人源间充质干细胞（MSCs）免疫调节特性的评估

摘要

人源间充质干细胞（MSC）的免疫调节特性在临床应用中显得愈发重要。通过采用经荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）预标记的MSC与外周血白细胞共培养体系，我们描述了 体外 评估间充质干细胞对效应白细胞增殖及其特定亚群的免疫调节作用

摘要

多谱系人类间充质干细胞（MSCs）的免疫调节特性在多种免疫相关性疾病的临床应用中显得尤为重要。随着相关机制的不断阐明，本文描述了通过检测效应白细胞增殖抑制来评估MSC免疫调节功能的基本实验方法。白细胞增殖可反映其活化状态，可通过多种技术进行检测；本方案中介绍了使用荧光细胞染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记白细胞，并结合流式细胞术分析的方法。该技术不仅能够在无需放射性标记的条件下评估细胞增殖，还可测定细胞分裂次数，并识别特定增殖细胞亚群以及检测细胞内细胞因子或因子的表达水平。此外，在与MSC共培养前，可通过磁珠分选法基于表面标志物富集外周血单个核细胞中的特定亚群，从而定制化地评估特定效应白细胞群体。这种共培养实验方法具有良好的灵活性，适用于研究MSC与白细胞之间的细胞间相互作用。

引言

人类间充质干细胞（MSCs）是体细胞前体细胞，可分化为轴旁中胚层谱系的骨、软骨和脂肪组织^1-4，也可分化为少数中胚层外谱系⁵。这些多谱系前体细胞最初从成人骨髓中分离获得，现已在多种组织中发现^6-8，并意外地表现出强大的免疫调节特性，显示出高度适用于临床应用的潜力^9-12。目前正积极研究其免疫调节作用所涉及的详细机制，以实现对特定疾病的有效应用。评估免疫调节作用最直接的方法之一是检测效应白细胞增殖是否受到抑制¹³。当受到刺激或激活时，大多数效应白细胞（如T淋巴细胞和单核细胞）会大量增殖。当观察到增殖受到抑制时，即可评估其具有免疫调节功能。

传统上，效应白细胞增殖的评估依赖于检测 [³H] 胸腺嘧啶掺入DNA。然而，该方法存在显著缺陷，包括放射性危害、使用后的废弃物处理问题，以及需要复杂的仪器设备。尽管已有非放射性方法可用于评估细胞增殖，但羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）染色法具有其他优势，例如能够识别特定的细胞亚群，这在涉及多种细胞类型的共培养实验中尤为有用。CFSE是一种荧光细胞染料，可通过流式细胞术进行检测。随着细胞分裂，该荧光标记的强度成比例地递减；这不仅可用来确定总体细胞增殖情况，还可评估细胞分裂次数，最多可追踪至第8次分裂，之后荧光信号将因接近背景水平而难以检测。此外，CFSE荧光标记具有良好的稳定性，可用于体内追踪标记细胞，使细胞在体内可视化时间长达数月之久¹⁴。

本实验也可进行调整，以评估特定类型的效应白细胞，或通过在共培养前或共培养后对目标细胞群进行磁珠法表面标志物分选，来评估间充质干细胞（MSC）诱导的免疫调节性白细胞（例如产生白细胞介素-10（IL-10）的CD14⁺单核细胞¹⁵）的免疫调节功能。本方案描述了评估MSC对效应白细胞免疫调节作用的基本实验方法（流程图见图1），以及该基本实验的一种改进方法，用于评估MSC诱导的白细胞对同种异体CD4⁺效应T淋巴细胞的免疫调节作用（流程图见图4）。

