我们提出一种自动化、模块化的高通量方法，用于小规模微生物胞外多糖的鉴定与表征。该方法结合快速初筛以分析分泌多糖的总量，以及详细的碳水化合物指纹图谱分析，从而实现对新分离细菌菌株或完整菌株库的快速筛选。
本文内容
摘要
摘要
许多微生物能够产生并分泌胞外多糖（EPS），这些物质在医学领域、食品应用或替代石油基化学品方面具有重要意义。本文描述了一种可在液体处理系统上自动化的分析平台，能够快速、可靠地分析微生物所产生的EPS类型及其产量。该平台使研究人员能够在高通量（HT）条件下，于一天之内识别新型天然微生物胞外多糖生产者，并分析相应聚合物的碳水化合物指纹图谱。利用该平台，可对菌株保藏库以及通过工程手段获得的菌株变异文库进行筛选。该平台采用模块化设计，可将实验流程分为两个主要部分。第一部分为自动化筛选系统，整合了多种多糖检测模块：通过离心步骤实现黏度形成的半定量分析、通过乙醇沉淀法分析聚合物形成情况，以及通过苯酚-硫酸法测定总碳水化合物含量。该系统单次运行可筛选多达384个菌株。第二部分则针对第一部分筛选出的阳性EPS生产菌株，进行详细的单糖组成分析，包含两个关键模块：利用超高效液相色谱串联紫外检测及电喷雾电离离子阱质谱（UHPLC-UV-ESI-MS）分析单体完整组成，以及通过与显色反应偶联的酶法氧化测定丙酮酸（作为聚合物取代基，即丙酮酸缩酮的存在）含量。该筛选平台的所有分析模块均可灵活组合，并可根据具体需求进行调整。此外，所有模块既可手动操作，也可由液体处理系统完成。因此，该平台具备高度灵活性，可用于识别多种类型的胞外多糖。
引言
微生物胞外多糖（EPS）是一类结构高度多样的聚合物，具有多种生物学功能。它们通常由复杂的重复单元构成，这些重复单元在单体类型（糖、糖衍生物、糖酸）、单体之间的连接方式及其取代基方面各不相同。微生物多糖的结构多样性赋予了这类分子不同的理化特性，使其可应用于食品1、化妆品2,3、建筑化学4或水处理5等多个领域。为了进一步拓展这些生物来源且可持续的聚合物的应用范围，发现新的天然微生物多糖以及构建结构改造的多糖变体是极具前景的研究方向。无论采用哪种策略，都需要一种快速筛选方法，以高效检测大量微生物菌株的多糖生成能力，并分析其产物。因此，我们近期开发了一种基于96孔板的高通量筛选平台，可用于分析天然分离菌株或基因工程改造菌株所产生的微生物多糖，并可鉴定其单体组成6。
利用该平台对约500株天然分离株进行第一轮初筛，仅发现约10%至20%的分离菌株能够产生胞外多糖（EPS）（数据未显示）。这意味着在所采用的实验条件下，80%至90%的分析菌株不产生EPS，因此无需进一步分析其详细的碳水化合物指纹图谱。由于单体组成的高度精密鉴定过程耗时较长，尤其是数据分析部分，若能采用一种快速的初筛方法来鉴定出EPS阳性菌株，将显著提高整体效率。此外，还可减少超高效液相色谱-紫外-电喷雾电离质谱（UHPLC-UV-ESI-MS）所需的试剂、耗材和检测时间。同时，尽管该方法的多个分析模块在一方面保证了高度的可靠性，但在另一方面也使得同时手动处理两块以上的96孔板变得复杂，从而限制了该方法潜力的充分发挥。基于上述原因，我们决定开发一种自动化筛选平台。为此，我们将现有的碳水化合物指纹图谱技术的模块化格式，与一种基于吸光度测定的全自动快速总糖含量检测方法相结合。
苯酚-硫酸法仍是快速测定细菌和植物多糖总碳水化合物含量的首选方法7,8。该方法最初由 Dubois et al.9 描述，并已针对不同应用和样品量进行了优化，甚至可适用于96孔板的小规模检测10,11。苯酚-硫酸法通过一个数值来测定样品中总的碳水化合物含量，该数值综合了样品中所有单糖、寡糖和多糖形式的碳水化合物。
考虑到这些因素，选择合适的培养基对于应用该方法至关重要。应严格避免使用含有寡聚或多聚碳水化合物化合物（如酵母提取物）的复杂培养基，因为它们可能导致聚合物含量发生改变。此外，菌株培养过程中需使用大量糖类作为碳源。培养过程中残留的高水平碳水化合物可能会对胞外多糖（EPS）含量的测定产生不利干扰。
因此，建议使用明确且纯净的糖类。在本实验中，我们采用葡萄糖进行细胞培养。培养后剩余的葡萄糖通过凝胶过滤法去除，并通过葡萄糖检测试剂盒进行定量。最终，多糖的葡萄糖当量通过从苯酚-硫酸法测得的总糖含量中减去凝胶过滤后剩余的葡萄糖量来计算。凝胶过滤法与葡萄糖检测联合苯酚-硫酸法可确保结果可靠，并有望成为我们首个完全自动化的检测系统。
在自动筛选平台中新增了两个分析模块，以增加EPS检测系统的信息量：沉淀现象的检测和黏度增加的观察。
多种不同的EPS — 例如 琥珀酰甘露聚糖、黄原胶和结肠酸12 据报道，在糖基的C4和C6位点上被修饰了非碳水化合物性质的丙酮酸缩酮。这些丙酮酸缩酮（与琥珀酸单酯和糖醛酸类似）可通过二价阳离子桥相互作用，赋予聚合物多阴离子特性，从而影响其物理性质。13为了鉴定这些特定的聚合物，建立了丙酮酸测定作为另一个附加的分析模块。这增加了关于多糖取代基及其潜在宏观特性的信息。
整合所有模块后，能够识别不同的胞外多糖（EPS），并快速高效地确定EPS生产菌株。通过该方法，筛选平台可分为两个主要部分（图1）。在自动化筛选（第一部分）中，整个工作流程完全自动化（表1），以快速预筛出产生EPS的菌株。碳水化合物指纹图谱分析（第二部分）则对预筛菌株所产生的EPS的单体组成进行定量测定。为此，数据处理步骤被最小化，以优化对大规模菌株库的筛选效率。该平台可在单次自动化筛选运行中分析384株菌，每天进行两次运行，即可实现每天分析768株菌。此外，碳水化合物指纹图谱分析还能提供所有已鉴定EPS更为详尽的整体信息，从而实现对与已知EPS化学结构仅有微小差异或完全新型的EPS变体进行定向分析与鉴定。
方案
1. 自动化筛选
注意：所有液体处理步骤均使用机器人液体处理系统完成。机器人工作台的组成如图2所示。所有耗材均存放在存储转盘中，除非另有说明。在所有自动化筛选步骤中，机器人机械臂（RM）将在转盘位置（CP）与工作台位置（WTP）之间转移耗材（深孔板（DWP）、微孔板（MTP）、聚合酶链式反应板（PCR板）等）。所有移液步骤均使用96通道移液臂完成，除非另有说明。所有步骤均已编程，并以96孔板格式自动执行。
- 菌株培养（任务1） 图1)
注意：在无菌条件下（使用层流罩）对接种疑似产EPS菌株及培养板的密封进行操作。自动化快速筛选每次可处理四个96孔板。已对多个属的不同菌株进行了测试6.- 使用96针复制器从96孔甘油保存板中手动接种预培养物（DWP中含1 ml EPS培养基）。用透气密封膜覆盖培养板，以防止蒸发并保证通气。在MTP摇床上，30 °C、1,000 rpm条件下孵育48小时。
- 在深孔板（DWP）中加入990 µl EPS培养基作为主培养，使用50 µl 12通道多道移液器转移10 µl预培养液进行接种，并在与预培养相同的条件下培养。记录所有未生长的菌株。
