利用离体叶片测定法测量双子叶杂草中除草剂代谢速率

摘要

本手稿描述了如何利用双子叶杂草的离体叶片有效量化除草剂代谢速率，从而降低变异性，并消除在整株植物测定中通常观察到的除草剂吸收或转运可能带来的混杂效应。

摘要

为了分离并准确测定一种严格异花授粉的双子叶杂草——水麻（Amaranthus tuberculatus）中除草剂的代谢速率，我们开发了一种离体叶片检测方法，并结合营养繁殖克隆策略，以标准化除草剂吸收，并消除在抗除草剂（R）和敏感型（S）水麻种群中除草剂转运对结果的干扰因素。植物体内有机农药的生物动力学分析通常包括对吸收、转运（向作用靶点的递送）、代谢归宿以及与靶点相互作用的测定。除草剂代谢是评估抗除草剂杂草和耐除草剂作物的重要参数，通常通过使用放射性标记除草剂的整株植物试验来完成。然而，解释来自整株植物方法所得生物动力学参数时存在一个难点：除草剂的代谢速率常常影响其转运过程，因为在除草剂解毒反应后生成的极性代谢产物通常在植物体内不具备移动性。本文所述实验方案的优势包括：可重复、准确且快速地测定R和S种群中除草剂的降解速率；显著减少放射性标记除草剂的用量；大幅降低需要后续处理和处置的放射性植物材料量；以及能够在实验室或人工气候室中开展放射性标记除草剂实验，而无需依赖温室条件。随着除草剂抗性在全球范围内双子叶杂草种群中持续发展和扩散，本文所建立和描述的离体叶片检测方法将为研究因除草剂代谢和解毒能力增强所导致的非靶标位点抗性提供一种极为宝贵的技术手段。

引言

杂草对除草剂的抗性对全球粮食和纤维的生产构成了严重威胁^1,2。目前，全球已有记录并研究了来自一百多种杂草物种的数千个抗性种群和生物型³。植物中赋予除草剂抗性的一个主要机制是除草剂靶标位点基因和蛋白质的改变，包括影响除草剂-蛋白质结合动力学的基因突变或靶标位点基因的扩增²。通过细胞色素P450单加氧酶（P450）或谷胱甘肽S-转移酶（GST）酶活性升高介导的代谢解毒是杂草中赋予除草剂抗性的另一机制，该机制在多个方面与基于靶标位点的抗性机制不同²。基于代谢的抗性机制是否会导致植物适合度代价（亦称 适合度惩罚），以及单一解毒机制是否可能使杂草种群产生交叉或多重除草剂抗性，均具有重要意义^1,2,4。通常，植物中的除草剂代谢可分为三个明确的阶段⁵。第一阶段涉及除草剂的转化或活化，例如由P450介导的芳香环或烷基的羟基化，或通过N-或O-去烷基化反应，从而增加分子极性并实现部分除草剂解毒^5,6。第一阶段引入的新官能团可为第二阶段的结合反应提供位点，例如由GST催化与还原型谷胱甘肽结合，或由UDP依赖性糖基转移酶催化与葡萄糖结合^5,7。例如，甲基嘧磺隆在玉米中的主要初始代谢产物为羟基甲基嘧磺隆⁸，其可进一步代谢为羟基甲基嘧磺隆-葡萄糖苷（第二阶段），随后被转运至液泡中进行长期储存....

方案

1. 植物材料、生长条件与营养繁殖

注意：本研究调查了三种水麻种群：MCR（来自伊利诺伊州麦克莱恩县）、ACR（来自伊利诺伊州亚当斯县）和 WCS（来自伊利诺伊州韦恩县）（表1）。

1. 收集水hemp种子并将其悬浮于0.1 g L^-1 琼脂：水溶液比例为 4 °C 至少30天以促进萌发。注意：某些水苋草种群具有休眠性，但此步骤有助于打破休眠，使种子萌发更加整齐一致。
2. 萌发每个水麻种群的种子（如 表1在温室中，将植株移栽至含有栽培基质的12 cm × 12 cm育苗盘中。
   1. 保持温室条件为28/22 °C 16/8 小时光照周期内的昼夜温度¹².
   2. 使用汞卤灯的光照补充温室内的自然光，以提供至少 500 µmol m^-2 秒^-1 植物冠层水平的光子通量。
3. 当幼苗长至2 cm高时，将其移栽至80 cm³ 温室中的盆栽
4. 将幼苗移栽至950 cm³ 将幼苗高4 cm时移栽至花盆中，花盆内装有按3:1:1:1比例混合的盆栽基质：土壤：泥炭：沙。每盆加入5 g缓释肥料颗粒，并与土壤混合均匀。
5. 从7 cm高的植株上剪除包含三个....