方案

必须获得机构审查委员会批准的患者知情同意书，方可使用人体细胞。

1. 人外周血单个核细胞（PBMCs）的密度梯度分离

1. 用25 ml移液管将25 ml肝素抗凝全血加入50 ml离心管中。
   1. 用25 ml磷酸盐缓冲液（PBS）稀释细胞。
2. 向一个新的50 ml离心管中加入15 ml Ficoll-Paque密度梯度液，倾斜离心管，然后非常缓慢且小心地将25 ml稀释后的细胞悬液沿管壁加入，使其覆盖在密度梯度液上方，避免全血与密度梯度液混合。 即，血液密度梯度界面无扰动。
3. 将步骤1.2中的悬液在20 °C条件下，使用温控摆桶转子以400 × g离心30至40分钟，离心过程中不启用刹车。
   注意：离心后应明显出现三层：上层为血浆；下层透明层为Ficoll-Paque密度梯度液；中间一层薄薄的细胞层为外周血单个核细胞（PBMCs）
4. 用巴斯德吸管小心吸去并弃去上层液体，注意不要扰动单个核细胞的中间相层即， 淋巴细胞、单核细胞和血小板。
5. 用10 ml移液管小心收集该单个核细胞层，并转移至新的50 ml离心管中。
6. 加入20 ml PBS至离心管中，充分混匀，于20°C下以300 × g离心10分钟。离心后彻底去除上清液。
7. 将细胞沉淀重悬于20 加入 PBS 1 ml，于 20 °C 下以 200 × g 离心 10–15 分钟。离心后彻底去除上清液。
   注意：此步骤可去除外周血单个核细胞（PBMCs）中不需要的血小板；可重复此步骤以确保血小板完全去除。
8. 若无需选择特定细胞群，可在细胞计数后，将细胞沉淀重悬于白细胞完全培养基（含10%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基）中进行培养¹⁶ 每10个细胞加入1 ml培养基重悬⁷ PBMCs，在进行下一步之前。

2. 白细胞群体的磁性标记（如无需特定群体筛选，则跳至步骤 4）

1. 将PBMC悬液在300 × g下离心10分钟，彻底吸除上清液。
2. 将细胞沉淀重悬于每 10⁶ 个细胞 80 µl 的 PBS 中⁷ 总细胞数
3. 加入20 µl指定的磁珠（即， CD14 磁珠用于单核细胞分离，CD4 磁珠用于T淋巴细胞分离）每10⁷ 总细胞数。
4. 充分混匀，于2至8 °C冰箱中孵育15分钟。
5. 每 10 个加入 1-2 ml PBS⁷ 细胞洗涤，300 × g 离心 10 分钟。
6. 完全吸除上清液，并重悬至最多10⁸ 500 µl PBS 中的细胞

3. 白细胞亚群的磁选法分离

注意：可从多家制造商处获得多种磁珠分离器和柱，用于根据细胞表面标志物从白细胞中分离特定细胞群。分离可通过基于一个或少数几个阳性标志物的阳性选择法，或通过去除不需要的细胞群后的阴性选择法实现。以下概述了使用单一标志物（例如，即 CD4 分离辅助性T淋巴细胞，或 CD14 分离单核细胞）进行阳性选择的一般操作步骤。

1. 按照制造商说明准备并预处理磁性分离器及分离柱。
2. 将含有标记后PBMC样本的管子置于分离装置上。根据制造商说明，准备两个15 ml离心管，用于收集阳性标记细胞和未标记细胞组分。
3. 计数细胞数量¹⁵，并将正向筛选得到的白细胞（即 CD4⁺ T淋巴细胞或CD14⁺细胞）用完全白细胞培养基重悬，每10⁷个细胞使用1 ml培养基。

4. 使用CFSE染色白细胞以评估增殖

注意：CFSE 已广泛用于免疫学研究，适用于体内外两种情况 体内 和 体外 研究。本方案已针对间充质干细胞/外周血单个核细胞（或其他白细胞）相互作用的体外研究进行了优化。尽管进行CFSE体外标记所涉及的总体步骤相似，但具体剂量和操作时间可能有所不同。¹⁴这可能归因于多种因素， 即， 所使用的特定细胞类型、细胞数量——这些因素可能影响CFSE荧光信号的强度。

1. 将CFSE储备液（10 mM）用PBS稀释至所需的10 µM工作浓度（CFSE工作液）。准备10⁷个细胞（即 PBMC或T细胞）用于CFSE工作液标记。
2. 以300 × g离心10分钟，收集细胞沉淀，并吸除上清液。
3. 用1 ml预热（37 °C）的CFSE工作液轻柔重悬细胞，于37 °C孵育10分钟。
4. 为去除多余的CFSE，将细胞悬液用10倍体积的预冷（4 °C）含10% FBS的RPMI培养基稀释。以300 × g离心5分钟沉淀细胞，弃去上清液。按此方法再洗涤细胞沉淀两次。
5. 再次通过离心收集细胞，计数细胞数量¹⁵。将10⁷个细胞（PBMC或T细胞）重悬于1 ml新鲜预热的完全白细胞培养基中。