- 机器人工作台与储存转盘的准备
- 将材料与设备列表中的所有耗材放置到存储转盘的正确位置。加入 990 µl 双蒸水（ddH2在DWP的每个孔中加入用于葡萄糖检测的1:100稀释液（转盘位置4-1至4-4）。
- 准备一个250 ml的槽，其中装有150 ml的ddH₂O2O 在工作台位置 (WTP) 11。
- 加入一个250 ml的槽中，内含50 ml葡萄糖检测试剂混合液（4 ml 500 mM磷酸钾缓冲液（pH 5.7）、1.5 ml 50 mM 2,2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、2 ml 100 U葡萄糖氧化酶、10 µl 1,000 U辣根过氧化物酶和42.49 ml ddH₂O）2O) 在 WTP 1-2 位置。
- 在 WTP 3-1 和 3-2 位置放置两个空的假 F-底 MTP。
- 移除透气密封膜，将主培养物分配至转盘位置（CP）1-1 到 1-4，并启动自动机器人程序。
- 凝胶过滤板的平衡
注意：筛选过程中使用的凝胶过滤板可重复使用。重复使用时，每次用 150 µl 去离子水洗涤并离心，重复洗涤和离心操作三次。2在20 °C、2,000 × g条件下离心2分钟。随后，加入75 µl 20%乙醇，用硅胶盖板密封，于4 °C保存。- 将装有 5 mM 醋酸铵缓冲液（pH 5.6）的 250 ml 槽（CP 5-7）移至 WTP 3-3。
- 将凝胶过滤板（CP 1-6、1-7、2-6 和 2-7）从转盘转移至 WTP 4-1 至 4-4。
- 使用200 µl吸头吸取150 µl醋酸铵缓冲液，加入所有凝胶过滤板的中心位置以进行平衡。
- 将凝胶过滤板放入离心机中（2,000 × g，20 °C，离心2 min）。
- 将平板转移回工作台，重复步骤1.3.3、1.3.4和1.3.3。不要重复离心步骤，以避免凝胶过滤平板脱水。将平衡后的凝胶过滤平板放回样品架中。
- 通过离心去除细胞（任务1） 图1)
注意：为了确保筛选方法的背景信号较低，仅分析含有细胞外多糖的上清液，并在培养后通过离心去除细胞。- 将主培养液（DWP）从转盘（1-1 至 1-4）转移至离心机中（4,300 × g，20 °C，离心 30 分钟）。
- 通过RM准备工作台以处理主培养物。
注意：在步骤 1.4.2 至 1.4.3.5 中，系统始终同时处理两块板，然后对接下来的两块板重复所有步骤。- 将过滤前的沉淀物从 CP 6-1 和 6-2 的 MTP 转移至 WTP 4-1 和 5-1。将 pH 指示剂 MTP 从 CP 7-1 和 7-2 转移至 WTP 4-2 和 5-2。
- 将过滤板连同收集板从 CP 2-1 和 2-2 转移至 WTP 4-3 和 5-3。将主培养深孔板 DWP 1-1 和 1-2 从离心机转移至 WTP 4-4 和 5-4。
- 准备分析模块。
注意：从吸头储存区（位置 2-1 至 2-4）取用 200 µl 吸头。为减少耗材使用，在步骤 1.4.3.1 中使用同一套吸头。- 将180 µl主培养上清液转移至过滤板中。从主培养上清液中吸取150 µl，其中50 µl加入MTP中用于过滤前沉淀，100 µl加入pH指示剂板中。
注意：pH 测定并非必需；然而，在每个孔中加入 12.5 ml 甲基红指示剂（50 mg 溶于 50 ml 乙醇）后，可通过多通道移液器进行操作，以指示产酸能力强的菌株。该信息可用于避免后续培养过程中因低 pH 导致的生长抑制， 例如 进行第二次筛选时需使用更高浓度的缓冲液。此外，低pH值还可能诱导EPS的产生，以保护细胞免受酸性环境的影响。 - 对第二个主培养板重复步骤1.4.3.1，使用新的枪头套装。
- 将过滤板转移至离心机，并将工作台上的所有其他板放回旋转架中的原始位置。
- 重复步骤 1.4.2.1 至 1.4.3.3，用于第三和第四个主培养板。
- 记录那些在主培养板离心后重新放回转盘时（黏度控制）沉淀减少的发酵液。
- 将180 µl主培养上清液转移至过滤板中。从主培养上清液中吸取150 µl，其中50 µl加入MTP中用于过滤前沉淀，100 µl加入pH指示剂板中。
- 96孔过滤法完全去除细胞（任务2） 图1)
注意：为了确保从黏稠的发酵液中完全去除细胞，筛选过程中包含一个过滤步骤。- 在20 °C下，以3,000 × g离心过滤板10分钟，并将其返回至载体上的初始位置。
- 制备凝胶过滤板。
- 将平衡后的凝胶过滤板从转盘转移到离心机中，在20 °C下以1,000 x g离心2 min。
- 将凝胶过滤板从离心机转移至 WTP 4-1 至 44。
- 将新鲜的凝胶过滤收集板从 CP（3-1 至 3-4）转移至 WTP（5-1 至 5-4）。
- 将平衡后的凝胶过滤板（WTP 4-1 至 4-4）转移至新的收集板（5-1 至 5-4）。
- 清理工作台，仅保留位置 5-1 和 5-2，并将位置 5-1 移至位置 4-1。
- 通过风险管理（RM）准备工作台以处理滤液。
注意：在步骤1.5.3至1.6.3.5中，系统将同时处理两块板，并对接下来的两块板重复所有步骤。- 将 50 µl 吸头从转盘（4-6 和 4-7）移至 WTP 3-3 和 3-4。
- 将过滤板从 CP 3-1 和 3-2 转移至工作台（4-4 和 5-4）。
- 将DWP（1:100稀释）从CP 4-1和4-2转移至WTP 4-2和5-1，用于检测葡萄糖消耗。
- 将CP 8-1和8-2过滤后的第二次沉淀MTP转移至WTP 4-3和5-3。
- 将过滤板从收集板（WTP 4-4 和 5-4）上取下，转移至 WTP 3-1 和 3-2。
- 过滤后制备分析模块。为了减少耗材使用，步骤1.5.4.1和1.5.4.3使用同一套移液头。
- 取50 µl吸头，移取10 µl滤液至DWP中（1:100稀释），用于葡萄糖检测（葡萄糖消耗量测定）。
- 将35 µl滤液移液至平衡好的凝胶过滤板中央，将50 µl移液至用于沉淀的MTP。
- 重复步骤 1.5.4.1 至 1.5.4.2，对第二个过滤板进行相同操作。
- 将凝胶过滤板转移至离心机，并将工作台上的其他所有板移回旋转架中的原始位置。
- 重复步骤 1.5.3.1 至 1.5.4.4，对第三和第四张滤膜板进行相同操作。
- 将所有板放回转盘后，注意观察滤板中残留物提示的高黏性上清液（过滤步骤后的高黏度对照）。若无滤液，可能导致后续分析模块出现假阴性结果。
- 通过96孔凝胶过滤法去除葡萄糖（任务3） 图1)
- 在20 °C下，以1,000 × g离心凝胶过滤板2分钟。
- 通过机器人操作臂准备工作台以处理凝胶滤过液。
