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方法文章

由 Sporosarcina pasteurii 介导的微生物诱导碳酸钙沉淀

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DOI：

10.3791/53253

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2016年4月16日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Alberta, 2Department of Mechanical Engineering, York University, 3Department of Civil and Environmental Engineering, University of Alberta

本文内容

摘要

本文介绍了利用细菌 Sporosarcina pasteurii 进行微生物诱导碳酸钙沉淀（MICP）的实验方案。通过光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）对沉淀生成的碳酸钙进行表征。结果还表明，经MICP处理后，海绵材料的抗压强度得到提高。

摘要

本研究中涉及的特定细菌（S. pasteurii）具有一种独特的能力：在适宜条件下，通过分泌脲酶，可在自然环境中诱导尿素水解（即尿素分解）。这一尿素分解过程经由一系列化学反应，最终导致碳酸钙沉淀物的形成，该现象被称为微生物诱导方解石沉淀（MICP）。本文详细阐述了实现MICP的正确培养方案。最后，通过多种显微技术进行可视化实验，以深入理解沉淀过程的各个层面。采用光学显微镜、扫描电子显微镜（SEM）和X射线光电子能谱（XPS） 等技术对最终产物进行了化学表征。此外，通过一项定性实验验证了这些沉淀物堵塞天然多孔介质内部孔隙的能力，实验中使用海绵条模拟具有多种尺度的孔隙网络。当含有细菌细胞的培养液渗透入海绵条后，其内部孔隙因持续的化学沉淀而被堵塞，导致海绵条硬化。与对照组海绵条相比，该硬化海绵条表现出更优异的力学强度：在施加外部载荷时，对照组海绵条发生压缩和变形，而硬化后的海绵条则能承受相同重量且几乎不发生形变。

引言

Sporosarcina pasteurii 是一种革兰氏阳性细菌，能够在强碱性环境（pH~10）中生存1，也是能够引发一种称为微生物诱导碳酸钙沉淀（Microbiologically Induced Calcite Precipitation, MICP）现象的细菌种类之一2-4。MICP 是指在适宜环境条件下，某些微生物诱导碳酸钙沉淀的过程。S. pasteurii 近年来受到重视，因其被确认为在特定条件下可诱导大量 MICP 发生的潜在作用菌种。这一潜力源于 S. pasteurii 具有分泌大量脲酶的独特能力。该酶作为催化剂，可在水分子存在下促进尿素（一种自然界广泛且大量存在的生化化合物）的加速水解。通过一系列连锁反应，该过程最终生成带负电荷的碳酸根离子。这些离子继而与钙等带正电的金属离子反应，最终形成碳酸钙（方解石）沉淀；因此得名 MICP5-9。

微生物诱导碳酸钙沉淀（MICP）的过程已被认知并研究了数十年10,11。在过去的几年中，MICP已被探索用于多种工程和环境领域，包括自下而上的绿色建造12、大型结构的增强13,14以及碳封存与储存15,16。

例如，Cunnigham17 等人设计了一种高压中温流动反应器，其中包含一个Berea砂岩岩心。该反应器接种了S. fridgidimarina细菌，在高压超临界二氧化碳注入条件下，观察到孔隙体积内生物量大量积聚，导致渗透率降低超过95%。Jonkers和Schlangen18研究了某些特殊菌株细菌对混凝土自修复过程的影响。进入表面孔隙并输送到孔隙网络中的外部水分可激活处于休眠状态的细菌，进而通过微生物诱导碳酸钙沉淀（MICP）增强结构强度。Tobler19等人在有利于大规模MICP发生的条件下，比较了S. pasteurii与一种本土地下水尿素分解微生态系统之间的尿素酶活性，发现即使本土微生物群落缺乏先前的脲酶活性，S. pasteurii仍具有一致促进方解石沉淀的能力。Mortensen20等人研究了土壤类型、氯化铵浓度、盐度、氧气浓度以及细胞裂解等外部因素对MICP的影响。他们证明，该生物处理过程在参数空间广泛变化的情况下仍具有很强的鲁棒性，表明只要采用适当的富集工艺以增强细菌活性，该技术适用于多种大规模修复应用。Phillips21等人设计实验，研究注入S. pasteurii菌液后砂柱和砂岩岩心渗透率与强度的变化。他们发现，渗透率下降了2至4倍，而裂缝强度则提高了三倍。

