比较GTP酶结合蛋白的使用竞争性试验的亲和

Summary

该方案比较了 Rho 家族 GTP 酶（包括 Rac1）的结合伴侣的相对亲和力。在体内，Rac1 结合蛋白竞争单个结合界面，其构象由结合核苷酸决定。由于水解速率高，核苷酸既重要又难以通过实验控制。

Abstract

在这个方案中，我们展示了一种比较 GTP 酶结合蛋白之间竞争的方法。这种方法对于确定 GTP 酶的结合能力很重要，原因有两个：所有相互作用都涉及 GTP 酶的同一面这一事实意味着必须在竞争者的情况下考虑结合事件，并且还必须控制结合核苷酸的事实意味着免疫沉淀等传统方法不适用于 GTP 酶生物化学。该检测依赖于纯化蛋白的使用。固定在磁珠上的纯化 Rac1 用作诱饵蛋白，可以加载 GDP（GTP 的不可水解版本）或保持无核苷酸状态，以便控制要研究的信号转导阶段。通过 GFP 标签从哺乳动物细胞中纯化要研究的结合蛋白，以实现正确折叠。在两种蛋白质上使用相同的标签很重要，因为它不仅可以实现快速纯化和洗脱，还可以在洗脱过程中使用相同的抗体检测两种竞争产品。这意味着可以准确测定两种结合蛋白的相对量。

Introduction

决定哺乳动物细胞形状、极性和迁移特性的肌动蛋白细胞骨架受小 GTP 酶 Rho 家族的调节。Rho 家族 GTP 酶包括刺激细胞骨架收缩的 RhoA、刺激肌动蛋白分支和膜突出的 Rac1 以及对肌动蛋白聚合具有与 Rac1 相似作用并导致丝状伪足形成的 Cdc42 ^1,2。GTP 酶信号转导活性由核苷酸的结合决定，核苷酸控制开关 I 和开关 II 环的收缩和松弛，这些环介导蛋白质与调节因子和效应子的相互作用。鸟苷 5'-三磷酸 （GTP） 结合的 GTP 酶激活下游效应子，而鸟苷 5'-二磷酸 （GDP） 结合形式无活性。在细胞中，GTP 水解和核苷酸交换的循环允许细胞骨架动力学所必需的 GTP 酶信号的快速转换。核苷酸周转受三种机制调节。鸟嘌呤核苷酸交换因子 （GEF） 稳定无核苷酸 GTP 酶，催化 GDP 与 GTP 的交换，从而刺激 GTP 酶信号转导活性 ^3,4。GTP 酶激活蛋白 （GAP） 催化 GTP 水解为 GDP，从而抑制 GTP 酶信号转导活性 ⁵。染色质缩合调节因子 2 （RCC2） 和鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂 （GDI） 等隔离分子会掩盖开关环，在 GDI 的情况下，通过与异戊二烯尾部相互作用从膜中去除 GTP 酶 ^6,7。三类调节分子中的每类都与开关环相互作用，下游效应子和一些运输调节因子（如 coronin-1C ⁷）也是如此。该协议的目的是测量假定的调节因子和下游信号分子之间对开关 I/II 结合位点的竞争。应该注意的是，竞争测定测试与共享结合位点的结合，因此该方案不适用于测试与其他位点的相互作用，例如 GDI 与异戊二烯基尾部的结合。

活性和非活性形式之间构象差异的微妙性，加上结合核苷酸的不稳定性质，使得 GTP 酶结合事件的研究变得困难。结合核苷酸的作用意味着传统的结合测定法（如免疫沉淀或表面等离子体共振）不太适合研究，因为核苷酸无法控制。GEF、GAP、效应子、隔离分子和运输分子的结合位点重叠加剧了这一障碍，这使得在细胞中将发生的竞争背景下难以解释单次相互作用的结合数据。特别是免疫沉淀会受到结合伴侣之间竞争的影响，因为在某些细胞条件下，可能会以牺牲所有其他结合为代价来识别一个结合伴侣，而在其他条件下，另一个伴侣可能占主导地位。GTP 酶信号转导的动态性质对 GTP 酶功能至关重要，在分析不同调节因子的结合相互作用之间的关系时必须考虑这一点。事实上，我们最近描述了一种严重依赖竞争性约束的途径。我们发现 coronin-1C 是一种与 GDP-Rac1 ⁷ 的开关回路结合的运输分子。在 GEF 活动低的地区，贩运将占主导地位，从而将 Rac1 从这些地区移除。然而，当 Rac1 被递送到 GEF 活性高的细胞区域时，GEF 会竞争冠蛋白-1C，从而激活 Rac1 并阻止冠蛋白-1C 介导的 Rac1 从该区域去除。该模型更进一步，因为 GEF 交换的作用将 GDP 与 GTP 结合在一起，从而进一步将平衡从 coronin-1C 转移。因此，Rac1 活性可以完全用竞争和相对亲和力来解释。

