利用去细胞化人真皮生成基因修饰的类器官皮肤培养物

摘要

本文的目的是提供一种全面且详细的方案，介绍如何利用表皮角质形成细胞和去活性的人类真皮生成基因修饰的人类类器官皮肤。

摘要

类器官培养技术能够重建三维微环境，该环境对于细胞间接触以及细胞与基质间的相互作用至关重要，可模拟其功能与生理特性 体内 组织对应物。这一点在类器官皮肤培养中得到了充分体现，后者能够忠实地重现表皮分化与分层程序。原代人表皮角质形成细胞可通过逆转录病毒进行遗传操作，实现目标基因的过表达或敲低。这些经遗传修饰的角质形成细胞可用于在类器官皮肤培养系统中再生人表皮，从而为研究影响表皮生长、分化及疾病进展的遗传通路提供有力模型。本文所述方案介绍了制备去细胞化人真皮以及遗传操作原代人角质形成细胞以生成类器官皮肤培养物的方法。所再生的人皮肤组织可进一步应用于基因表达谱分析、免疫染色、染色质免疫沉淀联合高通量测序等下游实验。因此，构建此类遗传修饰的类器官皮肤培养系统将有助于鉴定在维持皮肤稳态中起关键作用的基因。

引言

人类表皮是一种复层上皮，通过称为基底膜带的细胞外基质与下方的真皮层相连。表皮不仅作为不透水屏障防止水分流失，同时也是抵御外来和有毒物质侵袭机体的第一道防线¹。基底层是表皮最深层，含有表皮干细胞和祖细胞，这些细胞产生分化后代，进而形成表皮其余部分²。随着表皮祖细胞的分化，它们向上迁移，形成第一层分化细胞，即棘层³。在棘层中，细胞启动角蛋白1和角蛋白10的表达，从而为表皮的分化层提供抵抗物理应力的机械强度。当棘层细胞进一步分化时，它们继续向上迁移，形成颗粒层，该层的特征是透明角质颗粒和板层颗粒的形成，以及在细胞质膜下方组装的结构蛋白。随着细胞分化过程的推进，细胞质膜下方的蛋白质相互交联，同时板层颗粒被释放到细胞外，形成富含脂质的屏障，称为角质层⁴。

涉及表皮生长和分化异常的疾病影响约20%的人群⁵。因此，理解这一过程的机制具有重要意义。由于许多此类疾病的表型依赖于细胞-细胞或细胞-基质接触，研究人员已建立了在三维环境中重建人类表皮的类器官培养模型^6-10。这些方法通常涉及将原代或永生化角质形成细胞接种于脱细胞人真皮、Matrigel或胶原等细胞外基质上进行培养。

为了理解在表皮生长和分化中起重要作用的基因调控机制，可通过逆转录病毒载体对角质形成细胞进行遗传操作，以在二维培养中敲低或过表达基因，随后将其重建为三维结构。这些方法已被广泛用于表征参与表皮干细胞和祖细胞自我更新、分化以及向肿瘤进展相关基因的功能^11-21。本文提供了利用逆转录病毒在表皮类器官培养中改变基因表达的详细实验方案。

方案

人体皮肤实验方案严格遵循加州大学圣地亚哥分校研究伦理委员会的指导原则进行。人体皮肤可从废弃的手术样本中获取，或从皮肤库购买（皮肤库列于材料/设备表中）。只要真皮层中的基底膜区蛋白（胶原蛋白/层粘连蛋白）未发生降解，皮肤来源的具体部位或供体年龄对实验结果无显著影响。

1. 脱细胞人真皮的制备

1. 收到人皮肤组织后，将其放入组织培养超净台中解冻（约3-5分钟）。根据皮肤大小，将解冻后的组织置于无菌的一次性50 ml锥形管或125 ml瓶中。皮肤库提供的典型皮肤尺寸为0.75平方英尺。
2. 用含4倍浓度青霉素和链霉素（pen/strep）的1×PBS填充容器至75%体积，剧烈震荡5分钟，然后弃去液体。重复此步骤3次。
3. 最后一次洗涤后，将组织转移至新的试管/瓶中，并加入新鲜的含4倍浓度pen/strep的1×PBS，填充至容器体积的75%。将该混合物置于37 °C的组织培养孵箱中孵育2周，以使真皮与表皮分离。
4. 在无菌条件下，使用镊子将表皮从真皮上剥离。真皮呈完全白色，而表皮的颜色则因供体种族不同而有所差异（图1A）。根据机构关于处理人体组织的规程丢弃表皮。
5. 将真皮放入试管或瓶中，用含4倍浓度pen/strep的1×PBS进行洗涤，每次剧烈震荡5分钟，共洗涤4次。最后一次洗涤后，将真皮转移至含有含4倍浓度pen/strep的1×PBS的新试管/瓶中，于4 °C保存，直至使用。真皮可在4 °C保存长达一年。