S. pasteurii 及其在微生物诱导碳酸钙沉淀（MICP）中的作用是当前研究的热点，有关化学沉淀机制的若干问题仍未完全阐明。鉴于此，建立一套一致且标准化的操作流程，以准确培养出适合用于 MICP 的富集型 S. pasteurii 菌种储备，显得尤为重要。本文提出了一项严谨的实验方案，以确保实验的可重复性与可再现性。本论文详细描述了 S. pasteurii 的培养方法以及对培养基进行适当富集以诱导沉淀生成的具体步骤。该过程通过多种显微技术进行研究，包括光学显微镜、扫描电子显微镜（SEM）和X射线光电子能谱（XPS）。本文的重点在于 MICP 过程本身。至于 SEM 和 SIMS 等已被广泛采用的标准实验流程，则不再单独详述。

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方案

注意：请按照下述顺序执行实验方案。细菌培养方案在第1节中讨论（另见图1）。第2节描述了使用外源添加剂富集培养基的方案。第3节描述了多模式显微镜的实验方案。所有组分的重量可使用分析天平进行称量。每种溶液的体积可使用量筒进行测量。

注意：第1至2节必须遵循适当的生物安全规程。具体细节请咨询机构安全办公室。

1. 细菌培养

  1. 培养细菌——琼脂平板培养基制备
    1. 准备实验器材和试剂，如培养皿、烧瓶、Tris碱、HCl、琼脂、Millipore水、pH计等。使用前将所有容器在121 °C下高压灭菌。
    2. 通过将15.75 g Tris碱与1 L Millipore水混合，配制1 L 0.13 M的Tris缓冲水溶液。为降低原始溶液的pH值（pH 10.4），加入2,800 µl HCl（50%浓度）。使用pH计持续监测，调节至pH = 9。
    3. 将1 L缓冲液分为以下两部分：
      1. 取其中800 ml溶液，均分为两份，每份400 ml。向其中一份加入8 g (NH4)2SO4，另一份加入16 g酵母提取物。
      2. 取剩余的200 ml溶液，再次均分为两份，每份100 ml。向其中一份加入2 g (NH4)2SO4；向另一份加入4 g酵母提取物和4 g琼脂。
    4. 将上述4种溶液分别装入烧瓶，用铝箔包裹并贴上高压灭菌指示胶带后，进行高压灭菌。
      注：若使用台式高压灭菌器，应将体积设定为500 ml（温度和压力将根据体积自动设定）。
    5. 从高压灭菌器中取出后，将两个400 ml溶液留作步骤1.3.1（下文）使用。将两个100 ml溶液混合，得到200 ml混合液。将该混合液倒入10–12个培养皿中。
  2. 培养细菌——琼脂平板样品制备
    1. 从-80 °C冰箱中取出菌种，使其充分解冻。解冻后，将菌种和琼脂平板置于生物安全柜内。
    2. 选用最小量程的移液器（0.5–10 µl为宜），吸取Sporosarcina pasteurii菌种，用移液器尖端在琼脂平板上划线。将划线后的琼脂平板置于31 °C恒温培养箱中静置培养48小时。
    3. 48小时后，从培养箱中取出平板，肉眼观察是否存在单菌落。若无单菌落出现，则继续放入培养箱中培养24小时。
    4. 重复此过程直至观察到单菌落，但总尝试时间不得超过7天。
      注：若一周后仍未出现单菌落，则说明操作步骤有误，需从第1步开始重新进行整个流程。
  3. 培养细菌——最终样品制备
    1. 将两个400 ml溶液（Tris缓冲液 + (NH4)2SO4 与 Tris缓冲液 + 酵母提取物）混合，得到800 ml溶液。取125 ml该溶液转移至一个烧瓶中。
    2. 肉眼观察琼脂平板表面，选择单菌落密集的区域。用移液器尖端轻轻触碰并挑取一个单菌落。
    3. 将同一移液器尖端浸入125 ml烧瓶中，充分搅动，确保有足够数量的细胞被转移以支持后续扩增。将烧瓶置于30 °C、150 rpm的摇床培养箱中培养2–3天。2–3天后，从培养箱中取出烧瓶。
  4. 培养细菌——最终细胞计数
    1. 使用磷酸盐缓冲液（PBS）对未稀释的菌液进行系列稀释，至少稀释至一千万倍（10-7），以确保可获得可计数的单菌落。在其中一个琼脂平板上画出七条平行且等距的直线。
      1. 在培养皿底部绘制粗线，使其从上方清晰可见。在第一个区段内滴加3小滴未稀释菌液。将1 ml未稀释菌液加入9 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，得到1:10稀释液。
    2. 用移液器取少量新稀释液（约0.1 ml），在下一个区段滴加3小滴。将该稀释液转移至新烧瓶中，并加入PBS进一步稀释10倍（10x），使总稀释度达到10-2（即1:100）。
      1. 将此1:100稀释液用于下一个区段。重复此过程，依次将新稀释液转移至新烧瓶中，并持续用PBS进行10倍梯度稀释，依次获得10-3（1:1,000）至10-7（1:1,000万）的稀释样品，直至最后一个区段。
    3. 将平板在31 °C下培养1–2天后，进行菌落形成单位（CFU）平板计数，以测定琼脂平板中存活细胞的数量。该数值可定量反映原始未稀释样品中的细菌浓度。
      注：CFU值的测定基于在特定营养培养基、温度和时间条件下，每个菌落均由一个可存活的微生物细胞增殖形成的假设。
    4. 用自封膜密封培养皿，并将剩余试剂存入冰箱以备后续使用。