在该协议中，我们描述了一种以 Rac1 为例比较小 GTP 酶不同结合伴侣的相对亲和力的方法。通过使用纯化蛋白方法，可以通过成对比较将信号转导事件链拼凑在一起，在可以密切控制结合核苷酸的实验中。

Protocol

1.净化GST标记的GTP酶

1. 文化的E.大肠杆菌菌株如大肠杆菌BL21转化的质粒pGEX-Rac1的O / N在37℃下，振荡以220rpm，在500ml自身诱导培养基（25mM的_磷酸氢二钠，25mM的KH _{2 PO 4，50mM}的_氯化铵 ， 5mM的_用 Na 2 SO _4，2mM的_硫酸镁 ，2毫_氯化钙 ，0.5％甘油，0.05％葡萄糖，0.2％乳糖，5克蛋白胨，2.5克酵母提取物，100微克/毫升氨苄青霉素）。
2. 收获细菌通过离心10分钟以10,000×g离心，4℃。
3. 重悬细菌沉淀在20ml蛋白质提取试剂，1×蛋白酶抑制剂孵育20分钟，在室温将其与倒置。
4. 澄清裂解液离心以40,000×g离心30分钟。
5. 加2ml谷胱甘肽磁珠，用磷酸盐缓冲盐水（PBS:10mM的_磷酸氢二钠，1.8毫KH _{2 PO 4，137} mM氯化钠，2.7毫米氯化钾）。
6. 孵育2小时后，通过倒转在4℃下混合。
7. 用10ml PBS洗涤蛋白加载珠四次，使用磁粉分拣以沉淀珠粒在每一个步骤。
8. 重悬蛋白质装载于2ml PBS中珠和储存在-80℃下在100μl等份直到需要。

GTP酶结合蛋白2的表达

1. 一天实验前，转染的质粒编码绿色荧光蛋白（GFP）-tagged每个GTP酶结合蛋白的版本到一个单独的^75-cm 2的烧瓶HEK293T的如下。对于核苷酸装载的验证，转染GFP标记TrioD1到第三个75厘米²瓶HEK293T的。
   1. 稀释polyethylamine至1mg / ml，在100μl的无菌150mM的NaCl洗涤。
   2. 加入27微升稀释polyethylamine至223微升减少血清的培养基。
   3. 加12微克质粒DNA到250微升减少血清的培养基。
   4. 孵育各管在室温2分钟。
   5. 结合polyethylamine和在单管中，涡旋2分钟的DNA混合。
   6. 下室温温育15-20分钟。
   7. 用5毫升新鲜生长培养基更换生长培养基（Dulbecco氏改良的Eagle介质，10％牛胎儿血清，2mM的L-谷氨酰胺，不含抗生素）上90％汇合的HEK293T。
   8. 将合并的polyethylamine / DNA混合物添加到该烧瓶中，并培育O / N在37℃，5％ _的 CO 2。