- 从转盘（5-3 和 5-4）向 WTP 3-3 和 3-4 提供 50 µl 吸头。
- 为测定凝胶过滤后剩余的葡萄糖，将两个MTP从CP 9-1和9-2转移至WTP 4-1和5-1。
- 对于苯酚-硫酸法，将两个MTP从CP 8-5和8-6转移至WTP 4-2和5-2。
- 将两块凝胶过滤板从离心机转移至WTP（4-3和5-3）。
- 将凝胶过滤板从收集板（4-3 和 5-3）上取下，转移至 WTP 3-1 和 3-2。
- 通过机器人操作臂准备工作台以处理凝胶滤过液。
注意：为了减少耗材的使用，步骤1.6.3.1和1.6.3.2应使用同一套移液器吸头。- 为检测凝胶过滤后（1:10稀释）残留的葡萄糖，取50 µl枪头，移取25 µl ddH₂O2O（WTP 1-1）转移至新的MTP。吸取20 µl ddH₂O2O（WTP 1-1），加入5 µl空气和5 µl凝胶滤液，并分配至同一块板中。
- 采用苯酚-硫酸法，将20 µl凝胶滤液用移液器加入微孔板（MTP）中。
- 对第二个凝胶滤过板重复步骤 1.6.3.1 和 1.6.3.2。
- 将所有培养皿从工作台移回其转盘中的原始位置。
- 重复步骤 1.6.2.1 至 1.6.3.4，对第三和第四块凝胶过滤板进行相同操作。
- 葡萄糖检测模块
- 通过机器人机械臂准备工作台以执行葡萄糖检测。
- 将DWP（1:100稀释）从CP 4-1和4-4转移至WTP 5-1和5-4。
- 将所有MTP从CP 9-5和9-8转移至WTP 4-1和4-4。
- 取200 µl枪头，通过吸取和排出180 µl液体十次来混匀稀释液。然后将50 µl分装液转移至MTP。
- 对全部四个 DWP 重复执行步骤 1.7.1.2 和 1.7.1.3（1:100 稀释）。
- 从工作台上移除所有DWP（5-1至5-4）。
- 准备实验台以开始葡萄糖检测。
- 为测定凝胶过滤转移后剩余的葡萄糖，将所有MTP从CP（9-1至9-4）转移至WTP（5-1至5-4）。
- 将葡萄糖检测校准板（包含以下葡萄糖浓度各50 µl，每种浓度三个重复：90、45、18、9、4.5、1.8、0.9、0.45 和 0 mg/L）从 CP 9-9 转移至 WTP 3-3。
- 取200 µl吸头，从WTP 1-2中吸取50 µl葡萄糖检测试剂混合液，以开始第一项检测。将MTP放入培养箱中（30 °C、150 rpm，孵育30分钟）。
- 设置时间程序，使各板之间间隔5分钟开始运行。
- 孵育30分钟后，将培养板从培养箱转移至MTP读板仪，测定418 nm和480 nm处的吸光度。
- 测量结束后，将培养板移回转盘中的初始位置。
- 通过机器人机械臂准备工作台以执行葡萄糖检测。
- 沉淀的制备
注意：为了评估EPS的产生情况，需在第一次过滤步骤前后，用2-丙醇对上清液进行沉淀。此外，通过观察第一次沉淀中有而第二次沉淀中无的纤维和碎片，来评估聚合物在滤膜上的吸附情况。
注意：2-丙醇应作为易燃液体在通风橱内严格操作。- 从转盘中取出所有沉淀板（CP 6-1 至 6-4 和 8-1 至 8-4），并使用 12.5 ml 多通道移液器手动向每孔加入 150 µl 2-丙醇。
- 用硅胶盖板覆盖所有MTP，并在室温（RT）下振荡（900 rpm，10分钟）。振荡后观察是否有纤维或片状物形成，以判断是否存在EPS产生。
- 苯酚-硫酸法
注意：浓硫酸和苯酚需在通风橱中操作。苯酚具有腐蚀性且为致突变剂。- 对于苯酚-硫酸法，将微孔板（CP 8-5 至 8-8）从转盘中取出，并放入液体处理系统（位置 4 至 8）。同时加入含有不同葡萄糖浓度（10；5；2.5；1；0.5；0.25；0.1；0.05；0 g/L）的校准板，每种浓度设三个复孔，每孔体积为 20 µl。
- 在位置1放置一个废液容器，位置2放置一个200 µl吸头盒，位置3放置一个250 ml试剂槽，内含110 ml苯酚-硫酸溶液（在冰上 freshly prepared，含18.3 ml 5% (w/v) 苯酚的ddH₂O溶液）2O 和 91.7 ml 浓硫酸）置于位置 3。
- 使用八通道移液器配合300 µl吸头，向所有板的每行孔中各加入180 µl苯酚-硫酸溶液。
- 用盖子盖好所有MTP，通过振荡混合（900 rpm，5分钟，室温），然后在烘箱中80 °C孵育35分钟以进行显色反应。在通风橱中冷却后，于480 nm处测定吸光度。
- 选择EPS阳性上清液（任务4） 图1)
- 为评估EPS的产生情况，从自动筛选结果中选择至少满足以下三项标准中两项的菌株作为阳性菌株（黏度对照2.6.1和2.6.2、聚合物检测2.6.3、葡萄糖当量2.6.5）。将阳性结果对应的剩余滤液转移至新的MTP中，用于后续处理。
注意：当培养板用铝制封膜覆盖后，可在 -20 °C 下保存至少一周。在此期间内需完成碳水化合物指纹图谱的测定。
- 为评估EPS的产生情况，从自动筛选结果中选择至少满足以下三项标准中两项的菌株作为阳性菌株（黏度对照2.6.1和2.6.2、聚合物检测2.6.3、葡萄糖当量2.6.5）。将阳性结果对应的剩余滤液转移至新的MTP中，用于后续处理。
2. 碳水化合物指纹图谱
注意：碳水化合物指纹图谱的所有步骤均为手动操作。
- 阳性上清液的凝胶过滤（图1中的任务5）
注意：由于自动化筛选后无滤液残留，因此必须进行凝胶过滤。当上样体积超过35 µl时，纯化效率会降低。- 使用12.5 ml多通道移液器，向凝胶过滤板的所有孔中加入150 µl乙酸铵缓冲液，以完成平衡。
- 将凝胶过滤板放入离心机中，在20 °C下以2,000 × g离心2分钟。
- 重复步骤2.1.1、2.1.2，再重复一次2.1.1。在进一步使用前，将凝胶过滤板在20 °C下以1,000 × g离心2分钟。
- 使用12通道50 µl移液器，将35 µl滤液加至凝胶过滤板的中心孔。
- 将凝胶过滤板在20 °C下以1,000 × g离心2分钟，然后将其从收集板中取出。
- 水解前准备葡萄糖测定：使用12通道50 µl移液器加入45 µl ddH2O和5 µl凝胶滤液，进行1:10稀释，并用硅胶盖膜密封MTP板。
注意：为准确测定聚合物的葡萄糖含量，需测量水解前的葡萄糖含量，并从水解后的葡萄糖含量中减去该值。 - 水解前准备丙酮酸测定：使用12通道200 µl移液器加入95 µl ddH2O，将5 µl凝胶滤液转移至各孔，进行1:20稀释，并用硅胶盖膜密封MTP板。
- 96孔微量水解（图1中的任务6）
注意：使用前至少提前1.5小时将培养箱（含沙浴）预热至121 °C。已开发一种特殊夹紧装置，以避免小规模水解过程中的蒸发。- 取一个新的PCR板，使用12通道50 µl移液器转移20 µl凝胶滤液。
