实验方法，利用离体水麻叶片测定法12以及多种P450抑制剂（例如，四氯丙酸和马拉硫磷）来研究其代谢过程。该方法是在先前对离体玉米叶片中甲酯嘧磺隆代谢研究的基础上改进而来的15，因为此前尚未有报道将离体叶片测定法用于双子叶植物的除草剂代谢研究。有机磷杀虫剂马拉硫磷常被用于体内和体外除草剂代谢研究中，以指示P450酶的参与16。例如，玉米对硝磺草酮的耐受性及其快速代谢归因于P450催化的环羟基化反应，当马拉硫磷增加玉米对硝磺草酮的敏感性时，这一机制得到了验证17。类似地，马拉硫磷抑制了离体玉米叶片中ALS抑制剂甲酯嘧磺隆的代谢15。离体叶片技术的一个主要优势在于，所获得的数据不受整株植物体内物质转运模式的影响，这在评估植物中系统性苗后除草剂的代谢时是一个重要考虑因素。因此，该方法可使代谢分析在单个处理过的叶片上进行定性和定量研究12。
一种营养繁殖克隆策略结合离体叶片实验方法，此前已在水麻中用于开展除草剂代谢研究12。由于水麻为异花授粉植物（雌雄异株），且雌雄异株的Amaranthus物种具有高度的遗传多样性9，该实验方案可确保在时间进程实验中分析遗传背景完全一致的水麻幼苗。本文展示了离体叶片法在测定双子叶杂草（水麻）中除草剂代谢速率方面的应用价值。通过非线性最小二乘回归分析，在每个时间点测定残留母体除草剂的含量（图1），并拟合为简单的一级动力学曲线，以估算吸收的除草剂降解50%所需的时间（DT50）。文中展示了反相高效液相色谱（RP-HPLC）的代表性色谱图，比较了ALS抗性与敏感型水麻种群在时间进程研究中母体除草剂的消失以及极性代谢产物的同步生成情况（图2）。本文的重点在于描述并展示离体叶片测定法结合营养繁殖克隆技术在测定双子叶植物中除草剂代谢速率方面的实用性与精确性、可重复性，采用均匀环标记（URL-14C）的除草剂，对三个在整株水平上对HPPD抑制剂和ALS抑制剂除草剂响应不同的水麻种群进行分析（表1）。
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方案
1. 植物材料、生长条件与营养繁殖
注意：本研究调查了三种水麻种群：MCR（来自伊利诺伊州麦克莱恩县）、ACR（来自伊利诺伊州亚当斯县）和 WCS（来自伊利诺伊州韦恩县）（表1）。
- 收集水hemp种子并将其悬浮于0.1 g L-1 琼脂：水溶液比例为 4 °C 至少30天以促进萌发。注意：某些水苋草种群具有休眠性，但此步骤有助于打破休眠，使种子萌发更加整齐一致。
- 萌发每个水麻种群的种子（如 表1在温室中，将植株移栽至含有栽培基质的12 cm × 12 cm育苗盘中。
- 保持温室条件为28/22 °C 16/8 小时光照周期内的昼夜温度12.
- 使用汞卤灯的光照补充温室内的自然光，以提供至少 500 µmol m-2 秒-1 植物冠层水平的光子通量。
- 当幼苗长至2 cm高时，将其移栽至80 cm3 温室中的盆栽
- 将幼苗移栽至950 cm3 将幼苗高4 cm时移栽至花盆中，花盆内装有按3:1:1:1比例混合的盆栽基质：土壤：泥炭：沙。每盆加入5 g缓释肥料颗粒，并与土壤混合均匀。
- 从7 cm高的植株上剪除包含三个最幼嫩叶片的茎尖分生组织，以消除顶端优势。
注意：此步骤可确保每株植物生长出足够数量的3 cm长腋芽用于克隆。 - 从每个水麻种群中，当幼苗高度约为14 cm时，切取五段腋芽枝条（长度为3 cm）（如 表1). 除去这些腋芽上的大部分叶片，以减少后续操作中的水分流失，但保留最幼嫩的两片叶，以便移栽后继续生长。
注意：去除叶片时需小心操作，避免损伤芽苗。用标牌为每株植物标记。 - 将腋芽移栽至80 cm3 将幼苗（每盆一株）移栽至育苗基质中，该基质与萌发时所用基质相同。移栽初期应使基质充分饱和，直至根系形成，随后保持基质持续湿润，并将盆置于生长室中培养7天，以促进根系 establishment。
注意：此时植物非常敏感，不应使其受到胁迫。- 保持培养室条件为 28/22 °C 16/8 小时光照周期内的昼夜温度12.