5. 间充质干细胞与白细胞的共培养及白细胞的活化

1. 将MSC完全培养基（含10% FBS（经预筛选适用于MSC最佳生长）、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的DMEM低糖培养基）预热至37 °C，加热时间不超过30分钟。
2. 在24孔板中，每孔加入1 ml MSC完全培养基，接种50,000个MSC（细胞密度：25,000个细胞/cm²），于37 °C培养箱中过夜培养，使干细胞贴壁并达到80%融合度。
3. 吸除培养基，根据接种的MSC数量，向已培养的MSC（前一日接种于24孔板）中加入CFSE标记的PBMCs（先前已标记——请参见上述步骤4），每孔总体积为1 ml白细胞完全培养基，MSC与PBMC的共培养比例为1:10（细胞比例）。
4. 加入有丝分裂原植物血凝素（PHA）——一种非特异性白细胞激活剂，使其在每孔1 ml白细胞完全培养基中的终浓度为10 µg/ml。
   1. 替代方案：若需特异性激活T淋巴细胞，可使用α-CD3/28磁珠，将其加入双细胞共培养体系中，使磁珠与T淋巴细胞的比例为1:1。
5. 阴性对照组：在24孔板中，每孔仅加入500,000个PBMC（或特定效应白细胞群体；细胞密度：250,000个白细胞/cm²）和1 ml白细胞完全培养基；阳性对照组：除每孔接种相同数量的PBMC外，另加入PHA至终浓度为10 µg/ml。
6. 在共培养实验的第3天和第5天，通过流式细胞术分析（激发波长488 nm，配备适合荧光素检测的发射滤光片）检测CFSE标记的白细胞（置于圆底管中）的增殖情况¹⁷。
   注意：此时也可对这些CFSE标记的白细胞进行胞内细胞因子染色，用于流式细胞术分析，以评估MSC调控下白细胞细胞因子表达谱的变化。由于CFSE需使用适合荧光素的滤光片进行检测，因此用于检测各种细胞因子的抗体应偶联除荧光素或类似光谱（即藻红蛋白、多甲藻叶绿素蛋白复合物（PerCP））以外的荧光染料。

6. 变体：效应细胞抑制实验——经磁珠分选的MSC诱导的免疫调节性白细胞对活化CFSE标记的效应性CD4⁺ T细胞的作用

1. 将MSCs以250,000个细胞接种于3 6孔板中加入MSC完全培养基（MSC密度：25,000个细胞/cm²）²在37 °C培养箱中孵育过夜，使干细胞达到80%融合度。  至少需要3块6孔板，以确保有足够的MSC共培养PBMC用于亚群筛选。 
2. 吸弃培养基，加入按步骤1分离得到的PBMCs 但在6孔板中以2.5 × 10⁶ 细胞/孔（细胞密度：250,000 个白细胞/cm²）²用3 ml白细胞完全培养基重悬，于37 °C培养箱中共同培养48–72小时。
3. 磁珠筛选间充质干细胞诱导的免疫调节性白细胞特定亚群即， CD14⁺ 细胞）按照第2-3节进行操作。
   注意事项：此时可进行细胞内细胞因子染色，用于流式细胞术分析，以评估白细胞细胞因子表达谱的变化。 即， 间充质干细胞调控的白细胞介素-10表达
4. 加入CFSE标记的同种异体CD4⁺ 按照第2-4节在24孔板中生成的T细胞 白细胞完全培养基毫升数（T细胞密度：250,000 个细胞/cm）²) 以不同比例加入磁珠筛选的MSC诱导的白细胞， 即， 1:10、1:5、1:2 和 1:1（细胞与细胞）比例。
5. 为了刺激 CD4⁺ T细胞，加入与α-CD3/28偶联的微珠，使微珠与细胞的比例为1:1。
6. 作为阴性对照，接种 500,000 个 CD4⁺ 24孔板中每孔的T细胞数（T细胞密度：250,000个细胞/cm²）²) 仅加入1 ml白细胞完全培养基；阳性对照组除接种相同数量的CD4⁺ 每孔加入 T 细胞，添加抗 CD3/28 偶联微珠，使微珠与细胞的比例为 1:1。
7. 第3天^rd 共培养当天，评估CFSE标记的CD4细胞的增殖情况⁺ 通过流式细胞术分析置于圆底管中的T细胞¹⁶ 使用488 nm激发光及适用于荧光素的发射滤光片。