警告：三氟乙酸具有腐蚀性和毒性。氨溶液也具有腐蚀性。两种化学品均须在通风橱内操作。 - 使用1.25 ml多通道移液器向每孔加入20 µl 4 M三氟乙酸。然后用热塑性弹性体（TPE）盖膜覆盖PCR板，并将PCR板放入特殊夹紧装置中。
- 通过翻转夹紧装置十次混合溶液。将PCR板放入离心机中，以2,000 × g离心2分钟，使所有液体沉降至孔底。将PCR板放回夹紧装置，并用螺丝固定。
- 将固定好的夹紧装置放入预热的沙浴中，在121 °C下孵育90分钟。
- 从沙浴中取出夹紧装置，冷却至室温。
- 松开螺丝，再次在离心机中以2,000 × g离心2分钟，以收集所有冷凝液至孔底，并防止在移除盖膜时发生交叉污染。
- 使用12通道200 µl移液器加入3.2%氨溶液，调节pH至约8。用TPE盖膜覆盖PCR板，并借助夹紧装置手动振荡混合。
- 中和后，将PCR板在2,000 × g下离心2分钟。
- 取一个新的PCR板，使用12通道50 µl移液器转移20 µl凝胶滤液。
- 碳水化合物的高通量1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（HT-PMP）衍生化（图1中的任务7）
- 使用12通道50 µl移液器，将25 µl中和后的水解产物转移至新的PCR板中。
注意：取样后，使用1.25 ml多通道移液器向水解板中剩余液体加入12.5 µl酚红指示剂（0.05 g酚红溶于5 ml 20%乙醇），检测其是否中和完全。未变为粉红色（pH 8）的孔表示衍生化不完全。 - 加入75 µl衍生化试剂混合液（125 mg PMP，7 ml甲醇，3.06 ml ddH2O，438 µl 3.2%氨溶液），并用TPE盖膜覆盖板。
- 在夹紧装置中振荡PCR板后，以2,000 × g离心2分钟，使所有液体聚集于孔底。
- 为完成衍生化，将PCR板置于PCR仪中，在70 °C下反应100分钟，随后冷却至20 °C。
- 使用12通道50 µl移液器，将20 µl等分试样转移至新的MTP板。然后使用12通道200 µl移液器，向每列加入130 µl 19.23 mM乙酸溶液（0.962 ml 1 M乙酸 + 49.038 ml ddH2O）。通过反复吸打（至少六次）混合均匀，并将全部液体转移至带有MTP收集板的0.2 µm滤板中。
- 离心板（1,000 × g，5分钟），移除滤板，用硅胶盖膜密封MTP板，并将MTP板放入UHPLC-UV-ESI-MS中，用于测定碳水化合物指纹图谱14。
- 使用12通道50 µl移液器，将25 µl中和后的水解产物转移至新的PCR板中。
- 葡萄糖测定的准备
- 使用12通道50 µl移液器，加入45 µl ddH2O和5 µl中和后的水解产物，进行1:10稀释，并用硅胶盖膜覆盖MTP板。向用于校准的新MTP板中，每种浓度的葡萄糖标准品（500、250、100、50、25、10、5、2.5和0 µM）各加三份，每份50 µl。
- 使用12通道50 µl移液器加入50 µl葡萄糖测定试剂混合液（配方见步骤1.2.3）。然后用硅胶盖膜覆盖板，在MTP培养箱中于30 °C、400 rpm条件下孵育30分钟。
- 孵育结束后立即在MTP读板仪中于418 nm和480 nm波长下测定吸光度。葡萄糖浓度的计算采用与步骤2.6.4相同的线性校准方法。
- 丙酮酸测定的准备
- 使用12通道200 µl移液器进行1:20稀释。向每孔加入95 µl ddH2O，并转移5 µl中和后的水解产物。用硅胶盖膜密封MTP板。
- 使用12通道200 µl移液器加入100 µl丙酮酸测定试剂混合液（3 ml 1 mM N-(羧甲基氨基甲酰基)-4,4'-双(二甲氨基)二苯胺钠盐（DA-64），300 µl 10 mM焦磷酸硫胺素，60 µl 100 mM六水合氯化镁，2.4 ml 500 mM磷酸钾缓冲液（pH 5.7），30 µl 100 U丙酮酸氧化酶，12 µl 1,000 U辣根过氧化物酶，24.19 ml ddH2O）。
- 用硅胶盖膜覆盖板，在37 °C、150 rpm条件下孵育30分钟。孵育结束后立即在MTP读板仪中于727 nm和540 nm波长下测定吸光度。
- 自动化筛选结果与碳水化合物指纹图谱的综合评估
- 记录主培养板离心后并放回转盘时出现沉淀减少的样品（黏度控制步骤1.4.1）。未形成沉淀的样品为阳性（自动化筛选标准1）。
- 记录高黏度上清液，其特征为过滤步骤后滤板中残留液体（高黏度控制步骤1.5.4.6）。滤液缺失可能导致后续分析模块出现假阴性结果。滤孔中仍保留培养上清液的样品为阳性（亦为自动化筛选标准1）。
- 孵育后目视观察纤维或片状物的形成。记录该现象，因其提示存在多糖。沉淀情况评分标准：无沉淀记为(-)；少量纤维或片状沉淀记为(+)；大量沉淀记为(++)。此外，通过观察首次沉淀中有而第二次沉淀中无的纤维或片状物，判断聚合物在滤膜上的吸附情况（自动化筛选标准2）。
- 进行线性校准以计算葡萄糖浓度。
请点击此处查看该方程的放大版本。 - 在5至0.1 g/L葡萄糖范围内进行线性校准（吸光度对浓度）。计算水解后聚合物的葡萄糖当量，并按以下参数评估：葡萄糖当量：>700 mg/L = 阳性；300–700 mg/L = 拟阳性；<300 mg/L = 阴性（针对EPS生成，自动化筛选标准3）。
请点击此处查看该方程的放大版本。 - 定量HT-PMP方法检测到的所有碳水化合物。将所有组分加和后按以下标准评估：>300 mg/L（阳性）；150–300 mg/L（拟阳性）；<150 mg/L（阴性）。
- 为计算丙酮酸浓度，进行线性校准（100、50、25、10、5、2.5、1、0.5和0 µM）。为排除上清液中残留的丙酮酸，需用水解前的丙酮酸含量对水解后的丙酮酸含量进行校正。
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结果
苯酚-硫酸法的验证结果显示良好的线性关系，其决定系数（r²）为0.9998（表2）。在5 g/L浓度下，变异系数（CV）和准确度表现良好，分别为1.8%和2.2%的误差；但在0.25 g/L标准品中表现较差，变异系数（CV）为5.3%，偏差（Bias）为6.1%。
在150 µM的校准范围内，丙酮酸检测的两条校准曲线（含基质与不含基质）的决定系数均>0.9999（表3）。最高和最低校准浓度水平的变异系数（CV）均<4.6%，在整个校准范围内准确度表现良好，误差小于3.9%。因此，水解步骤产生的基质对酶法检测无影响，该方法可用于水解前后丙酮酸的测定。
表4展示了通过筛选平台成功鉴定的三种代表性新菌株的详细结果。表格左侧显示了自动化筛选模块的结果，包括黏度形成、聚合物生成以及总水解产生的葡萄糖当量，这些参数被用作详细碳水化合物指纹分析的评价指标。右侧则列出了基于校准糖类以及未知糖类、二糖和取代基的碳水化合物指纹。利用这些信息，可计算单体组成，并与已知的聚合物结构进行比对。此外，还可针对特定的单体组成和稀有碳水化合物开展定向筛选。
