一个快速的表型神经评分系统在ALS的SOD1-G93A小鼠模型评估疾病进展

摘要

该视频协议描述了一种灵敏、可靠且快速的方法，用于评估肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠模型中的神经肌肉缺陷。

摘要

SOD1-G93A 转基因小鼠是肌萎缩侧索硬化症 （ALS） 应用最广泛的动物模型。在 ALS TDI，我们开发了一种表型筛选方案，如本文视频所示，它可以可靠地快速评估 SOD1-G93A 小鼠的神经肌肉功能。该协议包括一个简单的神经学评分系统 （NeuroScore），旨在评估后肢功能。 NeuroScore 侧重于后肢功能，因为后肢缺陷是 SOD1-G93A 小鼠最早报告的疾病神经系统体征。ALS TDI 开发的方案对麻痹的发作（轻微或部分瘫痪）、进展和瘫痪的严重程度进行了公正的评估，并且它足够敏感，可以识别疾病进展中药物诱导的变化。在本报告中，详细的手稿与视频的结合最大限度地减少了评分歧义和实验者之间的差异，从而允许其他实验室采用该协议，并能够在不同环境中进行的研究之间进行比较。我们相信该视频协议可以作为现在和未来 ALS 研究人员的优秀培训工具。

引言

自从它在90年代中期开发的SOD1-G93A转基因小鼠模型已经肌萎缩侧索硬化症^（ALS）1的最广泛使用的动物模型。这种转基因小鼠模型被基因工程化以过表达人铜/锌超氧化物歧化酶1（SOD1）基因携带有ALS相关甘氨酸至丙氨酸的突变在氨基酸93（G93A）的突变体形式。的G93A突变是许多突 ​​变的SOD1基因，它们共同化妆大约五分之一的家族性ALS例²之一。

在SOD1-G93A模式已经成为了ALS药物开发研究的一个主力，因为除了要ALS其明显的遗传链接，这概括了许多ALS在人体内的病理特点，如运动神经元丧失，肌肉逐渐萎缩无力，与最终麻痹而死亡^3。虽然，这是常有用的转基因动物模型的情况下，有一种内在的双向与SOD1-G93A小鼠相关ological变化。 Scott等。已经确定，需要在药物功效的研究设计，以克服由生物变异^{4中创建的}噪声至少24垫料匹配性别平衡小鼠的队列。大量在这些研究中与侵袭性疾病进展和需要日常监测组合需要的动物的禁止使用的精心设计的，耗时的和潜在的压力的技术，用于测量神经肌肉强度和功能（例如，肌电图，握力，旋转棒等）。相反，它强调需要一个体内筛选工具，可靠地评估了一个快速的方式SOD1-G93A小鼠的神经肌肉功能。

在ALS TDI的协议被开发，允许SOD1-G93A小鼠的神经肌肉功能的每只小鼠不到30秒，平均可靠的评估。该协议encompa小规模企业后肢功能的使用是该报告在媒体和视频描述了一个简单的神经评分系统（NeuroScore）每天评估。 NeuroScore专注于后肢功能，因为后肢赤字是最早报道的疾病在SOD1-G93A小鼠^5,6神经的迹象。此外，通过ALS TDI开发的协议提供了发病轻瘫（轻微或局部麻痹），进展和麻痹的严重程度的公正评估，这是不够敏感，以确定在疾病进展的药物引起的变化。

方案

所有实验都按照由卫生指南的国家机构的护理和使用动物的所述的协议进行，并批准了ALS TDI的机构动物护理和使用委员会（IACUC）。

1，动物，房屋和研究设计

注:在SOD1-G93A小鼠菌落从高拷贝B6SJLTgN（SOD1G93A）1Gur应变最初由格尼等⁷产生的派生。菌落目前正在通过杂交的转基因C57BL / 6-SJL雄性野生型C57BL / 6-SJL F1雌性保持。通过杂交SJL雄性与雌性B6产生的F1动物。小鼠被运送到ALS TDI每周在35-45日龄。

1. 允许小鼠至少一周分配给一个研究之前来适应环境的动物设施（12小时亮/暗循环，在18-23℃，40-60％湿度的温度下）。
2. 宅男SOD1-G93A麦克风每笼ê一个鼠标，因为群养的男性往往会打。宅女SOD1-G93A小鼠长达两个每笼。提供丰富环境，塑料小屋的形式。提供食物和水随意，除非小鼠是研究需要药物施用在饮用水/食品的一部分。在这种情况下，理性，记录食物和水。
3. 开始围绕日龄50药物疗效研究，其中包括64产仔匹配的性别平衡的小鼠（每个队列32）。最后，确保在进行研究的研究人员正在失明的实验条件。
   注意:建议，一个典型的药物功效研究开始于年龄天50但是根据治疗介入的可能是优选的启动研究较早或较晚的类型。
   注:研究用32只小鼠的队列通电检测性别特异性药物效果。如果没有性别区分的比较是必需的，每个队列24只应该足以检测药物的整体效果。

