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方法文章

使用光化学血栓技术建立局限性囊膜梗死模型

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DOI：

10.3791/53281

⸱

2016年6月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Science and Engineering, Gwangju Institute of Science and Technology, 2Department of Pathology, Chonnam National University Medical School, 3Departement of Neurosurgery, Presbyterian Medical Center

本文内容

摘要

本文描述了一种囊状梗死的建模技术。我们在此采用了一种改良的光化学血栓法，在术前靶向定位后使用低强度光照。利用该技术，我们建立了具有持续性运动功能障碍的局限性囊状梗死模型。

摘要

白质脑卒中患病率的近期上升迫切需要在该领域开展专门研究。然而，目前缺乏适用于白质脑卒中的合适动物模型，这阻碍了相关研究的进展。本文介绍一种新型方法，可产生局限性的内囊梗死，同时最大限度减少对邻近灰质结构的损伤。我们术前采用腺相关病毒-绿色荧光蛋白（AAV-GFP）进行神经示踪，以确定内囊中前肢区域的躯体定位分布。根据灰质与白质不同的光学特性调节光照强度，可实现对白质的选择性破坏，同时相对保留灰质结构。通过精确定位光-神经界面，可完全破坏内囊中的前肢区域，从而导致显著且持续的运动功能障碍。因此，该技术可产生高度可重复的内囊梗死病灶，并伴随持续性运动功能缺陷。该模型不仅有助于在行为学、神经环路和细胞水平上研究白质脑卒中（WMS），还可用于评估其在开发新型治疗和康复干预措施中的应用价值。

引言

直到最近，研究脑卒中的病理生理机制以及指导新疗法开发时， exclusively 使用的都是“"灰质梗死（GMS）模型"。然而，老年人群中影响皮层下白质的脑卒中发病率日益升高，占所有脑卒中病例的15 - 25%1,2。针对脑卒中的大量研究均采用GMS模型开展，而使用白质梗死（WMS）模型的研究却很少。啮齿类动物的白质含量显著少于人类或灵长类动物，因此更难选择性地定位并破坏白质中的目标区域3。此外，迄今为止尚未开发出能够选择性破坏预定范围白质的高效工具。因此，目前缺乏适用于白质梗死研究的合适模型。

动物卒中模型常被用于监测运动功能恢复的进展，以推动新型康复和治疗方法的开发。理想情况下，应采用一种能够表现出与人类卒中解剖学改变相一致的长期神经功能缺损的动物模型4,5。在此背景下，梗死损伤后运动功能迅速恢复以及脑部广泛受累的情况，在卒中研究中可能并不现实。既往的囊部梗死模型通常通过闭塞颈内动脉或脉络膜前动脉，或将内皮素-1（ET-1）扩散至内囊区域来建立6-9。然而，动脉闭塞需要对血管进行精细解剖，且产生的梗死范围较广，累及内囊，但往往缺乏持续的行为功能缺损。此外，ET-1未能充分扩散以完全破坏内囊后肢，因此导致行为功能缺损较轻或难以持久。

光血栓性梗死模型已被广泛用于在皮层和皮层下结构中产生各种类型的梗死病灶10。该技术包括静脉注射光敏剂后进行局部光照，从而导致小血管内血小板聚集并形成梗死病灶10。光血栓技术已被广泛用于制造灰质梗死（GMS）病灶，但极少用于生成白质梗死（WMS）病灶5,11。对于该技术，玫瑰红染料与光照的联合应用已被证明在破坏靶向结构并引起相应功能缺损方面具有实用性。光血栓技术的关键要素是光照，因为它决定了梗死病灶的大小。光照对灰质和白质的作用效果不同，因为光在白质中的散射程度比在灰质中高出四倍以上12；因此，如果光强度具有足够低的辐照度（<1,140 mW/mm2），则可将光血栓性病灶的扩展范围限制在白质内（i.e., 内囊）。例如，高能量的光可在灰质和白质中均诱导梗死，而低能量的光可能仅在白质中诱导光血栓形成。此外，光能量的穿透深度非常有限。距离光源1 mm以外的位置，约99%的光能量即已衰减13。因此，可以预期，精确定位的低能量光照将仅在白质中诱导光血栓形成，而对邻近灰质的侵袭最小。