微尺度水解和高通量PMP衍生化的高效性能已在我们之前的研究中得到证实14。此外，凝胶过滤及多种属碳水化合物指纹图谱的验证已在另一篇文献中描述6。总之，该筛选平台具有模块化结构，可轻松修改并适应用户的个性化需求。平台的自动化筛选使通量提高八倍，并提供可靠的结果。新型分析模块（如丙酮酸测定）可被整合，结合碳水化合物指纹分析，能够提供关于所鉴定EPS的非常详细的信息。因此，在寻找轻微修饰或完全新颖的EPS变体时，该筛选平台至关重要。
图1：模块化高通量胞外多糖筛选平台的总体方案。 自动化筛选包括前三个步骤。细菌在96孔板中培养后，通过离心去除细胞（步骤1）并进行96孔过滤（步骤2）。随后，通过96孔凝胶过滤去除培养基中残留的单糖（步骤3）。含有胞外多糖（EPS）的样品在步骤4中进行评估。筛选平台的碳水化合物指纹分析包含最后三个步骤。步骤2中阳性结果的剩余滤液作为步骤5中凝胶过滤液的基础。在步骤6水解后，可通过HT-PMP法（高通量1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮法，步骤7）分析碳水化合物指纹。所有步骤之后均接有不同的分析模块和/或黏度检测。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：筛选平台的机器人工作台配置。 显示了两个液体处理机器人工作台的布局：（A）机器人液体处理系统和（B）液体处理工作站。（A）该配置包括一个具有两个位置的微孔板架（位置 1-1 至 1-2）、一个具有四个位置的一次性吸头架（位置 2-1 至 2-4），以及三个各含四个位置的微孔板架（位置 3-1 至 3-4、4-1 至 4-4 和 5-1 至 5-4）。此外，还包括一个存储转盘，配备五个“酒店式”载架（编号 1 至 5），每个可容纳七块深孔板（DWP），以及四个“酒店式”载架（编号 6-9），每个可容纳 21 块微孔板（MTP）。安装在液体处理机器人上的硬件包括一个使用一次性吸头的 96 通道移液臂，以及一个机器人操作臂（RM），用于在工作台、存储转盘、MTP 读板仪、离心机和振荡孵育器之间移动微孔板或设备。（B）液体处理工作站配备一个液体处理臂和一个 8 通道 300 µl 移液器、位于位置 1 的废液容器、带 300 µl 吸头的吸头适配器（位置 2）、带 250 ml 槽的 30 号高度适配器（位置 3），以及五个用于微孔板的 60 号高度适配器（位置 4 至 8）。本实验方案中所述位置编号均参照此图。若具备等效配置，也可使用其他类型的工作台。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：通过丙酮酸检测法测定的16种市售聚合物的丙酮酸含量。将1 g/L的聚合物溶液水解并中和后，从1:10稀释液中进行丙酮酸检测（n = 3）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：模块化高通量筛选平台的流程图。该自动化筛选系统结合了多种多糖检测模块：黏度形成分析、聚合物产量测定以及总碳水化合物含量测定。第二部分则对第一部分中筛选出的所有EPS生产菌株进行详细的单糖组成分析。自动化筛选获得的所有数据以及通过UHPLC-ESI-MS获得的碳水化合物指纹图谱数据均被整合至数据库中，从而能够简便地识别已知EPS的结构类似物或新型EPS，实现靶向筛选。请点击此处查看该图的放大版本。
| 主要步骤 / 分析模块 | 工作流程 | 观察 / 描述 |
| 菌株的培养 | 1 ml EPS培养基a 预培养 48 小时，30 °C，1,000 rpma 主培养 48 小时，30 °C，1,000 rpma | EPS的制备 |
| 细胞去除 / 黏度 | 离心：4,300 × g，30 分钟 | 无沉淀 = 黏度增加 = 阳性 |
| 聚合物检测 沉淀 | 50 µl 上清液 + 150 µl 2-丙醇b 室温下 900 rpm 振荡 10 分钟b | 视觉提示：纤维与片状物 = 聚合物沉淀呈阳性 |
| 细胞去除 / 高黏度 | 180 µl 主培养上清液 离心：3,000 × g 下离心 10 分钟 1.0 µm 玻璃纤维膜 | 无滤过 = 高黏度 = 阳性 |
| 聚合物检测 沉淀 | 50 µl 滤液 + 150 µl 2-丙醇b 室温下 900 rpm 振荡 10 分钟b | 视觉提示：纤维与片状物 = 聚合物沉淀阳性 |
| 葡萄糖消耗： 葡萄糖检测 | 稀释比例 1:100: 10 µl 滤液 + 990 µl ddH₂O2O 50 µl 样品 + 50 µl 试剂混合液 30 °C、150 rpm 条件下孵育 30 分钟 测量 418-480 nm | 培养后剩余的葡萄糖 |
| 凝胶过滤 | 平衡： 3 × 150 µl NH4乙酸盐缓冲液，pH 5.6 2 × 2 分钟，2,000 × g 1 × 2 分钟，1,000 × g 凝胶过滤： 35 µl 滤液，1,000 x g 离心 2 分钟 洗涤： 3 × 150 µl ddH₂O2O，2,000 × g 离心 2 分钟 75 µl 20% 乙醇用于保存 | 聚合物纯化： 去除培养上清液中的盐、丙酮酸、葡萄糖及其他单糖单体 |
| 凝胶过滤后的剩余葡萄糖 葡萄糖检测 | 稀释比例 1:10： 25 µl ddH₂O2O + 20 µl ddH₂O2O 和 5 µl 滤液 + 50 µl 试剂混合液 30 °C、150 rpm 条件下孵育 30 分钟 测量 418-480 nm | 凝胶过滤后残余葡萄糖的苯酚-硫酸法扣除 |
| 葡萄糖当量： 苯酚-硫酸法c | 20 µl 凝胶滤液 + 180 µl 苯酚-硫酸溶液（30 µl 5% (w/v) 苯酚溶于 ddH₂O）2O + 150 µl 浓 H2SO4 (ρ = 1.84 g/ml) 900 rpm 振荡 5 分钟 80 °C 下孵育 35 分钟 在 480 nm 处测量 | 葡萄糖当量： Δ（苯酚-硫酸法测定值 - 凝胶过滤后剩余葡萄糖） <300 mg/L 阴性 >300 和 <700 mg/L 假定阳性 >700 mg/L 阳性 |
| a 在无菌条件下（层流环境中）手动操作。 | ||
| b 在通风橱内手动操作易燃液体。 | ||
| c 在通风橱中使用 Brand 液体处理工作站（LHS）操作苯酚-硫酸溶液。 | ||
表1：使用液体处理机器人系统和液体处理工作站进行自动化初筛的完整工作流程。 自动化分析模块所有参数的概述。
| 线性度 | LOD | LOQ | ||