- 可结合使用白炽灯和荧光灯为生长室提供光照，且光照强度应至少达到 550 µmol m-2 秒-1 植物冠层水平的光子通量12.
- 再次移植到 950 cm3 当克隆植株长至4厘米高时，将其移栽至装有育苗基质：土壤：泥炭：沙（3:1:1:1）混合物的花盆中（每盆一株幼苗），并加入5 g缓释肥料颗粒，然后将花盆移回温室。
- 采用上述相同方法对植物进行第二次克隆即， 重复步骤1.5至1.8，然后进入步骤2.1。对于典型的时间进程研究，应从每个水麻草群体中至少六株独立植株生成克隆，并将其记录为MCR品系1-6，ACR1-6 和 WCS1-6.
- 建立至少六个不同的“亲本”克隆系，以重复实验并充分代表每个水麻种群内的遗传变异性。
- 根据需要分析的时间点数量，从每个“亲本”克隆系中制备足够数量的亚克隆，以进行时间序列研究。
2. 利用离体水麻叶片进行代谢研究
- 当克隆的水麻植株长至10至12厘米高时，取其第三幼嫩叶片（长度2至3厘米；包含0.5厘米的叶柄部分），用于除草剂代谢及DT50分析。
- 在水中对每株水麻植株的叶柄进行第二次切割（确保保留0.3厘米的叶柄），并将切好的末端放入1.5 ml塑料离心管中（每管一片叶）15。
注意：在水中进行第二次切割可防止气泡形成并堵塞木质部导管。- 首先，将切下的带柄叶片部分浸入预孵育缓冲液（200 µl）中，缓冲液为0.1 M Tris-HCl（pH 6），预孵育1小时。
- 其次，将每片叶片转移至新的含有孵育缓冲液（200 µl）的1.5 ml离心管中，缓冲液含0.1 M Tris-HCl（pH 6）和150 µM [URL-14C]除草剂，在28 °C下孵育1小时，以使除草剂被叶片吸收。
注意：在本研究中，使用了比活度约为20 mCi mmol-1的14C-硝磺草酮和14C-嘧磺隆甲酯。除草剂通过扩散和木质部蒸腾流的吸收共同决定每片叶的摄取量。
注意：可通过修改上述步骤2.2.1和2.2.2来测定代谢抑制剂对除草剂代谢的影响。在预孵育缓冲液中加入100 µM抑制剂，孵育2小时，然后转移至含除草剂的孵育缓冲液，并再次加入100 µM抑制剂。例如，马拉硫磷和特克氯酸可抑制植物中某些细胞色素P450的活性15-17。 - 用去离子水清洗浸没过的叶片部分，并将切下的叶片分别转移至四分之一强度的Murashige和Skoog（MS）盐溶液（500 µl）中，在培养室中分别孵育0小时、5小时、11小时、23小时或35小时，进行时间进程代谢研究。
- 在相应时间点取出叶片，从孵育液中收获，并使用聚丙烯管（15 ml）和玻璃研钵在液氮中手动研磨每片叶组织。
- 在上述相同的聚丙烯管中，使用7 ml 90%丙酮和实验室组织匀浆器从每片叶中提取放射性标记的除草剂及其代谢物。用额外的7 ml 90%丙酮冲洗组织匀浆器，并继续匀浆直至组织完全粉碎（通常约2分钟）。注意：90%丙酮可用于从植物组织中提取大多数除草剂。然而，如果该方法无法提取吸收的放射性化合物中超过90%的部分，则可用90%甲醇或90%乙腈替代作为提取溶剂。
- 标记丙酮提取液（总体积14 ml），并在-4 °C下保存16小时，以促进进一步提取。
注意：在对处理过的叶片进行此提取后，可提取的放射性通常至少占处理叶片吸收的放射性标记化合物的98%。在我们之前的研究中12，所有时间点切下叶片中的不可提取放射性（结合残留物）平均仅为0.3%，但该数值可能因所用除草剂和检测时间点的不同而有所变化。 - 在5,000 × g下离心样品10分钟，并在40 °C下使用旋转蒸发仪浓缩上清液，直至终体积为0.5 ml。将该体积转移至2.0 ml塑料离心管中。
- 加入乙腈:水（1:1，体积比），将植物提取物的终体积调至1.25 ml，并在10,000 × g下重新离心10分钟，以去除任何颗粒物。
- 通过液体闪烁光谱法（LSS）12测定各样品等分试样中的总放射性（dpm µl-1），并标准化用于高效液相色谱（HPLC）分析的[14C标记]化合物注入量（例如，每个样品/每次运行10,000 dpm），以便在绘制结果时各样品的y轴保持一致。