2.体重

1. 记录体重为所有小鼠在研究中每天用一克的十分之一的精度。注:体重是任何不适，可能会导致慢性药物治疗的疾病进展和的敏感指标。
2. 小鼠体重变化相当一天的过程中，作为在早晨更高，从而每天大约在同一时间记录下来。

3.神经评分系统（NeuroScore）

1. 评估神经学得分（NS）的每只小鼠每日通过以下三种情况下观察鼠标顺序执行:a）该小鼠是由它的尾巴悬挂，b）该小鼠被允许行走，轻瘫C的发病后）的鼠标放置在其一侧。
   1. 对于悬尾实验，按住鼠标大约1.5"从尾巴在他们的家笼的线顶部的基地1-2秒，远离菜盆，而OBS欧文的后肢。重复测试悬浮液3次，并记录最一致的结果。
   2. 对于行走测试，将鼠标放在一个干净的表面提供了一些牵引力和步行距离25厘米（例如，纸巾贴，以防止打滑）。让鼠标一共75厘米（纸巾的3倍长）边走边观察其步态。
   3. 对于"翻正反射"试验，将鼠标在其左侧或右侧，并用秒表测量才能纠正自己独立站起双方的时间。注:本次测试中仅有一个实验是必需的。
2. 确定每个后肢的NS（左或右）独立地在一个范围从0到4。注意:例如评分为0，1表示左后肢NS为0，而右后肢NS为1。
3. 分配对应的观测（摘要表 1中提供）下面的一组神经学得分（0-4）:
   1. 分配NS 0（预症状）如果符合下列条件:当鼠标的尾巴悬吊时，后肢呈现正常喷射也就是说，它完全伸展远离横向中线和它保持在这个位置上，持续2秒或更长的时间。当鼠标被允许行走，正常步态是观察。
   2. 分配NS 1（首发症状）是否遵守以下规定:当鼠标的尾巴悬挂，后肢呈现异常扇， 也就是说，它被折叠或部分向外侧中线倒塌或在悬尾它颤抖或是缩回/抱住。当鼠标被允许行走，正常或稍缓慢步态是观察。
   3. 分配NS 2（麻痹性痴呆的发病），如果符合下列条件:当鼠标的尾巴悬挂，后肢部分或完全倒塌，很多不延长。 （有可能仍然是关节运动）。当鼠标被允许行走，后肢用于向前MOT然而离子脚趾在一张90厘米的步行向下卷曲至少两次或任何部分的脚的沿笼底/表拖动。当鼠标被放置在它的左侧和右侧，它能够从两侧在10秒内权利本身。
   4. 分配的NS 3（麻痹）如果符合下列条件:当鼠标的尾巴悬吊，有刚性的麻痹的后肢或最小关节运动。当鼠标被允许行走有向前然而后肢不被用于向前运动的运动。当鼠标被放置在它的左侧和右侧，它能够从两侧在10秒内权利本身。注:很少，瘫发病后，尿液中的水分可能会出现在后肢。如果不进行治疗尿水分，可能会导致尿"烧钱"和皮肤损伤。治疗尿水分被裁剪的头发，应用温水浸泡去除尿液，并轻轻擦干。如果皮肤损伤是存在适用antibio抽动软膏。
   5. 指定NS 4（人文终点），如果符合下列条件:当鼠标的尾巴悬挂，有刚性瘫痪在后肢。当鼠标被允许行走，没有向前运动。当鼠标被放置在其左，右手边是不是能够在来自任何一方的10秒权利本身。 也就是说，没有翻正反射。