2. 营养物质富集以加速沉淀的实验方案

  1. 将9 ml已制备的培养液（细胞+培养基）转移至若干个10 ml体积的无菌离心管中。
  2. 在新鲜培养基中配制100 ml 外源性富集液储备液，该储备液由以下四种成分组成，浓度分别为：尿素：2 g/L，氯化铵：1 g/L，碳酸氢钠：212 mg/L，氯化钙：280 mg/L。使用分析天平精确称量所有组分，除尿素外，将其他组分与新鲜培养基在烧杯中混合，并置于高压灭菌锅中灭菌（121 °C，15 psi，15 min）。
    1. 高压灭菌后，将所需量的尿素（2 mg）与1 ml新鲜培养基混合，并通过装有0.22 µm滤膜的注射器过滤，完成富集液的制备。
    2. 向含有9 ml已制备培养液（细胞+培养基）的无菌离心管中加入1 ml上述含添加剂的富集培养基（见步骤2.1）。
      注意：在所有这些组分中，尿素在高温下易降解，因此不能通过高压灭菌法进行灭菌。因此，在其他组分完成高压灭菌（121 °C，15 psi，15 min）后，需最后通过0.22 µm注射器滤膜加入尿素。
  3. 使用机械涡旋振荡器彻底涡旋混匀每根离心管。将富集后的液体（细胞+培养基+添加剂）置于30 °C的静置培养箱中。定期观察各组分是否开始出现沉淀。当肉眼观察到沉淀启动后，立即使用光学显微镜开始显微观察。此过程通常在实验开始后30–36小时之间发生。

3. 多模式显微镜操作方案

  1. 取少量液体（约 1 ml）转移至高倍显微镜载玻片腔室系统中，使用明场模式进行初步观察。首先，从最低放大倍数（4X）开始，因其可提供较宽的观察范围，从而获得沉淀物分布的整体信息。
  2. 选择沉淀物含量较多的特定区域，并逐步提高放大倍数（20X、40X、60X）进行放大观察。
    注意：由于细胞与胞外聚合物（EPS）在明场下折射率极为接近，无法清晰分辨，必要时应切换至相差模式。在此模式下，仅细胞膜轮廓（与细胞主体相位不同）可见，从而实现视觉上的区分。
  3. 最后，使用活/死染色剂对部分腔室进行染色，该染色剂可将活体组分染成绿色，而将死亡组分染成红色。具体操作请参考标准实验方案28。
  4. 开启荧光模式，以清晰区分红色与绿色区域。使用红色滤光片组（激发波长 540 - 580 nm，二向色镜 595 nm，阻断滤光片 600 - 660 nm）和绿色滤光片组（GFP 长通绿色滤光片组，激发波长 440 - 480 nm，二向色镜 505 nm，阻断滤光片 510 nm）以获取荧光显微图像。
  5. 在收集完所有多模式数据后，选择最佳图像，并手动叠加（单独的明场、相差和荧光图像），以获得最佳对比度和清晰度。
  6. 对干燥的固体样品进行扫描电子显微镜（SEM）分析，以了解晶体结构。此为成熟且标准的操作流程22。同时进行XPS 分析，以鉴定官能团（碳酸盐）的化学特征。该方法同样为成熟且标准的实验流程23。