3.纯化GTP酶结合蛋白的

1. 冲洗转染的细胞在PBS中的烧瓶和漏极烧瓶5分钟，吸出游离的液体。
2. 刮去细胞在500μl裂解缓冲液（50mM的Tris-HCl（pH7.8），1％​​的Nonidet P-40，1×蛋白酶抑制剂）到微量离心管中。
3. 裂解细胞通过倒置，在4℃下进行30分钟的混合。
4. 在裂解，洗两批40微升GFP-陷阱珠三次新鲜的裂解液，沉淀的珠2,700 XG的洗涤之间2分钟。
5. 澄清的裂解物通过离心21,000×g离心10分钟。
6. 转印澄清每个参赛者的蛋白质分离洗涤GFP-陷阱珠和允许的GFP融合蛋白结合2小时的裂解物，由倒置，在4℃下混合。保持溶胞产物从GFP-TrioD1细胞在冰上。
7. 在50mM的Tris-HCl（pH值7.8），50mM NaCl中洗两次加载GFP-陷阱珠，0.7％（重量/体积）的Nonidet P-40的和两次在50mM的Tris-HCl（pH值7.6），20mM的_MgCl 2的，2,700 xg离心洗涤之间2分钟沉降珠。
8. 通过加入40微升的0.2M甘氨酸（pH值2.5）和移液器上下吹吸30秒洗脱GFP的融合蛋白。立即沙珠在21000 XG为60秒和转让液含有4微升的1M的Tris-HCl（pH值10.4），一个新的离心管中。做到这一点很快，限制损坏纯化蛋白。
9. 分析1微升通过Western印迹和探针用抗GFP抗体每种纯化蛋白的使用定量blott建立相对产量根据制造商的协议的系统上。可替代地，确定的蛋白浓度通过二辛可宁酸（BCA）测定法但这会引入错误，如果蛋白质不与化验反应中以相同的方式或有污染蛋白质。
10. 通过加入50mM的Tris-HCl（pH值7.6），20mM的_MgCl 2的摩尔相等蛋白质浓度。

GTP酶的4核苷酸装

1. 解冻的GST-Rac1的磁珠，在步骤1中制备一个等份。
2. 采取90微升的GST-Rac1的珠和洗涤三次用20mM的Tris-HCl（pH为7.6），25 mM氯化钠，0.1mM的DTT，4mM EDTA的，使用磁性粒子分选器以沉淀珠粒在每一个步骤。
3. 从珠吸缓冲区，并添加100微升20毫米的Tris-HCl（pH值7.6），25毫米氯化钠，0.1毫米DTT，4毫摩尔EDTA。
4. 根据国内生产总值，GTP或没有加载核苷酸是否需要竞争的实验中，加入12微升100毫米的GDP，12微升10毫区anosine 5' - [γ-硫代]三磷酸（GTPγS）或无核苷酸到60微升的GST-Rac1的珠。
5. 对于核苷酸负荷控制，分割剩余的珠串成三个10微升等份，并添加2微升100毫米GDP，2微升10毫米GTPγS或无核苷酸，每管。
6. 孵育珠混合物30分钟，在30℃下搅拌。
7. 稳定通过加入1M _MgCl 2的核苷酸结合的Rac1:3μl到实验混合物（步骤4.4），0.5微升至每个控制混合（步骤4.5）的。

5.竞争结合。

1. 设立了6个离心管，每片含:
   200微升的50mM的Tris-HCl（pH值7.6），20mM的_MgCl 2的
   10微升试验核苷酸加载Rac1的珠（来自步骤4.7）
   5微升Rac1的结合蛋白A（常结合蛋白）
2. 到各管中，加入0,1，2.5，5，10或20微升的Rac1结合蛋白B（可变结合蛋白）。这些卷假设pproximately等于库存浓度恒定和可变结合蛋白的，并可能需要调整。
   1. 调节结合蛋白A和卷乙如果在两种蛋白质的结合亲和力大的差异，这应根据经验通过实验重复来确定。补结合混合物与235微升的总体积通过加入50mM的Tris-HCl（pH值7.6），20mM的_MgCl 2的。
3. 建立含有微量离心管:
   200微升的50mM的Tris-HCl（pH值7.6），20mM的_MgCl 2的
   10微升试验核苷酸加载Rac1的珠（来自步骤4.7）
   10微升Rac1的结合蛋白A（常结合蛋白）
4. 成立了国内生产总值，GTPγS无核苷酸对照管:
   200微升的50mM的Tris-HCl（pH值7.6），20mM的_MgCl 2的
   10微升控制Rac1的珠子装入步骤4.5与GDP，GTPγS或无核苷酸和稳定步骤4.7。
   180微升水中EK293T GFP-TrioD1裂解物，制备如步骤3.6
   4微升1M的_氯化镁
5. 2小时孵育该混合物中，通过倒转在4℃下混合。
6. 用50mM的Tris-HCl（pH值7.6），20mM的_MgCl 2的洗珠三次。
7. 洗脱结合的蛋白于20μl还原样品缓冲液（50mM的Tris-HCl（pH 7）中，5％的SDS，20％甘油，0.02毫克/毫升溴酚蓝，5％β巯基乙醇）。

