本视频方案描述了一种敏感、可靠且快速的方法,用于评估肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠模型中的神经肌肉功能缺陷。
方法文章
本视频方案描述了一种敏感、可靠且快速的方法,用于评估肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠模型中的神经肌肉功能缺陷。
SOD1-G93A 转基因小鼠是肌萎缩侧索硬化症(ALS)最广泛使用的动物模型。在 ALS TDI,我们开发了一种表型筛选方案,本视频中对此进行了演示,可快速、可靠地评估 SOD1-G93A 小鼠的神经肌肉功能。该方案包含一个简单的神经系统评分系统(NeuroScore),用于评估后肢功能。NeuroScore 重点关注后肢功能,因为后肢功能障碍是 SOD1-G93A 小鼠疾病最早报道的神经系统症状。ALS TDI 开发的该方案能够无偏倚地评估轻瘫(轻微或部分瘫痪)的发生、瘫痪的进展及严重程度,并且具有足够的敏感性以检测药物诱导的疾病进展变化。本报告结合详细的文稿与视频,最大限度地减少了评分歧义和不同实验人员之间的变异性,从而使其他实验室能够采用该方案,并实现不同研究环境下的研究结果比较。我们认为,该视频方案可作为当前及未来 ALS 研究人员的优秀培训工具。
自20世纪90年代中期问世以来,SOD1-G93A转基因小鼠模型已成为肌萎缩侧索硬化症(ALS)最广泛使用的动物模型1。该转基因小鼠模型经过基因工程改造,可过表达一种携带与ALS相关的第93位氨基酸由甘氨酸突变为丙氨酸(G93A)的人源Cu/Zn超氧化物歧化酶1(SOD1)基因的突变形式。G93A突变是SOD1基因众多突变之一,这些突变 collectively 占家族性ALS病例的约五分之一2。
SOD1-G93A 模型已成为肌萎缩侧索硬化症(ALS)药物研发研究中的常用模型,因为它除了与 ALS 具有明确的遗传关联外,还能重现人类 ALS 的多种病理特征,例如运动神经元丢失、进行性肌无力和肌肉萎缩,最终导致瘫痪和死亡3。然而,与许多转基因动物模型一样,SOD1-G93A 小鼠存在固有的生物学变异性。Scott et al. 研究表明,在药物疗效研究设计中,需要至少包含 24 只同窝出生、性别均衡的小鼠群体,以克服生物学变异性带来的数据噪声4。由于此类研究需要使用大量动物,且疾病进展迅速,还需每日监测,因此无法采用复杂、耗时且可能造成应激的神经肌肉功能检测技术(例如,肌电图、抓力测试、转棒实验等)。相反,这凸显了对一种能够快速、可靠地评估 SOD1-G93A 小鼠神经肌肉功能的体内筛选工具的需求。
在ALS TDI,我们建立了一种方案,可对SOD1-G93A小鼠的神经肌肉功能进行可靠评估,平均每只小鼠的评估时间不到30秒 。该方案包括使用一种简单的神经系统评分系统(NeuroScore)每日评估后肢功能,本报告(已发表)及配套视频中对此进行了详细描述。NeuroScore重点关注后肢功能,因为后肢功能障碍是SOD1-G93A小鼠疾病最早 reported 的神经系统症状5,6。此外,ALS TDI开发的该方案能够无偏倚地评估轻瘫(轻微或部分瘫痪)的发生、瘫痪的进展及严重程度,并且具有足够的敏感性,可检测药物干预引起的疾病进展变化。
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所有实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》所述方案进行,并经ALS TDI机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。
1. 动物、饲养与研究设计
注意:SOD1-G93A 小鼠品系源自 Gurney 等人最初构建的高拷贝 B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur 品系et al. 7。目前该品系通过将转基因 C57BL/6-SJL 雄鼠与野生型 C57BL/6-SJL F1 雌鼠交配来维持。F1 代动物由 SJL 雄鼠与 B6 雌鼠交配产生。小鼠在 35–45 日龄时每周运送至 ALS TDI。
2. 体重
3. 神经系统评分系统(NeuroScore)
4. 数据录入与分析