4.数据录入和分析

1. 期间药效研究的过程中，进入收集每只小鼠成实验室信息管理系统（LIMS）或到市售的表计算软件的数据。
   注:ALS TDI开发的LIMS软件是从内部研究收集的所有数据的中央存储库，使这些数据随着时间的推移ALS TDI研究者方便地访问。 LIMS跟踪任何个人的鼠标，凭借其独特的ID，回到它的血统，体重或神经功能评分在所有研究日，包括在其一生中指出的其他任何意见。 LIMS最终产生其用于后续分析的电子表格。
2. 当完成一个药效研究， 即，当所有的小鼠到达人道终点，使用电子表格软件（见表材料）通过平均在左右后肢的NS来计算合并的NS每只小鼠，每天的。接着，计算平均年龄在每个NS对每个小鼠每只小鼠花费在特定的NS的天数。
3. 通过从电子表格软件导入数据的统计软件分析在一段时间内的NS总体变化（见表材料）。符合这些数据的使用顺序逻辑回归的模型估计预期的NS，中位年龄在NS和药物治疗作为回归的影响。使用对数秩卡方检验估计的影响似然概率，并确定在NS进展的药物治疗效果是否是统计LY显著（见一步一步的指示补充编码文件）。
   注:p值<0.05被认为是统计显著。
   注意:统计分析的该方法尊重的NS数据并向NS轨迹单个小鼠的可变性质的序号性质。这是首选，因为个人NS轨迹可以明显不同导致NS时关联组平均数是不充分的反映NS响应。此外，在某些情况下，NS会波动，特别是当在零到一的范围内。
4. 最后，使用图形软件（见表材料）生成"序预计NS VS平均年龄NS"图表药物治疗组和对照组动物（ 图2，见补充编码文件一步一步的说明）。使用这些图形由y轴插补疾病发作（ 我的年龄中位数为方便评估药物治疗组和对照组之间的变化 。即，NS 2）上x轴。
   注意:在两组中位年龄的差异代表药物引起的移位和被当作效果幅度的实际措施。
   注:在预期NS与年龄中位数曲线表明减缓症状的疾病进展右移。相反，在预期的NS对位年龄曲线向左偏移指示加速症状的疾病的进展。

结果

神经功能评分数据为90男，94女未治疗的SOD1-G93A小鼠就读于ALS TDI在2014年进行了评价。结果表明，雄性小鼠通常具有比雌性小鼠更具侵略性的疾病进展，如由在NS 1的比例更大其寿命相比，女性。 NS 2和NS 3发生跨性别大致相等的频率。 NS 0被从分析中排除，因为它被认为是一个"正常"表型。 NS 4也被排除在外，因为根据定义，它只能出现一次在SOD1-G93A小鼠的生存期（ 表2和图1）。

NS数据从ALS疾病进展药效药理试验化合物TDI173在SOD1-G93A小鼠研究中提出（每组n =性别/治疗16; 64总只小鼠）。在图2中，神经系统疾病进展的速率是作为捕获数据c的顺序回归分析aptured使用本文详述的NeuroScore协议。 TDI173处理的小鼠进行比较，以载体处理的对照。无统​​计学观察显著的差异时，分别进行了分析，但男女两性的时候被合并统计显着性达到。生存的Kaplan-Meier分析，尽管示出了类似的趋势作为有序Logistic统计分析，是不够敏感以揭示显著差异甚至当性别被...

讨论

在这份报告中，我们描述了一个快速和简单的视频协议，如果应用得当，能够可靠地评估SOD1-G93A小鼠的疾病进展和确定药物引起的变化。尽管不同群体开发的表型的评分系统对SOD1-G93A小鼠^8-10，他们往往不提供关于该过程足够的细节和不足进行复制。其结果，评分系统很少使用，开发他们的特定的组之外。在这份报告中，用视频详细手稿组合最大程度地减少评分含糊和跨实验者变异从而允许该协议由其他实验室采用，使研究发生在不同的设置之间的比较。

本报告中称为NeuroScore中所描述的神经评分系统，其中产生的精确值归因于体征和sy的集有序数据mptoms具有超出建立位列疾病的严重程度没有意义。在这种情况下，NS 0是最不严重的疾病状态和表示一个鼠标与正常后肢功能而NS 4是小鼠中最严重的疾病状态或接近发病继发于神经肌肉疾病。尽管评分系统使得采用对症阈值，每个序号NS值涵盖了广泛的其中许多被捕获的视频和本报告中的可能临床表现谱。

NS 1包括的疾病在SOD1-G93A小鼠中的早期症状，其可以有很大的不同，从小鼠到小鼠的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B6SJLTgN（SOD1G93A）1Gur 菌株	杰克逊实验室，巴港，缅因	002726	本研究中使用的小鼠品系
Breeders	Biomedical Research Models， Inc.，伍斯特，马萨诸塞州		菌落维持
量表	导航器 OHAUS，帕西帕尼，新泽西州	型号 N14120	用于称量小鼠
Nutra-GelH	Bio-Serv，新泽西州弗莱明顿	#S4798	湿粮提供给生病的小鼠
辐照实验动物饮食	Harlan，印第安纳波利斯，印第安纳州	2918-111914M	食物饮食
实验室级 Sani-chips	Harlan Teklad，印第安纳波利斯，印第安纳州	7090	床上用品
JMPH	SAS Institute， Inc.， SAS Campus Drive， 卡里， NC	v10.0.2	统计软件
Microsoft Excel	Microsoft， One Microsoft Way， Redmond， WA	Excel 2013 （v 15.0）	电子表格软件
GraphPad Prism 5	GraphPad 软件 Inc.， La Jolla，	CAV5.4	绘图软件
Mouse Huts	Bio-Serv， Flemington， NJ	K3272	用于环境丰富