外切囊梗死模型使用光化学技术

摘要

这份手稿描述囊梗塞的建模技术。在这里，我们利用与手术后前目标映射光的低强度改良光化学技术。使用这种技术，我们创造了持续性运动障碍外接囊梗死模型。

摘要

最近白质中风患病率的增加需要在该领域进行专门研究。然而，缺乏相关的白质中风动物模型阻碍了研究调查。在这里，我们描述了一种创建局限性包膜梗死的新方法，该方法可以最大限度地减少对邻近灰质结构的损伤。我们使用腺相关病毒绿色荧光蛋白 （AAV-GFP） 的术前神经示踪来识别内囊内前肢区域的体位组织。根据灰质和白质的不同光学特性调整光强度有助于在灰质相对保留的情况下选择性破坏白质。视神经接口的准确定位可以破坏内囊中的整个前肢区域，从而导致明显且持续的运动缺陷。因此，该技术会产生高度可复制的包膜梗死病变，伴有持续的运动缺陷。该模型不仅有助于在行为、回路和细胞水平上研究白质中风 （WMS），还有助于评估其对开发新的治疗和康复干预措施的有用性。

引言

直到最近，"灰质行程（GMS）模型"已经被专门用来了解中风的病理生理机制，并指导新治疗方法的发展。然而，出现了行程的患病率增加，影响在老年个体，这构成15皮层下白质-所有笔划^1,2的25％。大量的研究已经进行使用GMS模型对中风，而有一些已经使用白质行程（WMS）模型的研究很少。在啮齿类动物中白质比在人类或灵长类白质基本上更少。因此，更难以在脑白质³选择性地访问和破坏靶区域。此外，没有有效的工具已经被开发迄今为止为选择性地破坏的靶向白质的计划的程度。因此，一直存在缺乏脑白质笔划研究适当的模型。

动物ST洛克模型经常用于监测马达恢复的新康复和治疗方法的发展的进展。它是理想的，利用表现出一个长期的神经功能缺损一致与人类中风^4,5展示了解剖改变的动物模型。在这方面，马达赤字和脑以下梗塞损毁的广泛参与快速恢复可能不追求中风研究的现实的。以前荚膜梗塞模型已被制成由内皮素-1（ET-1）的内部颈动脉或脉络膜前动脉和扩散的闭塞进入内囊^6-9。尽管如此，动脉闭塞，需要动脉小心剥离，但它产生的梗塞病灶的面积广，包括内囊，而不持久行为缺陷。此外，ET-1是不是扩散彻底摧毁内囊后肢，因此不太明显或持续BEHavioral赤字。

一个光化学梗死模型已被广泛地用于产生各种类型的皮质梗塞病灶和皮层下结构¹⁰的。该技术包括静脉内给药后焦距照明，这导致在小血管的血小板凝集和生成梗塞病灶^10。光化学技术已被广泛使用，以创建GMS病变，而它很少被用来产生WMS病变^5,11。对于这种技术，玫瑰红染料和光照射的组合已被证明是在靶结构的破坏是有用的，从而导致相应的功能缺损。的光化学技术的关键因素是光照射，因为它决定了梗塞病灶的大小。光照射结果在灰质和白质不同的效果，由于光线的散射是白龙马高出4倍tter灰质比^12;因此，如果光强度具有足够低辐照度（<1,140毫瓦/毫米^2），一个能限制扩展到光化学病变影响的程度的白质（ 即 ，内囊）。例如，高能量的光可以诱导两个灰质和白质梗死，但是较低的能量光只能在白质诱导photothrombosis。另外，光能量的穿透是非常有限的。光能量大约99％失去了从外光¹³源1毫米。因此，预期能够准确定位，低能量的光只在与邻近的灰质的最小侵入白质诱导photothrombosis。

在这里，我们描述了一种新方法，在啮齿类动物中的内囊的前肢区域来创建梗塞病灶。我们描述的前肢区域的识别方法在内部CApsule，光照射，包括调整与光的传送，和梗塞病灶的生成的技术。我们还描述了用于评估囊建模的完整性行为测试。