| r²a | 斜率a | 截距a | mg/L | mg/L |
| 0.9998 | 0.0007 | -0.021 | 50 | 100 |
| 标准品 | 均值b | 精密度b | 准确度b | |
| mg/L | mg/L | CV% | 偏差 (%误差) | |
| 5,000 | 5,112 | 1.8 | 2.2 | |
| 250 | 265 | 5.3 | 6.1 | |
| a 八次测量的平均值，采用浓度范围为 0.1 至 5 g/L 的六个水平葡萄糖进行校准 | ||||
| b 采用学生 t 检验进行分析（α = 0.05；n = 8）。 | ||||
| LOD：检测限，LOQ：定量限，CV：变异系数。 | ||||
表2：使用液体处理工作站对苯酚-硫酸法进行了验证。 线性度基于六点校准曲线计算（n = 8）。此处列出了两个典型葡萄糖浓度的均值、精密度和准确度。
| 线性度 | 定量限 | |||
| r²a | 斜率a | 截距a | µM | |
| 无基质 | 0.99999 | 0.0223 | -0.0019 | 1 |
| 1:10 稀释基质 | 0.99999 | 0.0221 | -0.0011 | 1 |
| 标准品 | 均值b | 精密度b | 准确度b | |
| µM | µM | CV% | 偏差（%误差） | |
| 无基质 | 50 | 49.96 | 3.05 | -0.09 |
| 1 | 1.04 | 2.95 | 3.86 | |
| 1:10 稀释基质 | 50 | 49.98 | 0.44 | -0.04 |
| 1 | 1.00 | 4.58 | 0.33 | |
| a 三次测量的均值，采用 1 至 50 µM 范围内六个浓度的丙酮酸进行校准。 | ||||
| b (n = 3) | ||||
| LOQ：定量限，CV：变异系数。 | ||||
表3：丙酮酸检测在有无1:10稀释中和三氟乙酸基质条件下的验证。 进行了两次六点校准（n = 3），分别评估有无基质影响的情况。计算了两个典型选择的丙酮酸浓度在有无1:10稀释效应下的均值、精密度和准确度。
表 4：通过该平台筛选的三种代表性菌株的结果。 数据来源于自动化筛选和碳水化合物指纹分析。请点击此处将此表格下载为 Microsoft Excel 文件。
| 碳水化合物 | 最大吸收波长 [nm] | 480 nm 处吸光度 均值±标准差 | 相对于葡萄糖的吸光度 [%] | |
| 结冷胶 | 470 | 0.342 | ±0.010 | 187 |
| 黄原胶 | 472 | 0.334 | ±0.002 | 183 |
| 瓜尔胶 | 478 | 0.387 | ±0.017 | 212 |
| 阿拉伯胶 | 476 | 0.393 | ±0.034 | 215 |
| 透明质酸 | 484 | 0.231 | ±0.011 | 126 |
| 刺梧桐胶 | 478 | 0.455 | ±0.023 | 249 |
| 魔芋胶 | 480 | 0.297 | ±0.009 | 163 |
| 落叶松胶 | 480 | 0.337 | ±0.032 | 185 |
| 刺槐豆胶 | 478 | 0.354 | ±0.033 | 194 |
| 硬葡聚糖 | 484 | 0.168 | ±0.010 | 92 |
| 琥珀酰聚糖 | 482 | 0.168 | ±0.005 | 92 |
| 塔拉胶 | 480 | 0.318 | ±0.016 | 174 |
| 西黄芪胶 | 478 | 0.513 | ±0.003 | 281 |
| 温轮胶 | 472 | 0.226 | ±0.016 | 124 |
| 木聚糖 | 472 | 0.567 | ±0.007 | 311 |
| 黄原胶 | 482 | 0.245 | ±0.021 | 134 |
| 葡萄糖 | 484 | 0.191 | ±0.014 | 100 |
| SD：标准差 | ||||
表5：采用苯酚-硫酸法测定16种市售聚合物及葡萄糖所得结果。 采用苯酚-硫酸法测定16种市售聚合物（1 g/L）以及葡萄糖（1 g/L）在最大吸收波长及480 nm处的吸光度，并计算所有聚合物相对于葡萄糖的吸光度比值。
| 标准 | 均值a | 精密度a | 准确度a | |
| mg/L | mg/L | CV% | 偏差（%误差） | |
| 1:10 稀释 | 450 | 460 | 1.01 | 2.14 |
| 45 | 44.7 | 1.41 | -0.70 | |
| 1:100 稀释 | 4,500 | 5,026 | 1.19 | 11.6 |
| 450 | 471 | 1.16 | 4.55 | |
| b 采用学生t检验进行分析（α = 0.05；n = 8）。 | ||||
| CV：变异系数。 | ||||
表6：葡萄糖检测自动稀释的验证。 对培养后（1:100）和凝胶过滤后（1:10）葡萄糖检测的稀释倍数进行了验证。两种葡萄糖浓度（n = 8）通过液体处理系统进行稀释并进行评估。计算了均值、精密度和准确度。
| 理论葡萄糖值 | 覆盖硅胶帽垫 | 蒸发测试（未覆盖） | |||||
| 均值a | 精密度a | 准确度a | 均值a | 精密度a | 准确度a | 蒸发 | |
| mg/L | mg/L | CV % | 偏倚（%误差） | mg/L | CV % | 偏倚（%误差） | %误差 |
| 45.0 | 45.2 | 0.69 | 0.44 | 46.0 | 0.66 | 2.05 | 1.60 |
| 18.0 | 17.7 | 0.80 | -1.68 | 18.0 | 0.72 | -0.01 | 1.69 |
| 9.0 | 8.74 | 1.20 | -2.98 | 8.92 | 0.81 | -0.95 | 2.09 |
| 4.5 | 4.50 | 1.26 | -0.04 | 4.58 | 1.57 | 1.76 | 1.80 |
| 1.8 | 1.85 | 0.74 | 2.90 | 2.01 | 2.82 | 11.6 | 8.48 |
| 0.9 | 1.03 | 1.43 | 14.1 | 1.16 | 3.52 | 28.3 | 12.4 |
| a (n = 4) | |||||||
| CV：变异系数。 | |||||||
表7：加盖与不加盖MTP蒸发效应的评估。 六种不同的葡萄糖标准品（n = 4）在室温下放置于进样盘中3.5小时。通过使用未加盖以及加盖（硅胶垫）的标准样品来评估蒸发效应。计算了均值、精密度、准确度以及蒸发导致的百分比误差。
| 凝胶过滤前 | 凝胶过滤后 | 凝胶过滤后剩余葡萄糖 | |||