竞争6.分析

1. 解决将10μl结合蛋白（步骤5.6）的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western印迹。
2. 孵育该膜在4℃的CO / N的抗GFP抗体在封闭缓冲液稀释1/1000稀释于PBS 1倍，0.1％Tween-20的同时检测标记的GTP酶结合蛋白。
3. 10分钟，用PBS，0.1％Tween-20的洗膜三次。
4. 在DyLight孵育膜在室温30分钟800缀合的抗兔秒ondary抗体，稀释1 / 10,000中的封闭缓冲液稀释在PBS，0.1％Tween-20的1倍。
5. 10分钟，用PBS，0.1％Tween-20的洗膜三次。
6. 扫描使用红外成像系统的膜，使用该软件根据制造商的协议来测量带强度。
7. 图中的每个蛋白的带强度对变量的竞争对手（蛋白B）的量。
8. 除以变量竞争者的体积在的点上的线相交由恒定竞争者（蛋白A，5微​​升）的容积，以确定在哪些达到平衡的竞争者比率。
9. 为了验证核苷酸负荷状态，探测膜的按照步骤6.1-6.6中描述的p21激活激酶1（PAK1）（效应）和GFP-TrioD1（全球环境基金）。

Results

这个协议设计为计算Rac1的结合伴侣的相对亲和力，而不需要知道的竞争者的精确浓度（ 图1）。蛋白浓度的测定将错误引入并考虑分子之间竞争时在一个信号通路是不需要的。但是，重要的是要知道，两个竞争者具有相同摩尔浓度的储备溶液，以允许简单的比率来计算的添加不同量的测定时。 40微升的GFP-陷阱珠具有的〜300皮摩尔如此汇合75厘米²烧瓶高度表达细胞将饱和的珠子，其结果是在两个不同的结合蛋白的制剂将是调整前相似的结合能力（图2A）。如果蛋白质之一表示较差，这个问题可以通过纯化蛋白质从细胞中的一个以上的烧瓶被克服。

8（图2B）进行检测。 GEFS优先结合到核苷酸的无GTP酶稳定过渡状态。由于全环基金是丰度低，通常不活跃的，经常涂抹不好，最好是过表达或全球环境基金GEF片段的核苷酸检测无GTP酶。我们经常使用第一张双人同源重奏的，表示为GFP融合（GFP-TrioD1 ^9）（图2B），但任何环基金会工作。结合对GDP加载GTP酶蛋白质是罕见的。我们最近报道RCC2作为一个这样的蛋白^7，占GDP加载可以简单地为宾迪验证纳克既不全球环境基金，也不效应。

从实验的输出将是一个Western印迹描绘绑定到GTP酶两个GFP标记的结合伴侣。通过使用单一抗体来检测两种蛋白质，在该类似量既是竞争对手的结合浓度可被确定，因此，相对亲和力推断。在Rac1的拐蛋白的螺旋桨结构域之间的这种实施例的竞争，coronin-1C（Rac1的结合蛋白A）中，和Rac1的-截存蛋白，RCC2（Rac1的结合蛋白B）证明（图3A）。通过使用coronin-1C螺旋桨（5微升）的恒定体积，并加入RCC2体积增加，我们可以从GFP看到涂抹达到平衡在1.25-2.5微升RCC2（星号）的，这表明RCC2具有更强对于Rac1的比coronin-1C亲和力。通过测量用定量免疫印迹条带的强度，并绘制平均值为每个competitoR，平衡点可以准确地通过识别在该曲线相交（图3B）的卷来计算。

其中一个可能的障碍一个成功的竞争测定法是，如果结合伴侣结合到彼此以及结合Rac1的。在图3A + B我们证明RCC2和coronin-1C的螺旋桨域之间的竞争，而不是全长coronin-1C。之所以使用截短coronin是coronin-1C还通过尾域结合RCC2。当全长coronin-1C滴定针对RCC2，两种蛋白的结合进行检测，由于三元复合物形成，而不是竞争（图3C）。如果竞争的现象发生，一种蛋白质结合会增加，而其他的减少，总的约束GFP融合将保持不变。的情况下一个三元复合物形成，有必要截断GTP酶结合蛋白之一，使得competitors不再进行交互。