3. 离体叶片中除草剂代谢的高效液相色谱分析
注意：使用以下反相高效液相色谱（RP-HPLC）条件12将总可提取放射性物质分离为母体除草剂及其代谢物。
- 对大多数非极性除草剂，使用C18色谱柱（4.6 × 250 mm，5 µm粒径，用于分析型HPLC）进行反相高效液相色谱（RP-HPLC），流速为1 ml min-1。
注意：也可使用C4或C12反相高效液相色谱柱，以优化母体除草剂与其代谢物的分离效果。可使用预柱过滤器和/或保护柱，以保护反相色谱柱并延长其使用寿命。- RP-HPLC所用流动相如下：流动相A为含0.1%甲酸（v/v）的水溶液，流动相B为100% HPLC级乙腈。
注意：HPLC级甲醇也可作为流动相B用于分离极性更强的化合物及其代谢物，但需注意保留时间可能随之改变。
注意：在本研究中12，用于分离甲基磺草酮或甲嘧磺隆与其极性代谢物的洗脱程序如下：第一步，线性梯度从A:B（4:1，v/v）变为A:B（3:2，v/v），持续12分钟；第二步，线性梯度从A:B（3:2，v/v）变为A:B（3:7，v/v），持续5分钟；第三步，线性梯度从A:B（3:7，v/v）变为A:B（1:9，v/v），持续2分钟（总时长19分钟）。
注意：为优化分离效果，梯度洗脱和等度洗脱步骤可能需要根据母体化合物的物理性质进行调整。 - 在上述线性梯度步骤后，继续采用线性梯度从A:B（1:9，v/v）变为A:B（4:1，v/v）（3分钟），随后以A:B（4:1，v/v）等度洗脱（至少2分钟），以在注入下一个提取物前重新平衡反相色谱柱12。
- RP-HPLC所用流动相如下：流动相A为含0.1%甲酸（v/v）的水溶液，流动相B为100% HPLC级乙腈。
- 使用流动闪烁分析仪检测并可视化放射性标记化合物。根据流动闪烁分析仪的制造商说明，记录每个样品中母体除草剂残留量占该样品总放射性计数的百分比，以确定在不同时间点下各个水苋草群体中除草剂的代谢速率。
4. 统计学方法
- 采用完全随机设计（或其他适合统计分析的排列方式）安排处理组。
- 每种处理进行两次独立实验，每次实验包含三个生物学重复，两次独立实验共包含六个生物学重复。如果实验效应无显著性（α = 0.05），则合并并分析来自各独立实验的数据；如果实验效应具有显著性，则分别分析每次实验的数据。
注意：将前三个生物学重复纳入实验1，后三个生物学重复纳入实验2。每个生物学重复代表来自各群体（MCR1-6、ACR1-6 和 WCS1-6）的一个独立“亲本”克隆系，以确保每个时间过程分析所用植株在遗传上一致。两次独立实验共包含六个生物学重复，足以充分代表遗传变异，并确定每个水麻种群的中位 DT50 值。 - 采用非线性最小二乘回归分析数据，并用简单的单一级数曲线进行拟合，以估算 DT50 值。以下方程描述该模型：
- 在此模型中，y 表示在时间 t 时残留的母体除草剂百分比，µi 表示每个水麻种群 i 的 DT50，参数 C0 表示在 t = 0 时母体除草剂的估计含量12。
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结果
在WCS或ACR与MCR之间，检测到玉米对甲基磺草酮的代谢速率存在显著差异 (图1）。在每个时间点，MCR 对甲基磺草酮的代谢速度均快于两个对甲基磺草酮敏感的群体 WCS 和 ACR，这与先前的整株植物表型反应结果一致11通过从每个种群的单个亲本植株克隆足够数量的植株，由于每个时间进程内遗传变异性的缺失，除草剂代谢时间进程分析具有均一性和可重复性。12例如，克隆系5中甲基磺草酮代谢的时间进程12 显示在 图1总共分析了每个种群的六个不同克隆系，这些克隆系来源于六个独立的亲本植株（表1) 以确定总体中位数 DT50 值，表明MCR中硝磺草酮的代谢显著更快（即， 具有较短的DT50 （数值）高于 ACR 或 WCS12此外，我们之前对离体叶片的研究表明，P450抑制剂显著降低了MCR和玉米中甲基磺草酮的代谢，但在ACR中未见此效应；在MCR中检测到的主要初始代...
