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评估深部脑刺激对静脉内甲基苯丙胺自我给药影响的通用方法

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DOI：

10.3791/53266

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2016年1月22日

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1Department of Neurosurgery, Louisiana State University, 2Department of Pharmacology, Toxicology, and Neuroscience, Louisiana State University

本文内容

摘要

本文描述了一种用于治疗静脉注射甲基苯丙胺依赖的颅内电刺激递送方法，该刺激在时间上和空间上均与药物使用环境相分离。

摘要

物质使用障碍，尤其是甲基苯丙胺成瘾，是一种破坏性强、易复发的疾病，对青年人群的影响尤为严重。目前亟需开发新颖、有效且切实可行的治疗策略，并通过动物模型加以验证。神经调节技术，包括脑深部电刺激（DBS）疗法，是指利用电刺激干预病理性神经元活动，在治疗精神疾病（如药物依赖）方面已展现出潜力。临床上的DBS治疗通过植入类似起搏器的系统，由医生体外编程，持续向脑内特定结构输送电刺激以缓解症状。然而，由于甲基苯丙胺使用者常面临复杂的心理社会问题，该疗法的应用将受到限制。相比之下，能够间歇性、非侵入性实施，并可在远离药物使用环境的条件下远程施加的电刺激治疗更具可行性。本文介绍了一种在时间与空间上均与药物使用环境相分离的颅内电刺激递送方法，用于治疗静脉注射（IV）途径的甲基苯丙胺依赖。在啮齿类动物中，可通过操作性条件反射范式下的静脉自我给药模型快速建立甲基苯丙胺依赖，该模型包含一段延长的药物获取期，能够表现出用药行为的逐步升级以及强烈的觅药动机。

引言

甲基苯丙胺是一种精神兴奋剂，由于其急性增加突触单胺类神经递质（尤其是多巴胺），可产生强烈而持久的欣快感。甲基苯丙胺依赖是一种全球性的公共卫生问题，全球使用者估计在2500万至3400万之间，目前尚无确证有效的治疗方法1,2。因此，迫切需要开发针对甲基苯丙胺依赖的新型治疗策略。脑深部电刺激（DBS）是一种神经外科手术，通过使用脑“起搏器”来调节某些疾病（如帕金森病、肌张力障碍和原发性震颤）中异常的神经元放电模式3。近期的人体病例报告提示，DBS也可能对酒精和药物依赖具有治疗效果，但关于精神兴奋剂（例如，可卡因、甲基苯丙胺）的临床前证据仍然有限4-8。

目前实施的持续性深部脑刺激治疗需要患者及其家庭的高度配合。必须进行细致的伤口护理和个人卫生管理，以保护埋藏于皮下的起搏器硬件；即使患者未使用静脉药物导致菌血症，该硬件仍易发生感染。由于该系统采用开环设计，还需定期对深部脑刺激装置进行随访；经验丰富的医生会在常规门诊中调整现代深部脑刺激设备的参数，以减轻目标症状3。然而，由于可卡因和甲基苯丙胺使用者常伴有复杂的心理社会问题，这种治疗模式在该人群中将受到限制。已有若干啮齿类动物研究模拟了这一不切实际的治疗模式，通过在药物使用环境中持续施加深部脑刺激，观察其在可卡因自我给药过程中的作用效果9-11。

无需植入硬件的非侵入性间歇性技术，例如经颅磁刺激（TMS），可能是治疗物质使用障碍的更优选择12。TMS通过外部头线圈非侵入性地传递，在每日间歇性治疗过程中，在特定脑区靶点产生电场。近年来出现的H线圈或“深部”TMS技术，除了皮层位点外，还可刺激更深层的脑结构，从而拓展了其潜在应用范围13,14。这两种疗法均在与主要药物使用环境不同的场所，通过一系列间歇性治疗会话进行，且在人类和啮齿类动物的药物依赖研究中均显示出一定前景13,15-17。治疗甲基苯丙胺依赖患者的时间窗口很可能是在清醒期，例如法院强制的康复阶段，而非街头滥用药物导致暴力或行为异常的暴发期18。因此，本文旨在描述一种在时间和空间上均与药物使用环境相分离的电刺激干预方法，该方法更接近于在人类中实际可行的治疗模式，用于治疗静脉注射甲基苯丙胺依赖。

方案

所有实验程序均经路易斯安那州立大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理原则》进行。

1. 啮齿类动物适应性饲养与食物限制

  1. 使用3月龄的成年Wistar大鼠开始实验。将大鼠单独饲养在配备层流装置和空气过滤器的笼具中，置于温度和湿度受控、经AAALAC认证的动物实验设施内，采用12小时反转光照周期 光照/黑暗循环（光照关闭时间为0600时）。
  2. 自由饮水并饲喂标准啮齿类动物饲料，直至体重达到约380–400 g。随后对大鼠进行食物限制，使其在实验期间维持在自由进食状态下体重的85%至90%，以促进对甲基苯丙胺反应的习得与维持。
  3. 从动物到达之日起至整个实验期间，每天在饲养笼具所在的房间内对啮齿类动物进行抓取操作，以记录体重并调整每日食物供给量。
  4. 达到目标体重后，准备对每只大鼠进行手术，植入慢性留置颈静脉导管和颅内刺激电极。

