成年斑马鱼血液检测中的重复采血方法

摘要

在动物研究中，重复采血是必要且重要的。我们建立了一种新颖、非致死且可靠的成年斑马鱼重复采血方法，并将该方法应用于血液生物化学研究，包括葡萄糖代谢的研究。

摘要

重复采血是实验室动物最常用的技术之一。然而，目前尚未建立一种非致死性的斑马鱼采血方案。以往的斑马鱼采血方法均为致死性操作，例如侧体切开、断头和尾部切除。因此，我们开发了一种新型的“重复”采血方法，并在此详细阐述该操作流程。该方法创伤极小，斑马鱼的死亡率极低（2.3%），从而实现了对同一尾鱼进行多次血液采样。最大采血量取决于鱼的体重。根据血红蛋白水平的测定结果，建议重复采血时每次采血量应不超过体重的0.4%（每周一次）或不超过体重的1%（每两周一次）。此外，我们还测定了成年雄性和雌性斑马鱼的血红蛋白、空腹血糖、血浆三酰甘油（TG）和总胆固醇水平。我们还应用该方法研究了饮食诱导肥胖模型中葡萄糖代谢的紊乱情况。该采血方法将适用于多种研究领域，包括葡萄糖和脂质代谢以及血液学研究，从而进一步提升斑马鱼作为人类疾病模型生物的应用价值。

引言

斑马鱼因其器官和遗传特征与人类相似，正日益成为研究人类疾病的重要模型生物^1,2。在发育生物学领域，许多研究已证实斑马鱼与人类在造血³、止血^4,5和髓系造血⁶方面具有显著的相似性。成年斑马鱼也被用于免疫学⁷、神经退行性疾病⁸以及肥胖相关疾病⁹的研究，因为该模式生物与人类疾病中异常的通路具有共通性。对于肥胖及肥胖相关疾病（如糖尿病、肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎和动脉粥样硬化），研究人员已在多种转基因和饮食诱导的肥胖模型中对斑马鱼的血糖和脂质水平进行了系统深入的研究^10-13。

对同一只动物进行多次采血可减少动物使用数量，并降低个体间差异。然而，在斑马鱼等小型动物中，由于其血液总量相对较少且缺乏易于接近的血管，多次采血在技术上具有较大难度。目前已建立多种斑马鱼一次性采血方法，但这些方法均存在各自局限性，包括致死性、伴随的组织损伤以及采血量有限等问题。例如，通过在背主动脉区域做长约0.3 cm的侧向切口，可采集1–5 µl血液⁵。使用剪刀经肩带处断头法可采集5–10 µl血液¹⁰。另一种较为便捷的采血方法是尾部截除法¹⁴。心脏穿刺是同一条斑马鱼进行多次采血的潜在替代方法之一，但该方法获得的血量极微（约50 nl），限制了可开展的分析项目数量¹¹。因此，亟需建立一种新的非致死性重复采血技术，这一技术进步对于使斑马鱼成为人类疾病研究的标准模式生物至关重要。该技术将有助于药理学反应测试、疾病诊断相关的分子生物标志物发现、预后判断，以及对代谢性疾病、退行性疾病和多种恶性肿瘤等各类疾病的监测。

因此，我们建立了一种可对斑马鱼进行连续采血的微创方法¹⁵。本文以可视化方式展示了该操作流程，并提供了该技术的详细实验方案。利用该方法，评估了健康成年斑马鱼血液中多种参数的正常值，包括血红蛋白、空腹血糖和血脂水平。此外，我们还通过在过度喂养实验中监测血糖水平的时程变化，评估了该方法是否适用于需要连续采样的研究。