结果

图1表示实验的整体示意图，图2展示了通过相差倒置显微镜观察到的不同细胞培养条件下的形态。间充质干细胞（MSCs）为贴壁细胞，呈成纤维细胞样、梭形形态，而外周血单个核细胞（PBMCs）和白细胞则是体积较小的圆形非贴壁细胞。这两种形态不同的细胞类型在共培养体系中可被清晰识别。在实验结束时，当吸取PBMCs（或白细胞）用于流式细胞术分析时，即使意外混入了贴壁的MSCs（例如，由于贴壁不牢或强力吸取导致脱落），也不会影响对PBMC/白细胞组分的评估，因为这些细胞已被CFSE标记。当未发生增殖时，CFSE标记细胞的直方图表现为一个强阳性且尖锐的单峰；然而，当细胞被激活后，增殖现象将表现为多个较小的次级峰，并伴随荧光强度的减弱和向左偏移（图3）。当增殖受到抑制时，即在MSCs共培养条件下，多个次级峰会减少，同时荧光强度增加，表现为峰形向右移动，且代表未分裂细胞的最右侧峰变得更加尖锐。图4表示该实验一种变异方案的整体示意图：评估MSC诱导的免疫调节性白细胞对活化的同种异体效应性CD4⁺ T细胞的抑制作...

讨论

间充质干细胞（MSCs）的免疫调节特性正日益比这些干细胞的多向分化潜能更快地转化为临床应用^18-20。因此，将MSCs与白细胞进行共培养的技术以及评估免疫功能的检测方法，对于进一步阐明这些特性的具体作用机制、优化有效的治疗应用具有重要意义。

这些实验成功最关键的技術環節之一是獲得足夠數量的外周血單個核細胞（PBMC），這取決於肝素抗凝全血樣本的起始細胞數量以及密度梯度分離後PBMC的純度（步驟1.3）。將全血小心地鋪在密度梯度液上，確保全血與密度梯度液之間不發生混合，對於排除紅細胞和血小板至關重要。另一個重要考慮因素是效應白細胞需要充分活化以實現強烈的增殖，否則難以觀察到抑制效應。這不僅取決於細胞純度，還取決於起始人源白細胞的質量，而後者可能受到個體差異、保存方法、採血至實驗的時間間隔以及實驗操作技術水平等多種因素的影響。由於個體差異問題無法避免，因此必須確保樣本數量足夠，包括白細胞供體和間充質幹細胞（MSC）供體的數量，因為MSC為原代分離細胞，以保證結果的有效性。實驗中使用的MSC數量也至關重要，因為在MSC數量極低的情況下，已有文獻報導可能出現免疫活化而...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00 AG	用于分离外周血单个核细胞（PBMCs）的密度梯度介质
Vibrant CFDA-SE 细胞示踪试剂盒（CFSE）	Life Technologies	V12883	用于检测细胞分裂的细胞标记物
植物血凝素（PHA）	Sigma	L8902	人 PBMCs 的活化
Dynabeads 人 T 细胞活化剂 CD3/28	Life Technologies	111.32D	人 T 淋巴细胞活化，例如 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞，等
autoMACS™ 分离仪	Miltenyi Biotec	autoMACS™ Separator	基于磁珠的细胞分离装置
autoMACS® 分离柱	Miltenyi Biotec	130-021-101	分离用柱
CD14 微珠，人	Miltenyi Biotec	130-050-201	用于从 PBMCs 中正向筛选 CD14+ 人单核细胞和巨噬细胞
CD4 微珠，人	Miltenyi Biotec	130-045-101	用于从 PBMCs 中正向筛选 CD4+ 人 T 淋巴细胞
RPMI 1640 培养基	Life Technologies	11875	人 PBMC/白细胞培养基
DMEM，低糖，含丙酮酸钠	Life Technologies	11885	人间充质干细胞（MSC）培养基
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030-081	MSC 完全培养基的补充成分
青霉素/链霉素	Life Technologies	15070-063	PBMC/白细胞及 MSC 完全培养基的补充成分
胎牛血清（FBS）	1) Hyclone，用于 MSC 培养                   2) Life Technologies，用于其他所有细胞（即 PBMCs、特定白细胞亚群）	1) SH30070.03M 2) 10091-148	预测试不同批次以确保支持 MSC 体外 培养
24 孔细胞培养板	Corning	COR3524	共培养板
50 ml 离心管	Corning	430291	使用 Ficoll-Paque PLUS 从全血中分离 PBMCs
15 ml 离心管	Corning	430766	收集标记与未标记的细胞组分
圆底管	BD Falcon	352008	用于流式细胞术分析的细胞收集