2. 颈静脉插管

  1. 导管制备
    1. 准备一段长度为13 cm、内径为0.012 × 0.025英寸的硅胶管，在距一端4 cm处使用额外的硅胶管和电灼器制作一个硅胶球，并静置风干。
    2. 将管子的另一端浸入由柑橘提取的柠檬烯基溶剂中数分钟，使其膨胀。将膨胀后的管子连接至一个呈直角弯曲的不锈钢导向套管。
    3. 使用牙科丙烯酸树脂水泥将不锈钢导向套管的弯曲底部固定在一块1英寸见方的生物相容性网状材料上。
    4. 用乙醇和蒸馏水冲洗导管内外，通过管路注入空气以去除残留液滴。室温下过夜干燥。
  2. 无菌操作
    1. 所有手术均应在专用的动物手术室中进行，并采用无菌外科技术。使用高压灭菌器对器械和植入物进行灭菌，并通过在手术台上铺设防水纸并覆盖无菌毛巾来建立无菌区域。
    2. 佩戴无菌手套，在操作过程中将所有器械、植入物和外科纱布保持在无菌区域内。在进行多台手术时，每次操作之间需用酒精棉片擦拭每件器械，随后在干热灭菌珠中处理20秒。
  3. 麻醉
    1. 术前给予大鼠阿托品（硫酸盐） (0.04 mg/kg，皮下注射)，随后给予戊巴比妥钠（20–50 mg/kg，腹腔注射）以实现麻醉。
    2. 手术前立即注射无菌普鲁卡因青霉素G混悬液（75,000单位，肌内注射）和镇痛剂（卡洛芬，5–10 mg/kg，皮下注射；或酮洛芬，2–5 mg/kg，皮下注射），分别用于减少围手术期感染和疼痛。
    3. 通过轻捏动物脚趾检查麻醉深度，若无反应即可开始手术。为双眼涂抹眼用润滑剂。
  4. 手术部位准备
    1. 在大鼠背部肩胛骨连线稍后方剃除一块2 × 2 cm的背侧毛发区域，在右侧颈部下颌骨与胸骨之间剃除一块1 × 1 cm的腹侧毛发区域。
    2. 用酒精棉片擦拭剃毛区域，随后使用聚维酮碘溶液消毒。将大鼠置于无菌毛巾上，待聚维酮碘干燥后再继续操作。
  5. 导管植入
    1. 使用10号刀片在背部肩胛中线区域沿肩胛骨连线平行方向做一切口。使用止血钳分离皮肤与下方结缔组织，形成用于放置网状导管基座的皮下平面。用无菌生理盐水冲洗术区，并用无菌纱布覆盖，在将大鼠翻转为仰卧位前完成此步骤。
    2. 使用10号刀片在右侧下颌骨与胸骨之间做一斜切口。使用止血钳分离皮肤与下方结缔组织以暴露颈外静脉。注意：颈外静脉呈白色/银色、有光泽，在雄性大鼠中比雌性更大。
    3. 将 spatula 置于静脉下方，用4-0丝线轻轻结扎暴露静脉的近端（上方），然后将静脉推回颈部。
    4. 分离结缔组织，在颈部皮肤下外侧浅层肌肉上方创建一个皮下 pocket。将已灭菌的穿刺针从颈部切口经臂后方向背部肩胛切口皮下穿行。将硬质导丝从颈部端插入穿刺针并推进至远端导管，再将导丝从背部拉回颈部切口，带动远端导管随之通过。
    5. 牵拉先前放置的近端结扎线，将右侧颈外静脉提起并置于 spatula 上方。使用球头剪刀在静脉上方做一小段部分切口。
    6. 将弯头镊子插入静脉切口以扩大开口。保持镊子张开并固定位置，将导管尖端从镊子尖端之间插入静脉，推进约2–3 cm，使其末端位于右心房外。
    7. 用4-0丝线结扎远端静脉以固定导管。将近端和远端结扎线打成“方结”以增强稳定性。
    8. 用肝素化无菌生理盐水冲洗导管，并回抽血液以确认植入成功。将结扎线在结节上方1–2 mm处剪断，将剩余的近端导管埋入颈部皮下。使用合适的缝合线或方法关闭切口。  若使用不可吸收缝线或缝钉，需在10–14天后于全身麻醉下拆除。使用无菌棉签涂抹抗生素软膏覆盖切口。
    9. 使用可吸收缝线在网状基座的两个对角处将其远端导管/导向套管/网状组件固定于背部皮下组织。围绕导向套管使用间断、非内翻的可吸收缝线关闭背部切口。使用无菌棉签涂抹抗生素软膏覆盖切口。
  6. 术后护理
    1. 使用3 ml注射器以肝素化0.9%无菌生理盐水冲洗导管，并将堵塞器插入导向套管以防止堵塞。
    2. 每日冲洗每只大鼠的导管以维持通畅性。
    3. 手术后立即将大鼠放回其饲养笼中，置于手术室内的加热垫上，观察直至意识恢复并出现自主活动。
    4. 待大鼠恢复后送回动物房，术后5–7天内避免进行颅内手术。每日称重、抓取并评估其总体状况，包括检查感染迹象以及动物行为、外观和活动水平。
    5. 如出现任何问题，应咨询动物资源中心兽医，并遵循其建议的治疗方案。根据需要注射镇痛剂（卡洛芬，5–10 mg/kg，皮下注射；或酮洛芬，2–5 mg/kg，皮下注射）以缓解围手术期疼痛。