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讨论
本文所述的离体叶片法先前已被用于研究玉米叶片中嘧草醚的代谢过程15，但我们的结果表明，该方案同样适用于双子叶杂草物种中除草剂代谢的测定，且具有高效性、准确性和可重复性12。与整株植物研究相比，离体叶片技术的一个主要优势在于，离体叶片不受出土后内吸性除草剂在整株植物体内转运模式的影响，也避免了不同植株或种群间除草剂吸收差异的问题。此外，由于离体叶片实验在生长箱中进行，每支试管中仅放置一片叶片，相较于在温室条件下培养整株植物，环境变异性显著降低。在研究MCR中甲基磺草酮抗性机制时12，我们的方法还引入了营养繁殖克隆策略，以最大限度地减少Amaranthus种群内及种群间存在的高度遗传变异9。Amaranthus杂草种群内部的遗传多样性，已通过其对多种出土后除草剂家族的整株植物反应中所记录的变异程度得以证实18。在开展时间序列研究以准确测定DT50值，并比较不同水苋草种群间DT50值的显著差异时12，这些步骤（如本离体叶片与营养克隆方...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Wendy Zhang、Austin Tom、Jacquie Janney、Erin Lemley和Brittany Janney在植物培养和提取方面的协助，感谢Anatoli Lygin博士在色谱分析方面的帮助，以及感谢先正达作物保护公司提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂 | Sigma-Aldrich | A1296 | 用于种子预萌发 |
| 育苗基质 | Sun Gro Horticulture | 49040233 | 用于植物生长 |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | 缓释肥料 |
| 生长室 E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | 植物培养 |
| Tris 碱 | Fisher Scientific | BP152-500 | 离体叶片缓冲液 |
| HCl（浓） | Fisher Scientific | A144500 | 调节缓冲液 pH |
| Murashige 和 Skoog（MS）盐 | Sigma-Aldrich | M0404 | 离体叶片孵育 |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A452-4 | 孵育后叶片清洗 |
| 丙酮 | Sigma-Aldrich | 179124 | 植物提取 |
| 乙腈（HPLC 级） | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC 流动相 |
| 甲酸 | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | 调节流动相酸度 |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5417R | 适用于 1.5 或 2.0 ml 管 |
| 离心机（温控型） | Eppendorf | 5810R | 适用于 15 或 50 ml 管 |
| 聚丙烯离心管 | Corning Inc. | 430790 | 15 ml，无菌 |
| 旋转蒸发仪 | BÜCHI | R200 | 浓缩植物样品 |
| 液体闪烁光谱法（LSS） | Packard Instruments | 104470 | 定量 14C |
| 高效液相色谱 | Perkin Elmer | N2910401 | 分离除草剂代谢物 |
| 流动闪烁分析仪 | LabLogic System | 1103303 | 用于 14C 的 HPLC 分析 |
| Hypersil Gold C18 色谱柱 | Thermo-Scientific | 03-050-522 | 反相色谱 |
| Ultima-Flo M 混合液 | Perkin Elmer | 6013579 | 用于流动闪烁分析仪 |
| 闪烁混合液（ScintiVerse BD） | Fisher Scientific | SX18 | 用于 LSS；可生物降解 |
| 实验室匀浆机 | Kinematica | CH-6010 | 匀浆处理叶片样品 |
参考文献
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