2. 遗传修饰原代人角质形成细胞

注意：使用在完全DMEM培养基[DMEM + 10%胎牛血清（FBS）+ 青霉素/链霉素]中培养的嗜双嗜性Phoenix细胞来产生用于感染原代人角质形成细胞的病毒。编码gag-pol和包膜蛋白等蛋白的病毒包装基因已稳定整合到Phoenix细胞基因组中，因此在转染逆转录病毒载体后可实现病毒的产生。Phoenix细胞可实现高效转染，从而产生高滴度的病毒。该包装系统产生的病毒还可感染包括人类在内的多种哺乳动物细胞。

1. 第1天：转染前一天，将Phoenix细胞以每孔800,000个细胞的密度接种于6孔板中，使用完全DMEM培养基。
2. 第2天：转染当天，每孔使用3 µg逆转录病毒载体。将3 µg逆转录病毒载体分装至1.5 ml离心管中。每3 µg载体使用100 µl DMEM加6 µl转染试剂的混合液。在1.5 ml离心管中将6 µl转染试剂与100 µl DMEM混合。（所用逆转录病毒载体列于仪器/材料表中）。
   1. 室温孵育5分钟，然后将106 µl混合液加入预先分装有3 µg逆转录病毒载体的离心管中。混匀后室温孵育30分钟。将此全部混合物逐滴加入Phoenix细胞的各孔中。
3. 第3天：转染后一天，吸除Phoenix细胞的培养基，每孔加入2 ml新鲜完全DMEM培养基。同一天，将原代人角质形成细胞以每孔75,000个细胞的密度接种至6孔板中。使用含抗生素（青霉素/链霉素）的无血清角质形成细胞培养基（KCSFM）培养角质形成细胞。
   注：原代人角质形成细胞为外购获得。细胞可从多家供应商处购买（详见材料/设备表）。
4. 第4天：收集转染后的Phoenix细胞培养上清液，其中含有病毒颗粒。使用注射器将上清液通过0.45 µm滤器过滤（以去除可能污染的Phoenix细胞），每孔角质形成细胞（前一天接种，密度为75,000个细胞/孔；见步骤2.3）加入2 ml滤过上清液。向培养基中加入六甲溴铵（终浓度5 µg/ml），以促进病毒感染过程。病毒滴度约为1 × 10⁷ TU/ml。
   1. 将6孔板在室温下以200 × g离心1小时。离心后，吸除含病毒的培养基，用1× PBS洗涤细胞一次，然后加入KCSFM培养基。
5. 第5天：参照步骤2.4，对同一批角质形成细胞再次进行感染。
   注：若逆转录病毒载体携带可筛选标记，可使用药物筛选角质形成细胞，并扩增用于后续分析或应用，如类器官培养。

3. 建立体外皮肤培养体系

1. 使用实验室中常见的材料组装器官型培养盒，或通过金属加工店定制制作该培养盒（图2A-F）。若使用3.5 cm组织培养板制备此类培养盒，可在无菌条件下，用灼烧法从3.5 cm培养皿盖中央移除一个1.0 cm × 1.0 cm的正方形区域（图2A-B）。
   1. 使用透明指甲油将方形插销固定在培养盒（3.5 cm培养皿盖）底部（图2C）。静置5分钟使指甲油干燥，然后将培养盒翻转，使其依靠方形插销支撑（图2D）。将培养盒放入6 cm培养皿中。
      注：方形插销可从多种艺术与手工用品商店购买。
2. 配制角质形成细胞生长培养基（KGM），其成分为：66% DMEM、22% Ham’s F12、100 单位/毫升青霉素、100 µg/mL链霉素、10% FBS、2.67 µg/mL腺嘌呤、40 ng/mL氢化可的松、10 ng/mL霍乱毒素、4.94 µg/mL胰岛素、5 µg/mL转铁蛋白、1.36 ng/mL三碘甲腺原氨酸（Triiodo-L-thyronine）、10 ng/mL表皮生长因子（EGF）和10 µg/mL盐酸环丙沙星。将培养基通过0.22 µm滤器过滤，4 °C保存备用。
3. 将真皮组织从含4倍青霉素/链霉素的PBS溶液中取出，用KGM洗涤两次，随后在使用前于37 °C条件下孵育两天。
4. 使用手术刀将真皮组织切割为1.5 cm × 1.5 cm大小的片状，然后放置于器官型培养盒上。放置时确保真皮的上表面朝上。真皮上表面即为后续与角质形成细胞接触的一侧（图1B）。
5. 将预切好的真皮组织置于器官型培养盒的方形孔上，确保其上表面朝上（图3A）。
6. 使用镊子将含有真皮组织的整个器官型培养盒翻转（图3B）。将细胞外基质溶液置于冰上解冻。使用注射器和针头按每盒100 µL量吸取细胞外基质溶液。向真皮底部（光泽面）滴加5滴，并轻轻晃动以确保溶液在真皮组织内均匀分布（图3B）。
7. 静置5分钟，使商品化的细胞外基质溶液完全凝固（图3C）。凝固后，用镊子将培养盒重新翻转回原位。向6 cm培养皿中加入4 mL KGM。
8. 将0.5–1×10⁶个经基因修饰的角质形成细胞接种至含有真皮组织的器官型培养盒上（图3D）。
   1. 将0.05%胰蛋白酶4 mL加入10 cm培养皿中，作用5分钟以消化角质形成细胞，随后加入4 mL完全DMEM培养基终止消化。
   2. 使用血细胞计数板计数角质形成细胞，然后以200 × g离心5分钟。将0.5–1×10⁶个细胞（根据可用细胞数量决定）重悬于90 µL KGM中，并将全部细胞接种至真皮组织表面。
      注：在同一实验中，各组真皮组织上接种的细胞数量应保持一致，以确保所观察到的再生表皮厚度差异并非源于起始细胞数量不同。若接种细胞少于5×10⁵个，可能导致表皮分层和分化不良。
9. 每隔一天更换一次器官型培养体系中的KGM培养基。在角质形成细胞接种至真皮组织后1–14天内收获组织。表皮的完全分层与分化通常在第5天后完成。