3. 颅内电极放置

  1. 手术准备
    1. 按照第2.2节所述，在无菌条件下进行所有手术。
  2. 麻醉
    1. 将动物放入麻醉诱导舱中，并以1,000 - 2,000 ml/min的流速向舱内输送异氟烷气体，挥发罐设定为5%。
    2. 当动物呈侧卧状态后，将其从诱导舱中取出，并固定于立体定位手术平台上的鼻罩中。将气体通路从诱导舱切换至鼻罩，挥发罐设定为2 - 3%，持续供气。
    3. 根据需要调整挥发罐设置，以维持稳定的呼吸频率，并确保手术期间对刺激无 反应。
    4. 在手术开始前立即给予大鼠无菌普鲁卡因青霉素混悬液（75,000单位，肌内注射）和镇痛剂（皮下注射布托啡诺0.05至0.5 mg/kg），分别用于减少围手术期感染和疼痛。
    5. 通过轻捏动物脚趾以检测麻醉深度，若无反应即可继续操作。同时为双眼涂抹眼用润滑剂。
  3. 手术区域准备
    1. 剃除大鼠头部顶部毛发，并将其头部固定于耳杆中以确保手术过程中头部稳定不动。先用酒精棉片擦拭剃毛区域，再使用碘伏溶液消毒。待碘伏完全干燥后再进行后续操作。
  4. 电极植入
    1. 用镊子夹住耳间略偏前的头皮，使用剪刀横向剪开基底部。此操作将移除颅顶中线区域约1.5 × 1 cm的皮肤。
    2. 使用10号刀片在颅骨膜上做环形切口直至暴露颅骨，再用弯头镊刮除并清除颅骨膜。用无菌生理盐水冲洗术区，用纱布吸除多余血液和盐水，并使颅骨彻底干燥，以便清晰观察包括前囟在内的骨性标志。
    3. 对于双侧手术，将两个双极铂-铱电极分别安装至立体定位手术平台两侧的电极夹持器中。将第一个电极移至前囟上方约1 mm处，记录数字显示屏上显示的前后（AP）和内外侧（ML）立体定位坐标。切勿使电极尖端实际接触颅骨，以免导致电极失效。对另一侧电极重复此步骤。
    4. 根据目标脑区的位置计算最终的AP和ML坐标。将电极移动至该位置，使其尖端刚好位于颅骨上方，读取数字显示屏上的初始背腹（DV）坐标。再根据目标脑区确定最终的DV深度。
      注：本示例中靶向伏隔核壳部，因其已知参与药物摄取行为8，所用立体定位坐标相对于前囟定义如下：
      AP入点坐标 = [前囟处数字显示坐标] + 1.6
      ML入点坐标 = [前囟处数字显示坐标] ± 2.4（右侧/左侧）
      DV深度 = [AP/ML入点处颅骨表面数字显示坐标] - 8.5
    5. 使用永久性记号笔在颅骨表面标记每个电极的预计进入位置。操作过程中切勿碰撞或触碰电极尖端。
    6. 使用圆形金刚砂钻头在每个标记处钻出直径1.4 mm的孔。操作高速钻头时需小心，避免穿透颅骨进入颅腔。颅骨钻开后，使用弯头镊刺破硬脑膜。
    7. 在电极入点后方另外四个位置使用圆形金刚砂钻头钻出直径0.7 mm的孔，用于植入颅骨螺钉。使用手动螺丝刀将四枚规格为0.8（直径）× 3.2（长度）mm的不锈钢螺钉旋入颅骨，中线两侧各两枚。将螺钉牢固旋入颅骨约一半长度，因其将成为未来数周至数月固定颅骨帽的主要支撑结构。
    8. 通过手动旋转控制电极夹持器Z坐标的手轮，将第一个电极缓慢插入脑组织至计算所得的DV深度。旋转速度应控制在约每秒半圈，以防止电极尖端受损。确保电极进入脑组织时尖端不接触钻孔的骨缘。
    9. 使用超级胶水覆盖钻孔及后方螺钉以固定第一个电极，随后覆盖牙科水泥。待该结构完全干燥后，将电极从夹持器中取出。对第二个电极重复插入和固定过程。牙科水泥应填充至皮肤边缘，但不得覆盖皮肤，以免长期导致颅骨水泥帽松动。
  5. 术后护理
    1. 在电极基座上安装两个防尘帽，防止堵塞。
    2. 手术结束后立即将大鼠放回其饲养笼中，并置于手术室内的加热垫上，持续观察直至意识恢复并出现自主活动。
    3. 待动物恢复后送回动物房，实验开始前至少等待五天。每日称重、抓取并评估大鼠的一般状况，包括检查有无感染，以及观察动物行为、外观和活动水平。
    4. 若出现任何异常情况，应及时咨询动物资源中心兽医，并遵循其建议的治疗方案。根据需要给予镇痛剂（皮下注射布托啡诺0.05至1 mg/kg）以缓解围手术期疼痛。由于使用非甾体类镇痛药（如卡洛芬5 - 10 mg/kg，皮下注射；或酮洛芬2 - 5 mg/kg，皮下注射）可能增加颅内出血风险，因此颅内手术围手术期应优先选用布托啡诺。