结果

在WCS或ACR与MCR之间，检测到玉米对甲基磺草酮的代谢速率存在显著差异 (图1）。在每个时间点，MCR 对甲基磺草酮的代谢速度均快于两个对甲基磺草酮敏感的群体 WCS 和 ACR，这与先前的整株植物表型反应结果一致¹¹通过从每个种群的单个亲本植株克隆足够数量的植株，由于每个时间进程内遗传变异性的缺失，除草剂代谢时间进程分析具有均一性和可重复性。¹²例如，克隆系5中甲基磺草酮代谢的时间进程¹² 显示在 图1总共分析了每个种群的六个不同克隆系，这些克隆系来源于六个独立的亲本植株（表1) 以确定总体中位数 DT₅₀ 值，表明MCR中硝磺草酮的代谢显著更快（即， 具有较短的DT₅₀ （数值）高于 ACR 或 WCS¹²此外，我们之前对离体叶片的研究表明，P450抑制剂显著降低了MCR和玉米中甲基磺草酮的代谢，但在ACR中未见此效应；在MCR中检测到的主要初始代.......

讨论

本文所述的离体叶片法先前已被用于研究玉米叶片中嘧草醚的代谢过程¹⁵，但我们的结果表明，该方案同样适用于双子叶杂草物种中除草剂代谢的测定，且具有高效性、准确性和可重复性¹²。与整株植物研究相比，离体叶片技术的一个主要优势在于，离体叶片不受出土后内吸性除草剂在整株植物体内转运模式的影响，也避免了不同植株或种群间除草剂吸收差异的问题。此外，由于离体叶片实验在生长箱中进行，每支试管中仅放置一片叶片，相较于在温室条件下培养整株植物，环境变异性显著降低。在研究MCR中甲基磺草酮抗性机制时¹²，我们的方法还引入了营养繁殖克隆策略，以最大限度地减少Amaranthus种群内及种群间存在的高度遗传变异⁹。Amaranthus杂草种群内部的遗传多样性，已通过其对多种出土后除草剂家族的整株植物反应中所记录的变异程度得以证实¹⁸。在开展时间序列研究以准确测定DT₅₀值，并比较不同水苋草种群间DT₅₀值的显著差异时¹²，这些步骤（如本离体叶片与营养克隆方.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Sigma-Aldrich	A1296	用于种子预萌发
育苗基质	Sun Gro Horticulture	49040233	用于植物生长
Nutricote	Agrivert	TOTAL BLEND 13-13-13 T100	缓释肥料
生长室 E15	Controlled Environments Limited	20207	植物培养
Tris 碱	Fisher Scientific	BP152-500	离体叶片缓冲液
HCl（浓）	Fisher Scientific	A144500	调节缓冲液 pH
Murashige 和 Skoog（MS）盐	Sigma-Aldrich	M0404	离体叶片孵育
甲醇	Fisher Scientific	A452-4	孵育后叶片清洗
丙酮	Sigma-Aldrich	179124	植物提取
乙腈（HPLC 级）	Macron Fine Chemicals	MKH07610	HPLC 流动相
甲酸	Mallinckrodt Analytical	MK259205	调节流动相酸度
微量离心机	Eppendorf	5417R	适用于 1.5 或 2.0 ml 管
离心机（温控型）	Eppendorf	5810R	适用于 15 或 50 ml 管
聚丙烯离心管	Corning Inc.	430790	15 ml，无菌
旋转蒸发仪	BÜCHI	R200	浓缩植物样品
液体闪烁光谱法（LSS）	Packard Instruments	104470	定量 14C
高效液相色谱	Perkin Elmer	N2910401	分离除草剂代谢物
流动闪烁分析仪	LabLogic System	1103303	用于 14C 的 HPLC 分析
Hypersil Gold C18 色谱柱	Thermo-Scientific	03-050-522	反相色谱
Ultima-Flo M 混合液	Perkin Elmer	6013579	用于流动闪烁分析仪
闪烁混合液（ScintiVerse BD）	Fisher Scientific	SX18	用于 LSS；可生物降解
实验室匀浆机	Kinematica	CH-6010	匀浆处理叶片样品