结果

生成类器官人皮肤的第一步是将表皮从真皮中分离。将皮肤在37 °C条件下用4倍青霉素/链霉素/PBS孵育两周，应可实现真皮与表皮的分离（图1A）。如果表皮与真皮难以分离，则将组织在37 °C条件下用4倍青霉素/链霉素/PBS再孵育一周，然后使用镊子再次尝试剥离。

在脱细胞真皮上再生人类表皮的关键之一是确保将角质形成细胞置于真皮的正确一侧。真皮具有顶部和底部，其顶部是与角质形成细胞接触的一侧。 体内 以及在器官型培养物中的应用。由于真皮底部具有光泽，因此可将其与真皮顶部区分开来（图1B）。如果将角质形成细胞直接置于真皮的底面（有光泽面），表皮将无法正常分化或分层。因此，必须确保在器官型培养盒中，真皮的上表面（无光泽面）朝上。真皮可直接放置于器官型培养盒中（图2A-F）。由组织培养板制成的盒式支架应进行紫外线灭菌，而金属材质的盒式支架可在放置真皮前进行高压灭菌。随后将基因修饰的角质形成细胞接种至真皮上。由于角质形成细胞是以KGM悬浮液形...

讨论

与常用的二维培养细胞以及小鼠模型相比，人类皮肤类器官培养体系在基因操作方面具有诸多优势。二维培养体系缺乏完整组织和器官中存在的三维细胞间以及细胞与细胞外基质之间的相互作用。近期研究还发现，二维与三维培养的皮肤癌细胞之间存在显著差异，其中三维培养的细胞在基因表达上与原发性人类皮肤肿瘤更为相似¹⁶。与小鼠模型相比，人类皮肤类器官培养体系也具有多项优势。小鼠模型构建耗时且成本高昂，且人与小鼠皮肤之间存在若干显著差异，包括组织更新速率以及表皮厚度在小鼠与人类之间的不同⁸。随着CRISPR-CAS等新技术的出现，可对特定基因进行修饰或突变，从而利用类器官皮肤培养体系模拟人类皮肤疾病²³。此外，除本文所述的逆转录病毒基因转移方法外，还可通过多种其他方法在这些细胞中实现基因导入或基因敲低。只要能够实现高效的递送，例如通过高转导效率或药物筛选，该方法即可应用。这些递送方法包括siRNA的核转染、慢病毒、腺相关病毒以及腺病毒递送系统^11,12,24-26。

可以通过向系统中添加不同类型的细胞来改造类器官皮肤培养体...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人皮肤	纽约消防员皮肤库	http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREP	GIBCO	15140-122
双嗜性 phoenix 细胞系	ATCC	CRL-3213
FUGENE 6 转染试剂	Promega	E2691
角质形成细胞培养基（KCSFM）	Life Technologies	17005042
DMEM	GIBCO	11995
Ham's F12	Cambrex	12-615F
FBS	GIBCO	10437-028
腺嘌呤	Sigma	A-9795
霍乱毒素	Sigma	C-8052
氢化可的松	Calbiochem	3896
胰岛素	Sigma	I-1882
EGF	Invitrogen	13247-051
转铁蛋白	Sigma	T-0665
盐酸环丙沙星	Serologicals	89-001-1
电灼器	Bovie Medical Corporation	AA01
Matrigel	Corning	354234
角蛋白1抗体	Biolegend	PRB-149P
方钉	工艺美术商店
人新生儿角质形成细胞	ATCC	PCS-200-010
人新生儿角质形成细胞	Cell Applications	102K-05n
MSCV 逆转录病毒载体	Clontech	634401
LZRS 逆转录病毒载体	Addgene
pSuper.Retro.Puro 逆转录病毒载体	Oligoengine	VEC-PRT-0002
六亚甲基溴化铵	Sigma	H9268-5G