| 平均值a | 标准差a | 平均值a | 标准差a | ||
| mg/L | mg/L | mg/L | mg/L | % | |
| 1 | 8,647 | 110 | 259 | 121 | 3.00 |
| 2 | 5,108 | 56 | 116 | 37 | 2.27 |
| 3 | 2,014 | 12 | 50.8 | 14 | 2.52 |
| 4 | 1,015 | 12 | 25.1 | 8.1 | 2.47 |
| 5 | 510 | 4.9 | 12.8 | 4.3 | 2.51 |
| 6 | 223 | 8.6 | 6.6 | 1.5 | 2.94 |
| 7 | 122 | 5.6 | 4.3 | 0.9 | 3.48 |
| 8 | 75 | 6.0 | 3.1 | 0.3 | 4.18 |
| a (n=8) | |||||
| SD：标准差 | |||||
表8：凝胶过滤效率的结果。 对八种不同葡萄糖标准品在凝胶过滤前后进行测定，以评估凝胶过滤的效率。计算了均值、标准差以及凝胶过滤后剩余的葡萄糖百分比。
讨论
采用苯酚-硫酸法检测多糖：不同单糖在此方法中表现出不同的吸收峰及摩尔消光系数9。这导致含有多种糖类且比例各异的多糖聚合物也呈现不同的吸收峰。16种市售多糖聚合物各自的吸收峰波长见表5。这些聚合物被溶解于ddH2O中（1 g/L），在150 rpm条件下搅拌过夜，随后采用苯酚-硫酸法进行测定。其中，结冷胶在470 nm处显示出最低的吸收峰，而硬葡聚糖和透明质酸的吸收峰最高，为484 nm。基于上述结果，本筛选平台选择480 nm作为检测波长。各聚合物的相对吸光度以1 g/L葡萄糖所得吸光度（设为100%）为基准进行计算。最低的相对吸光度值为硬葡聚糖和琥珀酰聚糖，均为92%。此结果符合预期，因为硬葡聚糖仅含葡萄糖，而琥珀酰聚糖中葡萄糖与半乳糖的比例为7:1。这两种市售聚合物具有不同的干燥失重和灰分含量，因此未能达到理论值约110%。木聚糖表现出最高的相对吸光度，达311%。其原因是木糖以呋喃糖形式为主，具有较高的摩尔消光系数。在葡萄糖浓度为0.1 g/L时达到定量限，检测限则出现在浓度<0.05 g/L时。然而，在筛选中对产多糖阳性菌株的检测限高于0.7 g/L，因此该方法表现出良好的检测性能。为了获得可靠结果，通过葡萄糖检测试剂盒测定凝胶过滤后残留的葡萄糖含量，并从苯酚-硫酸法测得的数值中扣除该值。
葡萄糖测定自动稀释：研究了培养后葡萄糖测定（稀释1:100）的性能。具体操作为，将10 µl上清液转移至深孔板中的990 µl ddH2O中，并通过反复吸取和排出180 µl溶液十次进行混匀。第二个关键步骤是从凝胶过滤后的葡萄糖检测试剂中准确移取仅5 µl等分试样进行1:10稀释。为实现该稀释，首先使用50 µl吸头转移25 µl ddH2O，随后同时吸取20 µl ddH2O和5 µl凝胶过滤液。此操作可确保更有效地从吸头中排出5 µl等分试样。两个稀释步骤均通过多种葡萄糖标准品在葡萄糖检测试剂中进行了验证。两种代表性浓度的结果见表6。培养后葡萄糖含量测定的1:100稀释对两个标准品均表现出高精密度，变异系数CV <1.2%。同时，较高浓度标准品的准确度误差达11.6%。然而，由于葡萄糖测定仅用于反映培养后的残余葡萄糖含量，对聚合物检测无显著影响，因此该误差可忽略不计。凝胶过滤后残余葡萄糖的1:10稀释结果非常可靠，变异系数CV <1.4%，准确度误差 <2.1%。
蒸发因素的考虑：从第一步到第一次葡萄糖检测需要3.5小时。为了确定该时间段是否对未加盖的MTP储存产生影响，将50 µl葡萄糖检测校准标准品分别在加盖与不加盖的条件下于机器人样品架中存放3.5小时。在校准范围（45至4.5 mg/L）内，样品浓度几乎未增加。由蒸发引起的浓度升高低于2.1%，仅在两个最低浓度（1.8和0.9 mg/L）时升高达到12.4%（表7）。
凝胶过滤：大量未代谢的葡萄糖会干扰从水解聚合物中对葡萄糖的定量检测。因此，在培养后需要进行凝胶过滤步骤以去除残留的葡萄糖。此外，凝胶过滤还可将含有聚合物的上清液中的盐类及除葡萄糖以外的单糖类碳水化合物进行纯化，从而在单体分析中最小化分析背景。在凝胶过滤步骤中，将35 µl滤液置于孔的中心位置。为了验证自动化系统中凝胶过滤的稳健性，对8个浓度范围从0.045至9 g/L的葡萄糖校准标准品进行了过滤（n = 8）。每个浓度的葡萄糖含量均比初始值降低了95%以上（表8）。因此，凝胶过滤在不同浓度的葡萄糖条件下均表现出非常好的效果。此外，还通过葡萄糖检测试剂盒测定凝胶过滤后残留的葡萄糖含量，并将其从苯酚-硫酸法测定结果中扣除，以获得水解聚合物中正确的葡萄糖当量含量。
丙酮酸检测：首先，研究了水解步骤中中和并稀释（1:10）的三氟乙酸（TFA）基质是否会影响酶促反应。因此，该完整检测方法分别在有基质和无基质条件下各进行了一次，结果均显示出可靠的检测效果。最终，成功测定了16种市售聚合物中的丙酮酸含量，结果如图3所示。众所周知，在这16种聚合物中，只有琥珀酰葡聚糖和黄原胶天然含有丙酮酸。通过本研究的丙酮酸检测方法，这两种聚合物均被准确识别。此外，在硬葡聚糖、文莱胶和木聚糖中也检测到显著量的丙酮酸。总体而言，该方法的能力得到了验证，丙酮酸检测表现出高性能，证明其可在水解后有效检测多种聚合物中的丙酮酸。
碳水化合物指纹图谱：在完成自动化筛选中的所有分析模块后，根据以下标准选择潜在的EPS生产菌株进行碳水化合物指纹图谱分析：1）离心后和/或过滤后观察到黏性现象；2）过滤前后均出现沉淀，观察到纤维状或片状物视为阳性；3）苯酚-硫酸法测定的葡萄糖当量值。数值 >700 mg/L 被判定为阳性，300 至 700 mg/L 之间的值被判定为疑似 EPS 产生菌。当两项或三项标准被评定为阳性时，菌株将被选中进行进一步的碳水化合物指纹图谱分析。这些标准可根据 EPS 筛选的具体研究目的进行调整。例如 低粘度胞外多糖（EPS）。本研究旨在筛选高效的EPS生产菌株。在筛选仅产生少量EPS的菌株时，应降低以葡萄糖当量表示的评估阈值。
技术优势与未来应用：本方案的一个显著特点是其步骤和各个分析模块的模块化设计。这些步骤和模块可以以不同方式组合，根据具体需求进行调整，并且能够轻松引入新的模块。此外，各分析模块也可单独使用，例如，水解模块与高通量PMP衍生化模块联用，可在96孔板体系中对不同聚合物溶液（1 g/L）进行单体组成分析。对于无法获得液体处理系统的实验室，整个筛选过程可完全手动操作，且无需更改移液方案。然而，使用液体处理系统可将通量提高至每天最多768个菌株（手动筛选时为192个菌株）。本文所述方案适用于多种属微生物的筛选，因而可在一个流程中对大规模菌种库进行筛选，以发现新的胞外多糖（EPS）生产菌株并分析其碳水化合物指纹图谱（图4）。此外，通过详细的单糖分析，还可针对含有稀有糖类（如岩藻糖、糖醛酸或甚至未知糖类）的多糖进行靶向筛选。同时，也可检测特定比例的多种糖类组合，从而简便地鉴定已知EPS的结构类似物或新型EPS。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