4. 操作性实验装置

  1. 使用置于隔音箱内的塑料和不锈钢操作式条件反射箱进行行为学实验。
  2. 在每个隔音箱内配备排气扇，以提供通风并产生白噪音，屏蔽外界干扰声音。
  3. 使用个人计算机和行为学软件接口系统来编程实验程序并收集实验数据。
  4. 通用实验设置
    1. 在每个实验箱的一侧壁上安装两个反应杠杆，每个杠杆上方设有刺激灯。将其中一个杠杆设为“活动”杠杆，使其在被按压时产生程序设定的结果。
    2. 编程控制位于活动杠杆正上方的刺激灯，在每次操作式实验期间点亮，表示药物可获得。
    3. 当动物按压活动杠杆时，给予一次甲基苯丙胺输注（0.05 mg/kg/次，溶于100 µl 0.9% NaCl，输注持续2.8秒），同时使对侧壁上的箱灯亮起5秒，且刺激灯熄灭，进入30秒的超时阶段。
    4. 在30秒超时期间，仍记录对活动杠杆的按压次数，但不给予任何程序设定的结果。为完整记录，同时记录对非活动杠杆的按压次数，但其不产生任何程序设定的结果。

5. 静脉（IV）甲基苯丙胺自我给药实验步骤

  1. 一般准备
    1. 尽可能快速而平静地将大鼠放入操作箱中，以尽量减少行为干扰。将不锈钢弹簧 leash 连接到大鼠背部的导管套管上，并连接到操作箱上方悬挂的无泄漏液体旋转接头。
    2. 确保从旋转接头到位于隔音箱外的电机驱动泵中 20 ml 药物注射器之间的连接管路完整无损。为此，将塑料连接管至少推进 ¼ 英寸至金属旋转接头端和药物注射器针头端，使其在适度拉力下不会滑脱。对旋转接头和 leash 组件进行配重平衡，以允许动物相对自由地活动。
    3. 从周一至周五，每天在大致相同的时间进行操作实验。
  2. 习得阶段
    1. 为促进大鼠快速习得静脉注射甲基苯丙胺的自我给药行为，连续四至五天每天进行 6 小时的训练。
    2. 采用固定比率 FR-1 + 30 秒超时强化程序进行训练，即大鼠每按压一次主动杠杆即可获得一次静脉注射甲基苯丙胺，随后进入 30 秒超时期（例如， 在此期间按压任一杠杆均不会产生提示或奖励结果）。注意：这种初始的长期且“容易”的获取机会将使大多数大鼠在不超过一周的时间内建立起显著的药物摄取行为（图 3）。
  3. 维持阶段
    1. 在训练的第二周，从周一至周五每天进行 2 小时的训练，以维持并优化静脉注射甲基苯丙胺的自我给药行为。
    2. 采用固定比率 FR-1 + 30 秒超时强化程序进行训练。
    3. 当连续三个训练阶段中甲基苯丙胺给药次数的总变化小于 10%（图 4），且前 30 分钟内的累积输注次数大于后 30 分钟内的累积输注次数时（图 5），可视为已建立稳定且强烈的行为反应。注意：该标准可确保大鼠在训练开始时形成药物加载模式，表明其已出现成瘾行为19，而非偶然使用。
  4. 训练后处理
    1. 每次训练结束后，将 leash 从大鼠背部断开。用含 800 IU 链激酶的 0.1 ml 0.9% 生理盐水冲洗导管，防止血液凝结。在将大鼠放回饲养笼前，向每个导管套管中插入堵头，以防堵塞。
    2. 在整个实验过程中，每周三在每次实验结束后立即检测导管通畅性。
      1. 准备一支含有肝素化抑菌生理盐水的 3 cc 注射器（配备 22 G 针头），用于检测导管通畅性。将一段 4 至 6 英寸长的塑料管一端连接到针头上，另一端连接到动物背部导管-套管组件的金属接口上。
      2. 注入 0.1 至 0.2 ml 生理盐水以确保液体顺畅流动，然后回抽注射器活塞。若导管通畅，应能轻松冲洗，并可回抽出血液，血液在管路中可见。松开活塞，再注入 0.2 ml 盐水，将所有血液冲洗回导管。
      3. 若无法抽出血液，则从金属接口上移除 3 cc 注射器和管路。
      4. 准备一支含有甲己西妥钠（一种速效麻醉剂）的 1 cc 注射器（配备 22 G 针头），进一步检测导管通畅性。将一段 4 至 6 英寸长的塑料管一端连接到针头上，另一端连接到动物背部导管-套管组件的金属接口上。
      5. 注入 1.5 mg 后迅速将 1 cc 注射器和管路从动物背部的金属接口上移除。重新连接装有肝素化抑菌生理盐水的 3 cc 注射器，并注入 0.1 - 0.2 ml。若动物在 3 秒内失去肌肉张力，则表明导管通畅且功能正常。
  5. 参见补充文件“常见问题”中的“问题排查”部分，了解甲基苯丙胺不良反应、无法建立自我给药行为以及大鼠取出困难的处理方法。