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对2014年在ALS TDI研究的90只雄性和94只雌性未经处理的SOD1-G93A小鼠的神经功能评分数据进行了评估。结果显示,雄性小鼠的疾病进展通常比雌性小鼠更为迅速,表现为达到NS 1阶段所占寿命比例高于雌性。NS 2和NS 3在不同性别间的发生频率几乎相等。NS 0被排除在分析之外,因其被视为“正常”表型。NS 4也被排除,因为根据定义,其在SOD1-G93A小鼠的一生中仅能出现一次(表2和图1)。
图中展示了在SOD1-G93A小鼠(每性别每处理组n=16,共64只小鼠)中进行的测试化合物TDI173治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)疾病进展的药效学研究中的神经系统(NS)数据。图2显示了通过本文所述NeuroScore方案采集数据并经序数回归分析得出的神经疾病进展速率。TDI173处理组小鼠与溶剂对照组进行了比较。当按性别分别分析时,未观察到具有统计学意义的差异;但当合并性别数据时,达到了统计学显著性。尽管生存率的Kaplan-Meier分析呈现出与序数逻辑回归统计分析相似的趋...
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在本报告中,我们介绍了一种快速且简单的视频实验方案,若正确实施,可稳定评估 SOD1-G93A 小鼠的疾病进展,并识别药物诱导的变化。尽管不同研究团队已开发出针对 SOD1-G93A 小鼠的表型评分系统8-10,但这些系统通常缺乏对操作步骤的充分细节描述,难以被重复使用。因此,这些评分系统很少在最初开发它们的特定研究团队之外得到应用。本报告通过结合详细的书面描述与视频演示,最大限度地减少了评分过程中的歧义以及不同实验人员之间的操作差异,从而使该方案能够被其他实验室采纳,并支持在不同实验条件下开展的研究之间的相互比较。
本报告中描述的神经系统评分系统(称为 NeuroScore)生成的是有序数据,其中赋予各组体征和症状的精确数值仅用于建立疾病严重程度的等级,本身并无其他意义。在此系统中,NS 0 代表最轻的疾病状态,表示小鼠后肢功能正常;而 NS 4 代表最严重的疾病状态,指小鼠已达到或接近因神经肌肉疾病引起的病态。尽管该评分系统采用了症状阈值,但每个有序的 NS 值均涵盖了一系列广泛的可能临床表现,其中许多表现已被视频记录并包含在本报告中。
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作者无任何利益冲突需要披露。
我们谨感谢 Beth Levine 对手稿的审阅,Valerie Tassinari 在基因分型方案开发中的贡献,以及 Matt Ferola 和 Carlos Maya 在动物护理方面提供的卓越支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur 品系 | 美国缅因州巴港杰克逊实验室 | 002726 | 本研究使用的小鼠品系 |
| 种鼠 | 美国马萨诸塞州伍斯特生物医学研究模型公司 | 种群维持 | |
| 电子天平 | 美国帕西帕尼OHAUS Navigator | 型号 N14120 | 用于称量小鼠体重 |
| Nutra-GelH | 美国弗莱明顿Bio-Serv公司 | #S4798 | 为病鼠提供的湿性饲料 |
| 辐照实验动物饲料 | 美国印第安纳波利斯Harlan公司 | 2918-111914M | 标准颗粒饲料 |
| 实验级Sani-chips垫料 | 美国印第安纳波利斯Harlan Teklad公司 | 7090 | 笼具垫料 |
| JMPH | SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC | v10.0.2 | 统计分析软件 |
| Microsoft Excel | Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA | Excel 2013 (v 15.0) | 电子表格软件 |
| GraphPad Prism 5 | 美国拉霍亚GraphPad软件公司 | v5.4 | 绘图软件 |
| 小鼠庇护屋(Mouse Huts) | 美国弗莱明顿Bio-Serv公司 | K3272 | 用于环境丰富化 |
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