方案

所有动物实验程序均经三重大学伦理委员会批准，并依据日本动物福利法规《动物福利与管理法》（日本环境省）进行，同时符合国际指南要求。

1. 针头的准备  

注意：所有实验均在麻醉状态下进行，并尽一切努力减少动物痛苦。对于安乐死，将鱼浸入冰水浴中（5份冰/1份水，温度≤4 °C）至少20分钟。

1. 使用拉针仪将外径为 1.0 mm 的玻璃毛细管拉制成玻璃微毛细吸管（图 1A）。
2. 使用精细剪刀斜向剪开吸管尖端（图 1B）。理想的尖端直径应约为 100 – 200 µm（图 1C）。若尖端过细，血液将无法进入吸管。
3. 将肝素溶解于生理盐水中，配制成浓度为 5 mg/ml 的溶液。
4. 将预先剪好的吸管插入吸液管组件的接头端，并将吹嘴含在口中，或连接至橡胶吸球。将吸管尖端浸入肝素溶液中，通过抽吸和吹打溶液对吸管进行肝素化处理（图 1D 和 1E）。
   注意：该吸液管组件已用于斑马鱼精子的冷冻保存¹⁶。较长的橡胶管可防止血液喷入嘴中，在管路中途加装滤器可避免潜在危害。
5. 将肝素化后的吸管置于直径 10 cm 的培养皿中，室温下晾干至少 1 小时。可预先批量制备大量吸管。

2. 麻醉

1. 在小型塑料容器中，将 200 ml 鱼水与 100 µl 2-苯氧基乙醇（2-PE）混合，配制麻醉液。麻醉剂的终浓度为 500 ppm。
   注意！2-PE 具有快速作用。
2. 从循环系统中取出所需数量的鱼（AB 品系）。
3. 使用网将鱼转移至麻醉液中，持续 1–2 分钟（图 1F）。观察鱼逐渐游动，胸鳍水平展开，出现喘气现象，并在 1 分钟内表现出快速的鳃盖运动。
4. 随着时间推移，观察到鱼逐渐侧卧于容器底部并最终停止游动。当鱼停止喘气且鳃盖运动变得缓慢时，即达到外科麻醉水平。此时，鱼已准备好进行采血。
5. 使用捞勺将麻醉后的鱼从 2-PE 溶液中取出，轻轻放置在用麻醉液浸湿的纸巾上（图 1G）。用同样浸有 2-PE 溶液的软纸巾覆盖鱼的头部，以防止眼睛干燥，并用另一张干燥的软纸巾轻轻擦干鱼体表面。

3. 血液采集

1. 将肝素化针头插入吸液管组件（或吸球分配器）的镜筒端，用嘴含住吸液管组件的口含端。
2. 握住鼻锥端和针头，用针尖小心去除干扰的鳞片。以30–45°角将针头插入采血部位。避免刺穿胃肠道（图 1H若使用球形移液器，用拇指和中指按压球部，同时用食指堵住球部尖端的小孔，然后按上述方法插入针头。
   注意：采血部位位于身体纵轴上，肛门后方的背主动脉区域。背主动脉（DA）和后主静脉（PCV）位于脊柱腹侧紧邻处。图2).
3. 当针尖触及脊柱时，开始吸吮吸管组件的嘴吸端。若未见血液上升，可手动轻微移动针尖以促进血液流出。注意，一旦血液开始进入针管，应立即停止晃动，并轻柔吸吮。图1I若使用吸球式移液器，应释放吸球压力以吸取血液。
4. 观察到血液会以搏动方式缓慢进入针内，无需抽吸，这可能是由于动脉血压所致。因此，若针头已正确刺入动脉，则无需抽吸。
5. 在采集到适当体积的血液后停止抽吸。从鱼体移除针头，并用软纸巾按压穿刺部位以止血。观察约10–20秒，直至出血停止。 指压图1J).
6. 止血后，立即将鱼转移至清洁的温水（约 28 °C）水族箱中。通过轻轻将水搅动至鳃部，帮助鱼恢复，直至其开始游动。
   注意：将最多5条采样后的鱼置于2 L的水箱中，并将水箱连接至循环系统以对鱼进行供氧。鱼水中无需添加抗生素。按照常规饲养条件和喂养方式维持鱼的生存环境。
7. 将针头中的血液排出至一片洁净的聚四氟乙烯膜表面图1K).
8. 使用任何市售手持式血糖仪测量血糖（图1L).
   注意：血糖仪采用葡萄糖脱氢酶–黄素腺嘌呤二核苷酸电极，所需样本体积为 0.6 µl。
   1. 将试纸完全插入血糖仪，并直接接触血滴。观察血液自动吸入试纸，5 秒后在显示区域获得血糖结果。记录结果并丢弃试纸。每次测量均需使用新的试纸。
9. （可选步骤）使用移液器准确吸取血液，并将血液转移至微量离心管中，用于后续分析（血红蛋白、甘油三酯（TG）、总胆固醇， 等。）。如有需要，用生理盐水稀释一条鱼的全血。在室温下以680 × g离心血液样品3分钟，收集血浆。将血浆转移至新的离心管中。此时，血浆即可用于生化分析。

