由 Sporosarcina pasteurii 介导的微生物诱导碳酸钙沉淀

摘要

本文介绍了利用细菌 Sporosarcina pasteurii 进行微生物诱导碳酸钙沉淀（MICP）的实验方案。通过光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）对沉淀生成的碳酸钙进行表征。结果还表明，经MICP处理后，海绵材料的抗压强度得到提高。

摘要

本研究中涉及的特定细菌（S. pasteurii）具有一种独特的能力：在适宜条件下，通过分泌脲酶，可在自然环境中诱导尿素水解（即尿素分解）。这一尿素分解过程经由一系列化学反应，最终导致碳酸钙沉淀物的形成，该现象被称为微生物诱导方解石沉淀（MICP）。本文详细阐述了实现MICP的正确培养方案。最后，通过多种显微技术进行可视化实验，以深入理解沉淀过程的各个层面。采用光学显微镜、扫描电子显微镜（SEM）和X射线光电子能谱（XPS） 等技术对最终产物进行了化学表征。此外，通过一项定性实验验证了这些沉淀物堵塞天然多孔介质内部孔隙的能力，实验中使用海绵条模拟具有多种尺度的孔隙网络。当含有细菌细胞的培养液渗透入海绵条后，其内部孔隙因持续的化学沉淀而被堵塞，导致海绵条硬化。与对照组海绵条相比，该硬化海绵条表现出更优异的力学强度：在施加外部载荷时，对照组海绵条发生压缩和变形，而硬化后的海绵条则能承受相同重量且几乎不发生形变。

引言

Sporosarcina pasteurii 是一种革兰氏阳性细菌，能够在强碱性环境（pH~10）中生存¹，也是能够引发一种称为微生物诱导碳酸钙沉淀（Microbiologically Induced Calcite Precipitation, MICP）现象的细菌种类之一^2-4。MICP 是指在适宜环境条件下，某些微生物诱导碳酸钙沉淀的过程。S. pasteurii 近年来受到重视，因其被确认为在特定条件下可诱导大量 MICP 发生的潜在作用菌种。这一潜力源于 S. pasteurii 具有分泌大量脲酶的独特能力。该酶作为催化剂，可在水分子存在下促进尿素（一种自然界广泛且大量存在的生化化合物）的加速水解。通过一系列连锁反应，该过程最终生成带负电荷的碳酸根离子。这些离子继而与钙等带正电的金属离子反应，最终形成碳酸钙（方解石）沉淀；因此得名 MICP^5-9。

微生物诱导碳酸钙沉淀（MICP）的过程已被认知并研究了数十年^10,11。在过去的几年中，MICP已被探索用于多种工程和环境领域，包括自下而上的绿色建造¹²、大型结构的增强^13,14以及碳封存与储存^15,16。

例如，Cunnig....

方案

注意：请按照下述顺序执行实验方案。细菌培养方案在第1节中讨论（另见图1）。第2节描述了使用外源添加剂富集培养基的方案。第3节描述了多模式显微镜的实验方案。所有组分的重量可使用分析天平进行称量。每种溶液的体积可使用量筒进行测量。

注意：第1至2节必须遵循适当的生物安全规程。具体细节请咨询机构安全办公室。

1. 细菌培养

1. 培养细菌——琼脂平板培养基制备
   1. 准备实验器材和试剂，如培养皿、烧瓶、Tris碱、HCl、琼脂、Millipore水、pH计等。使用前将所有容器在121 °C下高压灭菌。
   2. 通过将15.75 g Tris碱与1 L Millipore水混合，配制1 L 0.13 M的Tris缓冲水溶液。为降低原始溶液的pH值（pH 10.4），加入2,800 µl HCl（50%浓度）。使用pH计持续监测，调节至pH = 9。
   3. 将1 L缓冲液分为以下两部分：
      1. 取其中800 ml溶液，均分为两份，每份400 ml。向其中一份加入8 g (NH₄)₂SO₄，另一份加入16 g酵母提取物。
      2. 取剩余的200 ml溶液，再次均分为两份，每份100 ml。向其中一份....