本文介绍了一种在啮齿类动物内囊前肢区域制造梗死病灶的新型方法。我们描述了内囊前肢区域的定位方法、光照射技术（包括光的调节与递送）以及梗死病灶的形成过程。此外，还介绍了用于评估内囊模型构建完整性的行为学检测方法。

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方案

所有操作均按照光州科学技术院（GIST）的机构指南进行，并经GIST机构动物护理和使用委员会批准。

1. 损伤前步骤

  1. 利用 AAV-GFP 鉴定内囊中的前肢区域
    1. 按照机构和国家指南饲养并处理Sprague Dawley大鼠（约400 g，11–13周龄）。
    2. 使用适当的灭菌器（蒸汽或等离子体灭菌器）对所有手术器械和电极进行灭菌。使用蒸汽灭菌器时，设置为 121 °C 设定为灭菌30 min，干燥30 min。
    3. 使用氯胺酮盐酸盐（100 mg/kg）和赛拉嗪（7 mg/kg）混合物经肌内注射麻醉动物。通过足趾夹捏检查麻醉深度。维持体温在37.5 ± 0.5 °C 通过动物体下的加热垫。
    4. 使用耳杆和口腔固定器将动物置于立体定位仪中。
    5. 用70%酒精和聚维酮碘溶液清洁并消毒手术部位。在预定颅骨切口区域的头皮下浸润2%盐酸利多卡因，以减轻术中疼痛。
    6. 涂抹兽用眼科软膏以防止眼睛干燥。用无菌巾覆盖动物的手术区域。所有操作均需在无菌条件下进行。
    7. 使用手术刀进行2 cm的颅骨正中切口，并用金属牵开器向两侧牵拉皮肤。用棉签和30%过氧化氢将颅骨表面擦干。
    8. 使用手柄钻在运动皮层前肢区域（前囟后 +2.5，中线左右 ±2.5）钻孔，并用微型刮匙清理路径以便病毒注射。
    9. 解冻 AAV-GFP（2 x 1012 病毒分子数/毫升）置于冰上并上样 1 µl 病毒在其中的 10 µl 注射器。将注射器置于立体定位仪上。
    10. 将针头移至预先制备的孔洞处，并将针头深入硬脑膜1 mm。
    11. 缓慢注射病毒（0.1 µl/min使用高精度微量泵注射，并将针头留置原位额外10分钟，以使病毒充分扩散。
    12. 用生理盐水冲洗手术部位后，使用3-0尼龙缝线缝合伤口；将大鼠从立体定位仪上取下并转移至恢复舱。通过肌肉注射给予酮洛芬（2 mg/kg）以控制术后疼痛。
    13. 维持体温（37 °C使用加热垫，并根据需要通过肌肉注射给予第二代头孢菌素类抗生素（0.1%，1 ml），以及通过皮下注射给予2%盐酸利多卡因。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得使其无人看管。在完全恢复前，应将动物单独饲养。
    14. 经过2至3周恢复后，在通风橱内通过肌内注射过量盐酸氯胺酮（300 mg/kg）对大鼠进行深度麻醉。通过检测无足趾夹捏反应、无脉搏及无呼吸确认动物死亡。将大鼠仰卧位置于通风橱内。
    15. 通过“Y”形切口打开腹腔以暴露胸腔。用止血钳夹闭降主动脉，并刺破大鼠心脏的右心房以引流血液。随后开始向左心室灌注，先以冷的1%多聚甲醛灌注5分钟（10 ml/min），再以4%多聚甲醛灌注30分钟（10 ml/min）。
    16. 使用剪刀将大鼠头部从尸体上取下。沿中线从颈部至鼻部做一剪口，用剪刀或咬骨钳去除颈部肌肉，暴露颅骨。轻柔地分离颅骨和硬脑膜，取出脑组织。
    17. 取出脑组织，将大鼠脑放入盛有4%多聚甲醛的50 ml锥形管中，4℃过夜固定。次日，用1×PBS缓冲液洗涤脑组织3次，随后将其置于30%蔗糖溶液中。
    18. 待脑组织完全沉降至30%蔗糖溶液底部后，将其置于含有OCT包埋剂的冷冻模具中，于-20 °C 在冷冻切片机中，将脑组织按冠状面切成一定厚度的切片 40 μm 以及一个间隔 200 μm.
    19. 采用切片法进行GFP免疫组织化学染色14. 将一抗（绿色荧光蛋白抗体，兔IgG组分，1:200）加入脑切片中，4℃孵育过夜 4 °C. 在第2天nd 第1天，用1% 吐温-20磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤3次，加入二抗（1:500山羊抗兔IgG（H+L）），孵育1小时。用1% PBST缓冲液洗涤载玻片3次。将盖玻片置于脑切片上。
    20. 使用荧光显微镜（激发波长470 nm，发射波长525 nm，放大倍数5X）观察内囊中AAV-GFP转导的轴突。将转导轴突的位置与大鼠脑图谱进行比较15 确定转导轴突的立体坐标
  2. 缺血性囊肿模型建立前光照强度的调整
    1. 光学神经接口的构建
      1. 使用切割钻截取适当长度（4 cm）的带针芯27号脊柱穿刺针。
        注意：切割可能会压扁和损坏脊髓穿刺针尖端；应取出针芯，并打磨脊髓穿刺针尖端以去除压扁部分，保持脊髓穿刺针的内径通畅。
      2. 剥离适当长度（10 cm）的光纤护套125 µm 与一个 62.5 µm 单侧跳线的一根光纤芯
      3. 将未拆卸的光纤插入金属管（外径：3.8 mm，内径：3.3 mm，长度：17 mm）中，然后将金属管夹紧在光纤周围。金属管有助于填充光纤与脊髓穿刺针针座之间的间隙。用压钳在金属管下半段分两次进行夹紧。
      4. 将热固化环氧树脂涂覆于光纤上，并将光纤插入脊髓针中。在针座的空隙处 дополнительно 涂覆环氧树脂。在20分钟内将环氧树脂于 100 °C 用于稳定固定。
      5. 使用金刚石研磨（抛光）片切割并抛光从脊髓穿刺针中伸出的光纤，并对脊髓穿刺针尖端的光纤进行抛光处理。
      6. 将跳线的FC/PC接头连接至绿光激光系统的耦合器，并使用数字式光功率和能量计测量光纤末端的光强。