6. 脑刺激装置

  1. 使用10至12个亚克力玻璃箱（12英寸×18英寸×18英寸，宽×高×深）进行DBS实验。在每个箱子的外侧覆盖坚固的不透明纸板，遮住箱子的背面和两侧，以防止大鼠相互观察或产生互动。保持前面的透明面板裸露，以便实验人员在刺激过程中观察动物。
  2. 用半透性面板覆盖箱子的顶部，以防止大鼠逃逸，同时允许空气流通。利用该面板支撑位于每个箱子上方的换向器，以实现啮齿类动物头帽与刺激系统之间的电连接。
  3. 使用能够为多个动物同时提供恒定电流刺激的刺激系统进行DBS实验。该系统应包含用户可编程的数字信号处理器/通信接口、刺激器、刺激器电池组、通道分路盒及配套软件（参见材料清单）。
  4. 使用定制长度的电缆将刺激器的通道端口连接至每个换向器的上部电子基座。注意：所需电缆长度取决于各个实验室的具体情况。这些电缆位于动物活动区域之外，无需用不锈钢弹簧包裹。
  5. 将集电环的下部电子底座通过16英寸长、外覆不锈钢弹簧的电缆与啮齿类动物头帽上植入的电极底座连接。确保电缆长度足以让动物在围栏内任何区域自由活动，且头帽上无明显张力。注意：当大鼠四肢站立时，电缆末端大致位于其头部位置通常即为合适长度。
  6. 脑刺激编程
    1. 使用个人计算机和编程软件来设定刺激参数（例如， 波形、频率、脉宽、刺激间延迟、电流幅度）并采集实验数据。
    2. 使用可视化编程语言，指定每个设备为实现实验终点所需执行的功能，以及将存储和/或实时显示的数据。本项目所运行的指令如图所示。 图1.
    3. 在可视化控制面板中输入所需的频率、脉宽和振幅图2实验开始前。大鼠高频刺激的典型参数与临床人体深部脑刺激所用参数相似：频率为130至180 Hz，脉宽为60至90 msec，电流强度为100至250 μA4,8-10注意：由于啮齿类动物体型较灵长类动物小，因此使用较低的电流。

7. 脑深部刺激术操作步骤

  1. 将大鼠装入箱中时，将旋转连接器的不锈钢弹簧电缆连接到头帽的每个电极基座上。通过在1,000 Hz频率下施加5 μA电流持续2秒，测试每个电极的阻抗。
    1. 如果阻抗小于或等于125 KOhm，则可继续实验，因为电极能够提供有效的治疗性刺激。如果阻抗大于125 KOhm，则应考虑将该动物排除出实验，因其电极的高电阻可能导致电流降低至可能无效的治疗水平。
  2. 让大鼠进行一至两次模拟训练以适应实验环境，在此期间它们将连接电极电缆但不接受任何主动治疗。模拟测试可消除任何非特异性的行为影响。每次模拟训练结束后，立即将大鼠转移至操作箱中进行每日2小时的静脉甲基苯丙胺自我给药实验。
  3. 将大鼠平衡分配为两组：一组为接受主动刺激的实验组，另一组为接受假刺激的对照组，确保两组在基线药物摄入量上无显著差异。
  4. 对啮齿动物组群进行为期5天的每日DBS（深部脑刺激）实验，根据分组情况，每只大鼠每天接受3小时的主动电刺激或无刺激。每次DBS实验结束后，立即将大鼠转移至操作箱中进行每日2小时的静脉甲基苯丙胺自我给药实验。
    1. 在每次DBS实验期间至少观察部分时间段，仔细监测动物，确保刺激未引起明显的行为改变。若在刺激期间或之后出现任何异常行为，应详细记录这些观察结果。注意：本文作者在本研究所描述的实验过程中未观察到显著的行为改变或食物/饮水摄入量的变化。
  5. 根据研究假设，可调整DBS治疗的持续时间、电学参数以及DBS实验与操作行为实验之间的间隔时间。

结果

在放置颈静脉导管和颅内DBS电极后，经过短暂的恢复期，啮齿类动物可成功地被训练来自行给予静脉注射甲基苯丙胺。图3显示，大鼠在药物长时间可及的第2天开始即可习得并逐渐增加甲基苯丙胺的自我给药行为，到第4天每 session 平均达到 168 ± 12 次输注。

大鼠随后被调整为每天2小时的操作式训练时间表，原因有两个：1）防止因持续长时间给药导致的甲基苯丙胺毒性和严重行为改变；2）建立一个相对稳定的反应率，以便通过各种治疗干预手段进行调控。图4显示，在短时给药训练的第二周，每次训练会话中平均总输注次数为75 ± 8，且日间波动通常小于10%。图5表明，随着训练的进行，大鼠对药物的摄取动机逐渐增强，表现为第6天出现“前置给药”（front-loading）的摄取模式，与第1天相比差异明显。一旦该模式形成，其效应在后续的训练会话中基本保持稳定（数据未显示）。

图6显示，在非药物环境中进行双侧DBS干预后，与假刺激组相比，五天中有三天大鼠操作性静脉内甲基苯丙胺自我给药行为显著减少。本研究靶向伏隔核壳部，因其已知参与药物摄取行为8，所用立体定位坐标相对于前囟（AP +1.6，DV -8.5，ML ±2.4）。刺激参数和持续时间主要参考既往关于DBS治疗精神疾病的研究经验8,20,21，但可根据实验者的具体需求进行调整。误差条中等，且并非所有时间点均达到统计学显著性，表明在行为评估中可能存在反应范围的变异性，尽管治疗效应明确。增加每组实验大鼠数量有助于弥补这种自然变异。本实验最初使用了11只动物，其中1只因术后进食不良被实施安乐死，1只因出现癫痫被剔除，另1只因DBS电极故障被排除，最终共纳入8只动物（假刺激组N = 4；主动DBS组N = 4）。通常情况下，每组实验起始时纳入约10至12只大鼠，可确保实验顺利完成。