我们衷心感谢 Thomas Howe 和 Jörg Carsten 在液体处理系统的编程与技术支持方面提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96 孔深孔板 2.0 ml (DWP) | Greiner Bio-One | 780271 | 主培养（CP 1-1 至 1-4）、凝胶过滤平衡板（CP 1-6、1-7、2-6 和 2-7）、葡萄糖测定 1:100 稀释（CP 4-1 至 4-4），含 990 µl ddH2O |
| 透气封口膜 | Axygen | BF-400-S | 预培养和主培养 DWP 的孵育用封口膜 |
| 铝箔封口膜 | Axygen | PCR-AS-200 | 用于甘油保存板在 -80 °C 储存的封口膜 |
| MCA96 嵌套式一次性吸头 200 µl | TECAN | 30038619 | 工作台位置（WTP 2-1 至 2-4） |
| A/B 玻璃滤膜板 1 µm | Pall Corporation | PN 8031 | 存放于收集板（CP 2-1 至 2-4） |
| 96 孔 V 型底微孔板 | Greiner Bio-One | 651201 | 用于过滤板的收集板（CP 2-1 至 2-4） |
| 96 孔 G-25 离心柱 | Harvard Apparatus | 74-5612 | 存放于洗涤深孔板（CP 1-6、1-7、2-6 和 2-7） |
| 96 孔 V 型底微孔板 | Nunc | 249944 | 用于凝胶过滤板的收集板（CP 3-1 至 3-4） |
| 嵌套式一次性吸头 SBS 50 µl | TECAN | 30038609 | 转盘位置（CP 4-6、4-7 和 5-1 至 5-6） |
| 250 ml 储液槽 | Axygen | Res-SW96-HP | 水（WTP 1-1）、葡萄糖测定试剂混合液（WPT 1-2）、pH 5.6 醋酸铵缓冲液（CP 5-7） |
| 96 孔 F 型底微孔板（MTP） | Greiner Bio-One | 655101 | 沉淀 1（CP 6-1 至 6-4）、pH 值测定（CP 7-1 至 7-4）、沉淀 2（CP 8-1 至 8-4）、苯酚-硫酸法（CP 8-5 至 8-8）、葡萄糖测定（CP 9-1 至 9-9）、空白板（WTP 3-1、3-2） |
| 96 孔硅胶盖垫 | Whatmann | 7704-0105 | MTP 板的覆盖垫 |
| 200 µl 移液吸头 | Sarstedt | 70.760.002 | 用于手动操作 |
| 1,000 µl 移液吸头 | Sarstedt | 70.762 | 用于手动操作 |
| 96 孔 PCR 微孔板 | Brand | 781350 | 水解、PMP 衍生化 |
| TPE（热塑性弹性体）盖垫 | Brand | 781405 | 水解、PMP 衍生化 |
| 0.2 µm Supor 滤膜板 | Pall Corporation | PN 8019 | 用于 UHPLC-ESI-MS 分析样品的过滤，配合 MTP 收集板使用 |
| LHS 吸头 5-300 µl | Brand | 732150 | Brand LHS 系统 |
| 葡萄糖氧化酶 | Sigma-Aldrich | G2133 | 葡萄糖测定 |
| 辣根过氧化物酶 | Sigma-Aldrich | P6782 | 葡萄糖测定、丙酮酸测定 |
| DA-64（N-(羧甲基氨基甲酰基)-4.4'-双(二甲氨基)-二苯胺钠盐） | Wako Chemicals GmbH | 043-22351 | 丙酮酸测定 |
| 丙酮酸氧化酶 | Sigma-Aldrich | P4591 | 丙酮酸测定 |
| 磷酸氢二钾 | Carl-Roth | P749.3 | 丙酮酸和葡萄糖测定 |
| 磷酸二氢钾 | Carl-Roth | 3904.3 | 丙酮酸和葡萄糖测定 |
| 硫胺素焦磷酸酯 | Sigma-Aldrich | C8754 | 丙酮酸测定 |
| 六水合氯化镁 | Sigma-Aldrich | 31413 | 丙酮酸测定 |
| 2-丙醇 | VWR | 20922.466 | 沉淀 |
| 苯酚 | VWR | 20599.231 | 苯酚-硫酸法 |
| 硫酸 | Carl-Roth | 4623.4 | 苯酚-硫酸法 |
| 三氟乙酸 | Sigma-Aldrich | T6508 | 水解 |
| 氨水溶液 | Carl-Roth | P093.1 | 水解、PMP 衍生化 |
| 无水乙醇 | VWR | 20821.321 | 水解、PMP 衍生化 |
| 酚红 | Alfa Aesar | B21710 | 水解、PMP 衍生化 |
| 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 | Sigma-Aldrich | M70800 | PMP 衍生化 |
| LC-MS 级甲醇 | VWR | 83638.320 | PMP 衍生化 |
| LC-MS 级乙腈 | VWR | 83040.320 | PMP 衍生化 |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | 338826 | PMP 衍生化 |
| 无水乙醇 | VWR | 20821.321 | PMP 衍生化 |
| 甲基红 | Alfa Aesar | 36667 | pH 值测定 |
| 自动化液体处理系统 | Tecan | Freedom EVO | 工作台设置见 图 2 |
| 液体处理工作站 LHS | Brand | 709400 | 工作台设置见 图 2 |
| 吸头适配器 | Brand | 709434 | 工作台设置见 图 2 |
| Liquid Ends MC 20-300 µl | Brand | 709416 | 工作台设置见 图 2 |
| 60 mm 适配器 | Brand | 709430 | 工作台设置见 图 2 |
参考文献
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