2. 内囊光栓塞梗死损伤

  1. 使用适当的灭菌器（蒸汽或等离子灭菌器）对所有手术器械和电极进行灭菌。若使用蒸汽灭菌器，设置为121 °C，灭菌30分钟，干燥30分钟。
  2. 通过肌内注射给予动物（约400 g，11–13周龄）盐酸氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（7 mg/kg）的混合物以进行麻醉。通过夹捏足掌检查麻醉深度。使用动物身下的加热垫将体温维持在37.5 ± 0.5 °C。
  3. 使用耳杆和口腔固定器将动物固定于立体定位仪中。
  4. 用70%酒精和聚维酮碘溶液清洁并消毒手术区域。在预定颅骨切口区域的头皮下浸润2%盐酸利多卡因，以减少术中疼痛。涂抹兽用眼膏以防止眼睛干燥。
  5. 在动物体表覆盖无菌手术巾，暴露手术区域。所有操作均需在无菌条件下进行。
  6. 沿中线进行2 cm的颅骨切口，并使用金属牵开器向两侧牵拉皮肤。用棉签和过氧化氢干燥颅骨。
  7. 调节鼻夹高度，直至前囟（bregma）和后囟（lambda）处于同一水平面。关键步骤：此对齐对于准确到达深部结构至关重要，例如在主要实验中对内囊进行梗死损毁操作。
  8. 使用钻头在目标位置（直径：2 mm；前后向：前囟后-2.04 mm；左右向：中线±3.0 mm）钻孔，以诱导光化学血栓形成。
  9. 抛光并清洁光学接口的光纤尖端。将ONI固定于立体定位仪上，避免弯曲。在插入和拔出光学接口前后，检查ONI尖端并彻底擦拭干净。
  10. 在将光学接口插入大鼠脑部目标区域前，测量光纤尖端的激光强度。根据术前步骤确认，将光纤尖端的激光强度调节至3.5 mW。
  11. 通过钻孔将ONI插入内囊目标区域（根据术前步骤确认深度为-7.8 mm）。
  12. 在光化学血栓形成过程中，维持体温在37.5 ± 0.5 °C。体温过低可能导致梗死范围未达预期。通过尾静脉注射玫瑰红B（2 ml/kg）。
  13. 在注射玫瑰红B后1分钟开启532 nm绿色激光，持续照射90秒。照射结束后，轻柔地将ONI从脑组织中取出。清洁手术区域后，使用3-0尼龙缝线缝合伤口；将大鼠从立体定位仪中取出，并转移至恢复舱。
  14. 对于假手术组（SOG），执行与上述相同的损毁操作，但注射生理盐水（0.2 ml/100 g）代替玫瑰红B。
  15. 术后使用加热垫维持体温（37 °C），并通过肌内注射给予抗生素（第二代头孢菌素，0.1%，1 ml）。在动物恢复足够意识以维持胸卧位前，不得无人看护。术后动物在完全恢复前不得放回其他动物所在的笼具中。
    注意：初步实验采用相同步骤，测试1 mW至5 mW范围内的最佳光强，不同条件下可能需要调整该程序以获得满意的损毁范围。