结果

这种采血方法对斑马鱼造成的损伤最小（a <1 mm穿刺； 图1J）并且死亡率极低，仅为2.3%。我们检测了单条鱼类可采集血液的最大体积，并评估了其与体重之间的关系（图3)。我们发现，最大采血量与体重呈线性相关（R = 0.813）。从单条鱼（体重 = 1.071 g）采集到的最大血量为 25 µl，最小体积为 1.3 µl 来自一条体重为0.115 g的鱼。这表明采血的最大体积取决于斑马鱼的体重。

采集血液后进行血红蛋白、血糖、TG 和总胆固醇的生化分析（表 1）。选取健康的成年雄性和雌性斑马鱼（4–6 月龄），在采血前禁食 18 小时。生化分析结果显示，两组间血红蛋白（雄性 9.91 ± 0.49 g/dl，雌性 10.02 ± 0.48 g/dl）和 TG（雄性 417 ± 45 mg/dl，雌性 404 ± 35 mg/dl）的正常值差异无统计学意义。然而，雄性组的空腹血糖和总胆固醇水平（分别为 44 ± 3 mg/dl 和 365 ± 18 mg/dl）显著低于雌性组...

讨论

本文介绍了一种从成年斑马鱼中连续采集血液的详细方案。该方法操作简便，我们在实验室中每天常规使用。此采血技术基于将玻璃毛细管针插入斑马鱼的背主动脉。在操作过程中，必须小心避免损伤脊柱，因为脊柱是定位背主动脉的关键解剖标志。减少脊柱损伤有助于提高斑马鱼的存活率。尽管该技术简单且易于掌握，但仍有一些最佳实践可确保较高的成功率和存活率。熟练的研究人员完成整个采血过程（即从步骤2.3至3.6，为斑马鱼离水操作时间）通常需要1–2分钟。在大规模实验中为节省时间，建议采用双人协作方式进行采血。例如，一名研究人员负责采血操作，另一名研究人员则负责处理斑马鱼、实施麻醉以及分析所采集的血液样本（如测定血糖、记录数据或将血液转移至微量离心管中） 等。).

利用该方法，我们证明了无论性别如何，从单条鱼采集的最大血液体积约为其体重的2%¹⁵，这表明斑马鱼的总循环血量高于体重的2%。先前的研究表明，硬骨鱼类（Osteichthyes spp.）和虹鳟（Salmo gairdneri gairdneri）的总血量占体重的1.8–3.8%...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带玻璃丝的玻璃毛细管	Narishige	GD-1	外径 1.0 mm
拉针仪	Narishige	PC-10	用于制备微针
肝素	Wako Pure Chemical Industries	081-00136	用于肝素化处理
吸管管组件	Drummond	2-040-000	用于血液采集
吸头分配器	Drummond	1-000-9000	用于血液采集
2-苯氧乙醇	Wako Pure Chemical Industries	163-12075	用于鱼类麻醉
DRI-CHEM3500V	Fujifilm	-	用于血红蛋白测定
DRI-CHEM 试纸片	Fujifilm	Hb-WII	用于血红蛋白测定
Glutest Neo Super	Sanwa Kagaku Kenkyusho	-	用于血糖测定
Wako L型甘油三酯试剂盒	Wako Pure Chemical Industries	464-44201	用于甘油三酯测定
Wako L型总胆固醇试剂盒	Wako Pure Chemical Industries	460-44301	用于总胆固醇测定
Parafilm M	Alcan Packaging	PM996	用于排出血液