图1.工作流程。工作流程来确定使用竞争性试验GTP酶结合蛋白的亲和力的示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2.验证纯化的蛋白质。 （A）纯化 GFP标记的Rac1结合通过蛋白质印迹分析的蛋白质，具有抗GFP探测，以确定两个蛋白的相对产率。这在实验期间类型均衡允许调整两种蛋白质的浓度，以便它们在结合实验匹配。（B）中的GD磷，GTPγS无核苷酸加载GST-Rac1的培养与HEK293T裂解表达GFP-TrioD1和约束绘制了内源性PAK1或过表达GFP-TrioD1检测蛋白质。 请点击此处查看该图的放大版本。

相对蛋白质的图3.蛋白质印迹分析 ，从竞争结合测定结合。实施例输出。（A）中的GDP加载的Rac1中加入5微升的GFP-coronin-1C螺旋桨域和增加的GFP-RCC2的体积滴定，通过Western印迹结合的蛋白质的GFP，与差分检测两种蛋白质的问题被避免和GFP信号报告两个融合蛋白之间的摩尔比。星号表示在eithe竞争比例平衡点的R侧。（B）的来自三个独立实验结合GFP融合蛋白的谱带强度通过定量蛋白质印迹法测定，使用荧光标记的二抗和平均数作图来计算RCC2的量需要以达到平衡。（℃从一个实验，其中Rac1的结合蛋白结合到彼此并形成三元复合物，而不是竞争）实施例输出。 GDP-加载 ​​的Rac1中加入5微升的GFP-RCC2和增加的GFP-coronin-1C全长的体积滴定。在结合的GFP-coronin-1C的增加没有约束的GFP-RCC2的损耗表示三元复合物的形成。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

该协议描述了一种比较小GTP酶结合蛋白对的相对亲和力的方法。关键步骤是制备纯化的GTP酶结合蛋白和GTP酶的核苷酸加载。使用具有相同GFP标签的GTP酶结合蛋白，可以准确测定每个竞争物结合量相似的浓度。使用重组核苷酸负载的GTP酶可以询问GTPase在特定活性条件下的结合特性。此步骤也是最敏感的，因为如果镁条件没有精确维持，核苷酸会水解并从 GTP 酶中分离。

在细胞中，大量的GTP酶结合蛋白与快速的核苷酸更新相结合，使得这些途径难以解释。该方法仅比较成对的结合蛋白并使用仔细控制的核苷酸加载条件，因此可以阐明信号通路。然而，该协议的最大优势也是最大的弱点，因为它是 对体内 情况的简化。竞争测定可用于建立稳健的假设，但随后应通过敲低实验在细胞中进行测试。

在选择用于实验的 GFP 标记的 GTP 酶结合蛋白时，必须考虑三个特征。首先，融合蛋白必须在哺乳动物细胞（例如HEK293T）中表达良好，因为竞争测定需要适量的蛋白质。其次，必须能够在不显着降解的情况下纯化重组蛋白，如果不可能，则应考虑克隆GTP酶结合片段。第三，两种GTP酶结合蛋白必须在SDS-PAGE上相互分离，以便在第6节中进行分析。

该实验有许多潜在的警告需要考虑，并可能得到解决：

在酸洗脱步骤中纯化的GTP酶结合蛋白可能变性或GFP标签的空间位阻。在我们手中，这些都不是问题，但必须进行测试。纯化的蛋白质可以在功能测定 ¹⁰中进行测试。现在存在用于测试 GEF 或 GAP 活性的商业试剂盒，而无需同位素标记的核苷酸。螯合蛋白本质上可以保护GTP酶免受GEF或GAP活性的影响，因此可以在商业GEF或GAP测定中用作竞争性抑制剂，正如我们在最近的出版物 ⁷中所做的那样。运输GTP酶的蛋白质的相关特征是结合GTP酶的能力，这可以在下拉测定中轻松测试。测试适用于所有结合蛋白的蛋白质完整性的另一种方法是用甘氨酸滴定从 GFP 陷阱珠中洗脱的蛋白质，并通过酶切解从 GFP 陷阱珠中去除相同的蛋白质。该实验将通过用针对蛋白质本身的抗体探测 GFP 标记的蛋白质和切割的蛋白质来分析。如果蛋白质未因洗脱而受损，则应以 1：1 的比例达到平衡。这种方法还可以表明GFP标签本身的存在是否会损害候选蛋白的结合特性，尽管这确实需要产生在标签和结合蛋白之间具有酶切割位点的构建体。无论蛋白质受到标签还是洗脱步骤的损害，都可以通过修改方案以使用替代纯化方法来解决问题。结合蛋白可以不是 GFP，而是可以对 His 标记，使用 Ni-NTA 纯化，并使用针对 His 标签的抗体进行分析。重要的特征是两种结合蛋白必须共享一个共同的标签，但如有必要，可以在蛋白质中添加两个标签，一个用于纯化，另一个用于检测。