3. 囊膜梗死病灶的评估

  1. 行为学测试与动物分组
    1. 按照Whishaw所述方法执行单颗粒抓取任务 等14 在卒中建模后每天评估前肢运动功能障碍，持续1周。在食物限制动物（对照组体重的90%）中进行单颗粒抓取任务（SPRT），使用透明聚甲基丙烯酸甲酯箱（Plexiglas，30 cm × 15 cm × 35 cm 高），箱体前壁中央设有宽1 cm的狭缝，并在前方中部设置食物架。
    2. 将一粒食丸斜向放置于偏好前肢对侧的食物架上。每次训练给予20粒食丸，持续3周。
      注：成功的单个前肢伸取次数（SPRTs）定义为动物抓取食物颗粒后将其送入嘴中且未掉落的次数。
    3. 根据以下公式，将得分计算为成功抓取次数的百分比：
      Success rate formula: (Number of successful reaches x 100) / 20. Mathematical expression.
      注意：我们将动物分为3组：假手术组（SOG）、中等恢复组（MRG）和不良恢复组（PRG）。如果卒中后SPRT评分 >50%，则将大鼠归类为MRG组，表明存在显著的病灶，但靶区并未完全破坏。若卒中后SPRT评分 <与卒中前SPRT评分相比下降50%，则将该组归类为PRG，表明靶区完全损毁。
  2. 脑组织学确认梗死病灶
    1. 用4%多聚甲醛进行心脏灌注，步骤如前所述。待脑组织完全沉入30%蔗糖溶液后，进行冠状面切片，厚度为 10 µm 以及一个间隔 200 µm 使用切片机或冷冻切片机4.
    2. 用H染色&E，尼氏染色、Luxol 快蓝-PAS、神经丝蛋白-L 或胶质纤维酸性蛋白染色，观察组织学结果，以确定能够覆盖目标区域中内囊全宽的最佳光照强度，用于观察染色情况4,17.
    3. 使用 ImageJ 软件测量脑切片中内囊区光栓塞性梗死灶的体积。
      1. 为测量梗死区域的体积，启动“ImageJ”软件。选择“图像转堆栈”（“Image” → “Stacks” → “Image to Stacks”）以打开待堆叠的文件。编辑文件名后，选择“设置比例尺”（“Analyze” → “Set the Scale”）以编辑比例尺。
      2. 在“插件”中，选择“测量堆栈”以计算图像的体积或面积。将两张图像间的距离间隔填入“切片间距”。对所有图像的感兴趣区域（ROI）进行勾画，然后点击“测量”。
        注意：软件“ImageJ”会自动计算每张图像的面积和体积，以及它们的总体积。

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结果

  本文所述方法旨在制造一个局限性的内囊梗死灶，并产生持续的运动功能缺损。因此，在术前步骤中准确定位内囊内的靶点至关重要。目前，锥体束纤维在内囊中的躯体定位图谱尚未完全明确。为了正确识别内囊内的靶区，必须首先界定前肢代表区。通过将 AAV-GFP 注射至运动皮层的前肢区域，可示踪内囊中锥体束纤维的轴突路径 （图 1）。其他神经示踪剂，如生物素化葡聚糖胺（BDA），也可用于相同目的。通过追踪起源于运动皮层前肢区并投射至内囊的轴突通路，可明确内囊内靶点的立体定位坐标。

脑切片组织学分析；标注的解剖结构；显微镜图像显示海马体、VL、IC、CPu。
图1. 注射AAV-GFP后2周在内囊中鉴定前肢运...