LabVIEW 仿真框图、迭代数据控制、波形生成、信号处理流程图。

图1. 可视化编程语言。 研究人员使用可视化编程语言（如此处所示示例）设计程序，以在用户设定的参数下同时对多只动物进行脑刺激。请点击此处查看该图的放大版本。

神经信号记录示意图；电生理装置；脉冲幅度、宽度、频率控制。

图2. 可视化控制面板。在实验开始之前，研究人员在可视化控制面板的左侧设定所需的频率、脉宽和刺激强度。此处的刺激参数为：电流强度 200 μA；脉宽 61 msec；脉冲频率 130 Hz。一旦开始刺激，右侧将显示当前电流输出的波形。请点击此处查看该图的放大版本。

输注速率图，时间与会话天数，数据趋势分析，误差线，医学研究。

图3. 静脉注射甲基苯丙胺自我给药的获得。 对总操作性反应（360 分钟）数据进行重复测量方差分析，以每日实验阶段作为重复测量因子。所有 p <0.05 的分析结果被认为具有统计学意义。数据以均值 ± 标准误表示。图中显示了操作性训练前四天每日6小时操作性实验阶段中的甲基苯丙胺总输注次数。+ P <0.05，与第1和第2次实验阶段相比。请点击此处查看该图的放大版本。

时间与输注次数关系图；误差线；5天内的数据分析；科学实验结果。

图4. 静脉注射甲基苯丙胺自我给药的维持。 采用重复测量方差分析（ANOVA）对总操作性反应（120 分钟）数据进行分析，以每日实验阶段作为重复测量因子。所有分析中，p <0.05 被认为具有统计学意义。数据以均值 ± 标准误表示。在操作性训练第二周的每日2小时操作性实验阶段中，甲基苯丙胺总输注次数显示动物表现出稳定但强烈的药物摄取行为。请点击此处查看该图的放大版本。

随时间推移的药物输注量减少；第1天与第6天输注量的折线图比较。

图5. 对药物摄取动机的发展。 在操作性训练的首小时内，每15分钟统计一次操作性反应次数，数据采用重复测量方差分析法进行分析，以每个15分钟时间段作为重复测量指标。所有检验结果中，p < 0.05 被认为具有统计学意义。数据以均值 ± 标准误表示。在操作性训练第1天未见“前载式”（front-loading）模式，但在第二周时该模式逐渐出现，表明对药物摄取的动机增强。+ P < 0.05，与30、45和60分钟时间点比较；++ P < 0.05，与45和60分钟时间点比较；+++ P < 0.05，与60分钟时间点比较。请点击此处查看该图的放大版本。

输注速率比较图表；假刺激与真实DBS对比；为期8天的治疗；包含误差线。

图6. 深部脑刺激对静脉注射甲基苯丙胺自我给药的影响. 对操作性反应第一小时（60 min）的总反应次数数据进行混合方差分析，组间变量为处理方式（DBS vs 假刺激），组内变量为每日实验会话。所有 p <0.05 的分析结果被认为具有统计学意义。数据以均值 ± 标准误表示。双侧术前操作性深部脑刺激在治疗第3、4和7天显著减少了操作性反应前60分钟内的甲基苯丙胺输注次数。+ P <0.05，与假刺激组及基线反应水平相比。每日治疗结束后，反应水平恢复至基线。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

尽管脑深部刺激的确切机制尚未完全阐明，但DBS对运动障碍和精神疾病的有效性可能源于电刺激疗法与不同时间点下多个皮层下及皮层脑区功能之间的动态相互作用6,22-26。虽然非依赖性给予啮齿类动物甲基苯丙胺的方法已有充分描述27,28，但这些方法最适合用于对药物药代动力学和神经化学效应进行独立研究27-29。通过引入对药物的动机因素，操作性静脉内药物自我给药模型非常适合研究DBS等电刺激疗法如何随时间与病理性行为发生相互作用。我们所描述的方法旨在考察在一种环境中实施的DBS对另一种环境中依赖性甲基苯丙胺使用行为的影响。

在我们的静脉注射甲基苯丙胺自我给药实验范式中，包含三个关键步骤：1）在长时间获取阶段快速建立并加剧药物摄入；2）在随后的短时间获取阶段维持稳定且高水平的药物摄入；3）形成药物摄入的前置负荷（front loading）模式。该范式可在2至3周内完成，每次实验使用10至12只大鼠，具有较高的成本效益，且特别适合用于评估深部脑刺激（DBS）的效果，因为使用精神兴奋剂的大鼠头部装置的使用寿命可能有限。与其他包含长时间获取阶段的实验范式类似19,30,31，该方法能够合理模拟某些物质使用障碍的特征；它表现出药物使用的加剧以及在实验早期出现强烈的“药物负荷”行为，这些特征反映了人类对药物的依赖性，而非娱乐性使用19,30。具有长时间静脉注射甲基苯丙胺暴露史的啮齿类动物还表现出认知功能缺陷32、对药物治疗的独特反应33、药代动力学变化34以及神经化学改变35，这些特征相较于仅经历短时间暴露的动物，更接近于患有慢性甲基苯丙胺使用障碍的人类患者。