该协议旨在研究与开关 I/II 域交互之间的竞争。尽管大多数GTPase相互作用是由该基序介导的，但也有一些例外，最显着的是与异戊二烯基尾部结合的GDI的相互作用，以及模糊开关结构域。原则上，该方案可以适应使用从哺乳动物细胞中纯化的GTP酶，从而使GTP酶异戊烯化，但是，多个结合位点的存在或变构效应使竞争结合数据的解释复杂化。与这种修饰相关的其他问题是，GDI与来自哺乳动物细胞的GTP酶共纯化，损害了分离蛋白质的纯度，异戊二烯基团的疏水性质意味着异戊二烯化GTP酶与GDI或脂质膜相关，这些因素需要在实验中考虑。

测定中使用的 GST-Rac1 量。恒定的GTP酶结合蛋白的浓度必须高于Rac1，或者当添加竞争者时，它将简单地与游离的Rac1结合。如果发生这种情况，将立即显而易见，因为在不损失恒定蛋白质的情况下，竞争者的结合将以与两种竞争蛋白质相互结合时大致相同的方式进行检测，如 图 3B 所示。作为附加对照（步骤5.3），应包括含有两倍量恒定结合蛋白且不具有可变结合蛋白的结合反应（步骤5.3）。如果滴定实验中的Rac1是饱和的，则将恒定结合蛋白的量加倍将对输出没有影响。方案中建议的体积应该是适当的，但 Rac1 的量可以很容易地减少。如果观察到竞争者的结合而没有失去恒定的结合伙伴，则在尝试映射结合位点以避免形成三元复合物之前，应尝试减少 Rac1 的量。

GTPase结合蛋白与GST或磁珠的非特异性相互作用，以及与Rac1的特异性相互作用。这个问题将表现为恒定的GTP酶结合蛋白的残留结合，即使可变的GTP酶结合蛋白在高浓度下已经达到平台期。通过进行互易实验来帮助识别这个问题，其中交换恒定和可变的 GTP 酶结合蛋白。倒易实验也会大大提高平衡点估计的准确性，因此应始终包括在内。在非特异性结合的情况下，仍然可以通过比较每种蛋白质的最大值和最小值之间的条带强度来计算达到平衡的相对浓度，或者通过使用 GST 珠子作为诱饵而不是 GST-Rac1 来测量非特异性结合的程度。

应使用不同核苷酸负载条件的下拉测定来补充本协议中描述的竞争测定。确定伴侣的核苷酸偏好对于理解竞争事件和了解GTP酶结合蛋白参与的信号通路都很重要。在 图2B 中，我们分析了蛋白质的结合，这些蛋白质对GTP负载或无核苷酸GTP酶具有既定的偏好，作为验证核苷酸负载的一种手段。然而，研究核苷酸负载对每个竞争对手的影响也是明智的。如果假设的竞争对手表现出不同的偏好，竞争对信号通路的贡献就会减少，事实上，核苷酸周转很可能是指导结合蛋白交换的机制。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugbuster	Novagen	70584-3
COMPLETE 蛋白酶抑制剂	Roche	05 056 489 001
谷胱甘肽磁珠	Pierce	88821
聚乙烯亚胺，支链，平均 Mw ~25,000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Life Technologies	31985-047
Dulbecco's 改良 Eagle Media	Sigma Aldrich	D5796
胎牛血清	Life Technologies	10270-1-6
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	高度不稳定。分装并储存在重新构建
GTP&gamma 后立即在 -80 下;S	Sigma Aldrich	G8634	高度不稳定。重新组装后立即分装并储存在 -80
缓冲液	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
抗 GFP 抗体	Living Colors	632592	以 1/1000 稀释度使用
DyLight 800 偶联山羊抗兔二抗	Fisher Scientific	10733944
抗 PAK1 抗体	Cell Signaling	2602S	在 1/1000 稀释度下使用
Odyssey SA 红外成像系统	Li-cor	9260-11PC