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讨论

本文介绍的内囊梗死模型表现出靶向性病灶，并伴有显著且持续的前肢运动功能障碍。以往的皮层下内囊卒中模型所表现出的运动功能障碍程度不足，且恢复过程较快6,8,9 。从这一角度来看，该模型更接近临床内囊梗死病例，能够模拟长期存在的功能障碍。

建立局限性囊膜梗死模型最关键的步骤包括：1）准确定位内囊中拟使其功能失活的身体部位的躯体定位区域；2）确定绿色激光的最佳强度，以在最小侵及邻近灰质结构的前提下，完全破坏内囊的整个横径；3）将光纤准确放置于目标结构中。尽管所介绍的技术能够以较高的可重复率（>70%）诱导出局限性囊膜梗死模型，但靶向位置的微小差异以及内囊全横径破坏程度的不完全一致，可能导致不同的运动功能缺损表现。

皮质脊髓束位于人类内囊后肢的后半部分，尽管其躯体定位组织仍存在争议15。相比之下，目前尚无针对啮齿类动物内囊躯体定位组织的等效分类或详细阐明。由于缺乏对躯体定位组织的认识，常导致在内囊中产生梗死损伤时靶点选择错误，从而在不同内囊梗死模型中出现不同的运动结果。然而，我们观察...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了医学系统工程研究所（iMSE）资助项目的支持 & GIST-加州理工学院合作基金（K04592）（由GIST提供）以及韩国科学、信息通信技术与未来规划部资助的韩国国家研究基金会基础科学研究中心项目（NRF-2013R1A2A2A01067890）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
直流温度控制器WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC.ATC1000
数字式立体定位仪STOELTING CO.51900
电刺激器CyberMedic Corp.EMGFES 2000
环氧树脂 Precision Fiber Products, INC.PFP-353ND1混合比例：
10(A):1(B-固化剂)，按重量计 
固化程序：
1 分钟 @150 °C
2 ~ 5 分钟 @120 °C
5 ~ 10 分钟 @100 °C
15 ~ 30 分钟 @80 °C
光纤刻划刀 THORLABS, INCS90R
光纤跳线KOREA OPTRON Corp.外径：3 mm
Ø200 µm
数值孔径：0.39
FC/PC-FC/PC
1 m
激光电源CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD.MGL-FN-532nm-200mW-14010196
压接环 DAWOOTECH CO.,LTD.长度：19 mm
内径：3 mm
外径：3.8 mm
材料：SUS
Micro4微量注射泵控制器WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC95100
光功率计THOLABS, INCPM100D
金刚石研磨（抛光）片THORLABS, INCLF3D粒度：3 µm
金刚石研磨（抛光）片THORLABS, INCLF6D粒度：6 µm
玫瑰红SIGMA-ALDRICH CO. LLC.330000
带铅笔尖端的脊髓麻醉针（脊髓穿刺针） B.BRAUN MELSUNGEN AG 4502027规格：27 G
长度：88 mm
针径：0.40 mm
防水砂纸 DEERFOS CO.,LTDCC261粒度：1,000 µm
Nanofil 10 µl 注射器WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INCNANOFIL
Nanofil 33 G BVLD 针头WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INCNF33BV-2
AAV-GFP 病毒UNC Vector CoreAAV2-CamKIIa-eYFP2 × 1012 病毒分子/mL
抗绿色荧光蛋白抗体，兔IgG组分Life Technologies, INCA11122一抗（1:200）
羊抗兔IgG（H+L）Life Technologies, INCA11034二抗（1:500）
头孢替唑GUJU Pharma CO.,LTD.A278027410.1%，1 mL
盐酸利多卡因注射液JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD.A049002712%，1 mL
手持式钻机Seshin
数字式光功率与能量计THORLABS, INCPM100D
酮洛芬UNIBIOTech

参考文献

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