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结果

S. pasteurii 作为一种嗜碱菌24，能够在相对严苛的条件下存活。按照上述培养方案操作，并将 S. pasteurii 培养于培养室中时，细菌会随时间推移诱导碳酸钙沉淀（图 2A）。图 2(b) 展示了培养基内细菌细胞群体的相差光学显微图像。单个细胞清晰可辨，其杆状形态为芽孢杆菌类细菌的典型特征。图中用小的棕色箭头特别标示出两个单独的细胞。碳酸钙的沉淀过程持续数天。图 2A 显示了沉淀物在离心管底部的沉积情况。肉眼可明显观察到液相下方存在白色粉末状物质，与上方黄色液体形成鲜明的颜色对比。该黄色液体为含有悬浮细菌的培养基。收集白色沉淀物，干燥后通过扫描电镜（SEM）成像（图 2C）。

在图3A中，清晰可辨的解理线——晶体结...

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讨论

关键步骤：本文详细描述了培养活性 S. pasteurii 样本的实验方案。培养物制备完成后，必须进行适当的增殖富集。这是实验成功的关键步骤，因为未能提供合适的化学环境将导致沉淀过程耗时极长，甚至完全无法发生。S. pasteurii 对多种外界因素高度敏感，必须在高度谨慎和精确的条件下进行培养，以确保其生物化学活性的稳定性和实验的可重复性。目前研究已知，富集的程度和剂量会决定沉淀物的化学性质，因此也必须进行精确控制。

修改与故障排除： 多个方面可以进行修改，而对最终结果影响甚微。平板计数不一定必须按照上述方法（即 Miles-Misra 法的系列稀释）进行。此处通过在培养皿底面绘制弦线将其分为七个区域，以实现系列稀释。但此方法并非必需。通常也可采用涂布平板法，即使用整块琼脂平板进行特定稀释度的接种。系列稀释在一系列连续的涂布平板上进行，选择菌落数在可计数范围内（20 - 200）的平板用于最终计算。此处也可应用其他各种细胞计数技术。显微镜观察可使用普通的盖玻片或载玻片进行，计数...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们希望感谢赫尔姆霍兹-阿尔伯塔计划的合作伙伴——赫尔姆霍兹协会和阿尔伯塔大学，感谢他们通过参与此项合作所提供的支持。研究经费由赫尔姆霍兹协会的倡议与网络基金、参与的赫尔姆霍兹研究中心以及阿尔伯塔省政府通过阿尔伯塔环境署的ecoTrust项目提供。

谨向谭舒蕊博士致以诚挚谢意，感谢她在多个关键阶段提供的宝贵意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
培养皿Fisher ScientificFB0875712用作琼脂平板的培养皿
Pyrex 烧瓶Fisher ScientificS63268Corning 锥形瓶
Tris-BasePromegaH5133用于配制 Tris 缓冲液
盐酸Sigma-AldrichH98921.0 N，生物试剂，适用于细胞培养
琼脂粉Sigma-AldrichA1296经微生物检测、植物细胞培养检测和细胞培养检测的粉末
硫酸铵Sigma-AldrichA4418用于分子生物学
酵母提取物粉末Sigma-Aldrich51475
量筒Cole-ParmerCP08559GCCole-Parmer A 级带校准证书量筒，TC 型；1,000 ml，每包 1 个
分析天平OHAUSAX124E用于称量试剂重量
高压灭菌器Brinkmann58619000
高压灭菌指示胶带VWR52428864
铝箔Sigma-AldrichZ185140用于在放入高压灭菌器前密封烧瓶
细菌菌种Cedarlane11859-80 °C 保存的 S. pasteurii 菌种，目录号对应的 ATCC 编号已注明
Mline 单通道机械可调移液器Biohit725010由 VWR 以目录号 14005976 销售
微量移液器吸头Fisher Scientific212772B用于划线琼脂平板
培养箱Binder80079098微生物培养箱，BF 系列
摇床培养箱VWR14004300VWR Signature 台式摇床培养箱
磷酸盐缓冲液 (PBS) Sigma-AldrichP7059
BD Falcon Express Pipet-Aid 移液辅助装置BD Biosciences357590由 VWR 以目录号 53106220 销售
Parafilm 封口膜Sigma-AldrichP7793用于密封琼脂平板
尿素Sigma-AldrichU1250营养培养基的添加成分
碳酸氢钠Sigma-AldrichS8875营养培养基的添加成分
氯化钙Sigma-AldrichC1016营养培养基的添加成分

参考文献

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