同样，我们的深部脑刺激操作包含三个关键步骤：1）在一次或两次“模拟”疗程中，使受试者适应深部脑刺激（DBS）环境，包括头部连接装置的固定；2）使用商用系统每日进行间歇性主动刺激；3）DBS断开连接后，将受试者转运至药物使用环境。该实验范式旨在模拟经颅磁刺激（TMS）等非侵入性治疗的过程，而非传统的持续性DBS治疗。如前所述，出于多个原因，用于常见运动障碍疾病的完全植入式、可编程DBS系统3在患有精神兴奋剂依赖的患者中应用可行性较低。相比之下，无需高风险手术及术后护理的间歇性电刺激治疗策略（如TMS）可能更适用于该类患者群体。我们所描述的方法将使研究人员能够开发并优化可在限定时间段内、脱离药物环境实施的治疗策略，以调节与药物相关的行为。已有越来越多的证据表明，根据特定神经生理缺陷设计的短暂颅内电刺激23，或与全身药物治疗联合应用的电刺激36，在治疗结束后数周内仍可对精神疾病及药物相关行为产生持久的积极影响。

在高强度药物使用期间，对初始手术技术的高要求以及对多个手术部位持续护理的需求是本方法的主要局限性。如果静脉导管或深部脑刺激电极失去功能和/或发生感染，大鼠必须退出研究。在独立开展这些操作之前，最好从经验丰富的研究人员处学习严格的无菌技术下的颈静脉导管和颅内电极植入操作。

该操作适用于多种改进和未来研究方向，包括：1）替代性刺激参数（例如，刺激波形、脉冲宽度、频率、强度）；2）其他潜在的治疗性脑区靶点（例如，伏隔核核心、内侧前额叶皮层、中脑、缰核）；3）不同的深部脑刺激（DBS）递送模式（例如，每日DBS递送、每周DBS递送、在操作行为实验前不同时间间隔进行DBS、在习得阶段前进行DBS）；以及或许最具前景的第4）短时程DBS与药物制剂的联合应用，以模拟对特定通路的光遗传学刺激，并产生持久的行为改变36。

披露

作者对本方法学无任何竞争性财务利益。

致谢

由2014-2015年度神经外科研究与教育基金会（NREF）资助项目及路易斯安那州立大学什里夫波特医学院2014年科研资助奖（J.A.W.）支持。感谢S. Harold和C.M. Keller提供的宝贵技术支持与指导。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
啮齿类动物操作箱Med Associates, IncENV-008CTMed Associates Inc. PO Box 319 St. Albans, Vermont 05478 USA 电话: (802) 527-2343
带数字显示控制台的 Kopf 小动物立体定位仪Kopf Instruments型号 940Kopf 电话: 1-877-352-3275 传真: 1-818-352-3275 邮箱: sales@kopfinstruments.net
Z系列 3-DSP 生物放大处理器Tucker Davis TechnologiesRZ5DTucker-Davis Technologies 11930 Research Circle Alachua, FL 32615 美国 电话: 386-462-9622 www.tdt.com
Z系列 32通道刺激器Tucker Davis TechnologiesIZ2-32该软件附带一份手册，介绍如何使用 OpenEx 平台编程实验，可通过以下链接访问：http://www.tdt.com/files/manuals/OpenEx_User_Guide.pdf
用于 IZ2 刺激器的 48 伏锂离子电池组Tucker Davis TechnologiesLZ48-200
用于 PZ5 的 32 通道分路盒Tucker Davis TechnologiesS-BOX_PZ5
多通道神经记录用 OpenEx Ext 软件包Tucker Davis TechnologiesOpenEx
铂铱刺激电极Plastics One IncMS303/8-B/SPC ELECT PT 2C TW .005"Plastics One Inc P.O.Box 21465, S.W. Roanoke, VA 24018, 电话: 540-772-7950
刺激器与换向器之间的 2 通道电缆Plastics One Inc305-441/2 W/ Spring
换向器与电极基座之间的 2 通道电缆Plastics One Inc305-305 W/ Spring
4 通道换向器Plastics One IncSL2+2C 和 SL2+SC/SB