结果

S. pasteurii 作为一种嗜碱菌²⁴，能够在相对严苛的条件下存活。按照上述培养方案操作，并将 S. pasteurii 培养于培养室中时，细菌会随时间推移诱导碳酸钙沉淀（图 2A）。图 2(b) 展示了培养基内细菌细胞群体的相差光学显微图像。单个细胞清晰可辨，其杆状形态为芽孢杆菌类细菌的典型特征。图中用小的棕色箭头特别标示出两个单独的细胞。碳酸钙的沉淀过程持续数天。图 2A 显示了沉淀物在离心管底部的沉积情况。肉眼可明显观察到液相下方存在白色粉末状物质，与上方黄色液体形成鲜明的颜色对比。该黄色液体为含有悬浮细菌的培养基。收集白色沉淀物，干燥后通过扫描电镜（SEM）成像（图 2C）。

在图3A中，清晰可辨的解理线——晶体结.......

讨论

关键步骤：本文详细描述了培养活性 S. pasteurii 样本的实验方案。培养物制备完成后，必须进行适当的增殖富集。这是实验成功的关键步骤，因为未能提供合适的化学环境将导致沉淀过程耗时极长，甚至完全无法发生。S. pasteurii 对多种外界因素高度敏感，必须在高度谨慎和精确的条件下进行培养，以确保其生物化学活性的稳定性和实验的可重复性。目前研究已知，富集的程度和剂量会决定沉淀物的化学性质，因此也必须进行精确控制。

修改与故障排除： 多个方面可以进行修改，而对最终结果影响甚微。平板计数不一定必须按照上述方法（即 Miles-Misra 法的系列稀释）进行。此处通过在培养皿底面绘制弦线将其分为七个区域，以实现系列稀释。但此方法并非必需。通常也可采用涂布平板法，即使用整块琼脂平板进行特定稀释度的接种。系列稀释在一系列连续的涂布平板上进行，选择菌落数在可计数范围内（20 - 200）的平板用于最终计算。此处也可应用其他各种细胞计数技术。显微镜观察可使用普通的盖玻片或载玻片进行，计数.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养皿	Fisher Scientific	FB0875712	用作琼脂平板的培养皿
Pyrex 烧瓶	Fisher Scientific	S63268	Corning 锥形瓶
Tris-Base	Promega	H5133	用于配制 Tris 缓冲液
盐酸	Sigma-Aldrich	H9892	1.0 N，生物试剂，适用于细胞培养
琼脂粉	Sigma-Aldrich	A1296	经微生物检测、植物细胞培养检测和细胞培养检测的粉末
硫酸铵	Sigma-Aldrich	A4418	用于分子生物学
酵母提取物粉末	Sigma-Aldrich	51475
量筒	Cole-Parmer	CP08559GC	Cole-Parmer A 级带校准证书量筒，TC 型；1,000 ml，每包 1 个
分析天平	OHAUS	AX124E	用于称量试剂重量
高压灭菌器	Brinkmann	58619000
高压灭菌指示胶带	VWR	52428864
铝箔	Sigma-Aldrich	Z185140	用于在放入高压灭菌器前密封烧瓶
细菌菌种	Cedarlane	11859	-80 °C 保存的 S. pasteurii 菌种，目录号对应的 ATCC 编号已注明
Mline 单通道机械可调移液器	Biohit	725010	由 VWR 以目录号 14005976 销售
微量移液器吸头	Fisher Scientific	212772B	用于划线琼脂平板
培养箱	Binder	80079098	微生物培养箱，BF 系列
摇床培养箱	VWR	14004300	VWR Signature 台式摇床培养箱
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Sigma-Aldrich	P7059
BD Falcon Express Pipet-Aid 移液辅助装置	BD Biosciences	357590	由 VWR 以目录号 53106220 销售
Parafilm 封口膜	Sigma-Aldrich	P7793	用于密封琼脂平板
尿素	Sigma-Aldrich	U1250	营养培养基的添加成分
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S8875	营养培养基的添加成分
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016	营养培养基的添加成分