参考文献

  1. Panenka, W. J., et al. Methamphetamine use: a comprehensive review of molecular, preclinical and clinical findings. Drug Alcohol Depend. 129, 167-179 (2013).
  2. United Nations Office on Drugs and Crime. World Drug Report 2014. 14, United Nations. (2014).
  3. Miocinovic, S., Somayajula, S., Chitnis, S., Vitek, J. L. History, applications, and mechanisms of deep brain stimulation. JAMA Neurol. 70, 163-171 (2013).
  4. Muller, U. J., et al. Deep brain stimulation of the nucleus accumbens for the treatment of addiction. Ann N Y Acad Sci. 1282, 119-128 (2013).
  5. Luigjes, J., et al. Deep brain stimulation in addiction: a review of potential brain targets. Mol Psychiatry. 17, 572-583 (2012).
  6. Pierce, R. C., Vassoler, F. M. Deep brain stimulation for the treatment of addiction: basic and clinical studies and potential mechanisms of action. Psychopharmacology (Berl). 229, 487-491 (2013).
  7. Yadid, G., Gispan, I., Lax, E. Lateral habenula deep brain stimulation for personalized treatment of drug addiction. Front Hum Neurosci. 7, 806(2013).
  8. Wilden, J. A., et al. Reduced ethanol consumption by alcohol-preferring (P) rats following pharmacological silencing and deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell. J Neurosurg. 120, 997-1005 (2014).
  9. Guercio, L. A., Schmidt, H. D., Pierce, R. C. Deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell attenuates cue-induced reinstatement of both cocaine and sucrose seeking in rats. Behav Brain Res. 281, 125-130 (2015).
  10. Vassoler, F. M., et al. Deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell attenuates cocaine priming-induced reinstatement of drug seeking in rats. J Neurosci. 28, 8735-8739 (2008).
  11. Friedman, A., et al. Electrical stimulation of the lateral habenula produces enduring inhibitory effect on cocaine seeking behavior. Neuropharmacology. 59, 452-459 (2010).
  12. Gorelick, D. A., Zangen, A., George, M. S. Transcranial magnetic stimulation in the treatment of substance addiction. Ann N Y Acad Sci. , (2014).
  13. Zangen, A. IS 44. Development and applications of deep rTMS in depression and addiction studies. Clin. Neurophysiol. 124, e53(2013).
  14. Alba-Ferrara, L. M., Fernandez, F., de Erausquin, G. A. The Use of Neuromodulation in the Treatment of Cocaine Dependence. Addict Disord Their Treat. 13, 1-7 (2014).
  15. Alba-Ferrara, L., Fernandez, F., Salas, R., de Erausquin, G. A. Transcranial Magnetic Stimulation and Deep Brain Stimulation in the treatment of alcohol dependence. Addict Disord Their Treat. 13, 159-169 (2014).
  16. Amiaz, R., Levy, D., Vainiger, D., Grunhaus, L., Zangen, A. Repeated high-frequency transcranial magnetic stimulation over the dorsolateral prefrontal cortex reduces cigarette craving and consumption. Addiction. 104, 653-660 (2009).
  17. Levy, D., et al. Repeated electrical stimulation of reward-related brain regions affects cocaine but not 'natural' reinforcement. J Neurosci. 27, 14179-14189 (2007).
  18. McKetin, R., et al. Does methamphetamine use increase violent behaviour? Evidence from a prospective longitudinal study. Addiction. 109, 798-806 (2014).
  19. Ahmed, S. H., Koob, G. F. Transition from moderate to excessive drug intake: change in hedonic set point. Science. 282, 298-300 (1998).
  20. Hamani, C., et al. Antidepressant-like effects of medial prefrontal cortex deep brain stimulation in rats. Biol Psychiatry. 67, 117-124 (2010).
  21. Laver, B., Diwan, M., Nobrega, J. N., Hamani, C. Augmentative therapies do not potentiate the antidepressant-like effects of deep brain stimulation in rats. J Affect Disord. 161, 87-90 (2014).
  22. Pascoli, V., Turiault, M., Luscher, C. Reversal of cocaine-evoked synaptic potentiation resets drug-induced adaptive behaviour. Nature. 481, 71-75 (2012).
  23. Gazit, T., et al. Programmed deep brain stimulation synchronizes VTA gamma band field potential and alleviates depressive-like behavior in rats. Neuropharmacology. 91, 135-141 (2015).
  24. Mayberg, H. S., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  25. Heldmann, M., et al. Deep brain stimulation of nucleus accumbens region in alcoholism affects reward processing. PLoS One. 7, e36572(2012).
  26. de Hemptinne, C., et al. Exaggerated phase-amplitude coupling in the primary motor cortex in Parkinson disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4780-4785 (2013).
  27. Segal, D. S., Kuczenski, R., O'Neil, M. L., Melega, W. P., Cho, A. K. Escalating dose methamphetamine pretreatment alters the behavioral and neurochemical profiles associated with exposure to a high-dose methamphetamine binge. Neuropsychopharmacology. 28, 1730-1740 (2003).
  28. Kuczenski, R., Segal, D. S., Melega, W. P., Lacan, G., McCunney, S. J. Human methamphetamine pharmacokinetics simulated in the rat: behavioral and neurochemical effects of a 72-h binge. Neuropsychopharmacology. 34, 2430-2441 (2009).
  29. Kamei, H., et al. Repeated methamphetamine treatment impairs recognition memory through a failure of novelty-induced ERK1/2 activation in the prefrontal cortex of mice. Biol Psychiatry. 59, 75-84 (2006).
  30. Kitamura, O., Wee, S., Specio, S. E., Koob, G. F., Pulvirenti, L. Escalation of methamphetamine self-administration in rats: a dose-effect function. Psychopharmacology (Berl). 186, 48-53 (2006).
  31. Wee, S., Specio, S. E., Koob, G. F. Effects of dose and session duration on cocaine self-administration in rats. J Pharmacol Exp Ther. 320, 1134-1143 (2007).
  32. Rogers, J. L., De Santis, S., See, R. E. Extended methamphetamine self-administration enhances reinstatement of drug seeking and impairs novel object recognition in rats. Psychopharmacology (Berl). 199, 615-624 (2008).
  33. Kufahl, P. R., et al. Attenuation of methamphetamine seeking by the mGluR2/3 agonist LY379268 in rats with histories of restricted and escalated self-administration. Neuropharmacology. 66, 290-301 (2013).
  34. Hadamitzky, M., Markou, A., Kuczenski, R. Extended access to methamphetamine self-administration affects sensorimotor gating in rats. Behav Brain Res. 217, 386-390 (2011).
  35. Le Cozannet, R., Markou, A., Kuczenski, R. Extended-access, but not limited-access, methamphetamine self-administration induces behavioral and nucleus accumbens dopamine response changes in rats. Eur J Neurosci. 38, 3487-3495 (2013).
  36. Creed, M., Pascoli, V. J., Luscher, C. Addiction therapy. Refining deep brain stimulation to emulate optogenetic treatment of synaptic pathology. Science. 347, 659-664 (2015).

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