方案

所有程序均按照科学与技术（GIST）的光州研究所的机构准则进行的，所有的程序是由机构动物护理和使用委员会批准GIST。

1.预损毁步骤

1. 利用AAV-GFP内囊前肢区的识别
   1. 按照机构和国家指导方针 - （13周〜400克，11）楼和处理SD大鼠。
   2. 消毒用适当的消毒器（蒸汽或等离子体灭菌器）的所有外科手术工具和电极。在121℃，使用蒸汽灭菌器作为消毒30分钟和干燥30分钟设置。
   3. 通过肌内注射麻醉用氯胺酮盐酸盐（100毫克/千克）和赛拉嗪（7毫克/千克）的混合物中的动物。通过捏爪子检查麻醉深度。通过在一个加热垫保持体温在37.5±0.5°C体内动物。
   4. 放置动物用耳棒和嘴座立体定位框架。
   5. 清洁和消毒手术部位用70％酒精和聚维酮碘溶液。渗入在预期颅骨切开区域的头皮下2％利多卡因盐酸盐，以减少手术的痛苦。
   6. 适用兽医眼药膏，以防止眼睛干燥。放置无菌披盖在动物的手术部位。保持在无菌条件下的所有过程。
   7. 执行使用手术刀2cm的中线颅骨切开并用导线拉钩双边缩回皮肤。干后用棉签和30％过氧化氢的头骨。
   8. 请使用手电钻片在运动皮层的前肢区域的孔（:从囟+2.5，ML:AP±2.5从中线），并清除与微currette病毒注射的道。
   9. 在冰上和负载1微升的解冻的AAV-GFP（2×10 ¹²病毒分子/ ml）的病毒在10微升的注射器。放置立体定位框架上的注射器。
   10. 移动针的预先制作孔和降低针1mm深入硬脑膜。
   11. 注入使用高精度微泵病毒缓慢（0.1微升/分钟）和留在原地针另外10分钟以使病毒扩散出来。
   12. 清洗用生理盐水冲洗手术部位后，固定用3-0尼龙缝合伤口;从立体定位框架释放鼠，并将其转移到一个回收室。通过肌内注射，术后疼痛控制管理酮洛芬（2毫克/千克）。
   13. 保持体温（37℃）加热垫和管理第二代头孢类抗生素（0.1％，1毫升）通过经由作为必要皮下注射肌内注射和2％的盐酸利多卡因。不要离开无人看管的动物，直到它已经恢复了足够的意识来维持胸骨斜卧。单家动物，直到完全康复。
   14. 继2 - 第三周回升，深深地通过在引擎盖肌内注射麻醉用盐酸氯胺酮（300毫克/千克）的过量的老鼠。缺乏脚趾掐响应，脉搏和呼吸的确认动物死亡。放置在引擎盖大鼠仰卧。
   15. 通过'Y'形切口，打开腹腔打开胸腔。紧紧地钳止血钳降主动脉破裂和大鼠心脏的血液引流的右心房。发起灌注到心脏的用冷的1％多聚甲醛左心室5分钟（10毫升/分钟），随后加入4％多聚甲醛30分钟（10毫升/分钟）。
   16. 移除胎体使用一对剪刀的大鼠头部。使从颈部到鼻子正中切口，用剪刀或咬骨钳使颅骨暴露除去颈部肌肉。轻轻地从大脑解剖的头骨和杜拉斯的。
   17. 提取大脑，并放置在大鼠脑在填充有4％多聚甲醛过夜50ml锥形管中。第二天，洗涤脑用1×PBS的3倍，并放置在30％的蔗糖溶液。
   18. 后大脑完全沉到30％的蔗糖溶液的底部，放置在与OCT化合物中的cryomold大脑在cryotome -20℃。切片在冠状平面中的大脑的厚度为40μm和200μm的间隔。
   19. 执行使用滑动方法¹⁴ GFP免疫组织化学染色。申请初级抗体（1:抗绿色荧光蛋白，兔IgG级分的200），以脑切片在4℃下过夜。关于^第二日，洗净，用1％磷酸盐缓冲盐水与吐温20（PBST）洗涤3次，并应用第二抗体（1:500山羊抗兔IgG抗体（H + L））1小时。冲洗用1％PBST 3次的幻灯片。放置在脑切片的护罩玻璃。
   20. 使用荧光显微镜（激发波长470纳米，发射波长525纳米，放大倍率5倍），观察AAV-GFP转导的轴突内囊。比较大鼠脑图谱¹⁵转导的轴突的位置，以确定转导的轴突的立体坐标
2. 预损毁的光强度调节适合囊梗死模型
   1. 光学神经系统的接口建设
      1. 切27号脊椎针头的适当长度（4厘米）内使用切割钻头管心针。
         注:切割可以压缩和粉碎脊椎针头;移除管心针和抛光脊椎针头尖端以除去脊椎针头的破碎部和保持脊椎针头的内口径。
      2. 剥离光纤的护套的适当长度（10厘米）（125微米用62.5微米芯）一侧接插线。
      3. 将unjacked光网络误码率到金属管（外径:3.8毫米，内径3.3毫米和长度:17mm）的，然后在纤维周围夹紧。金属管是有用的，以填补在光纤和脊椎针头的轮毂之间的空间。夹紧带压紧金属管的下1/2的两倍。
      4. 应用在光纤可热固化的环氧树脂和光纤插入脊椎针头。施加附加的环氧树脂在轮毂的空的空间。固化环氧树脂，在100℃下20分钟进行稳定的固定。
      5. 切割光纤即伸出脊椎针头中，并在使用金刚石研磨（抛光）片脊椎针头的尖端抛光该光纤。
      6. 接插线的FC / PC连接器部分连接到绿色激光系统的耦合器，测量从使用数字光功率和能量计的光纤的前端的光强度。

2. Photothrombotic梗死损毁内囊

1. 消毒用适当的消毒器（蒸汽或等离子体灭菌器）的所有外科手术工具和电极。在121℃，使用蒸汽灭菌器作为消毒30分钟和干燥30分钟设置。
2. 麻醉动物（〜400克，11 - 13周）通过肌肉注射氯胺酮盐酸盐（100毫克/千克）和赛拉嗪（7毫克/千克）的混合物中。通过捏爪子检查麻醉深度。通过动物的身下加热垫保持体温在37.5±0.5℃。
3. 放置动物用耳棒和嘴座立体定位框架。
4. 清洁和消毒手术部位用70％酒精和聚维酮碘溶液。渗入在预期颅骨切开区域的头皮下2％利多卡因盐酸盐，以减少手术的痛苦。适用兽医眼药膏，以防止眼睛干燥。
5. 应用无菌悬垂在一个进制和暴露手术部位。保持在无菌条件下的所有过程。
6. 执行2厘米的中线颅骨切开并用导线拉钩双边缩回皮肤。干后用棉掉期和过氧化氢的头骨。
7. 调节鼻夹的高度，直到前囟和lambda都在同一水平对齐。关键步骤:该对准是关键的正确看待更深的结构，如在主试验中的内囊执行梗塞病灶。
8. 做一个孔（直径2毫米; AP:-2.04从囟; ML:±3.0从中线）用钻头诱导photothrombosis。
9. 抛光和清洁光学接口的光学纤维尖端。修复ONI的立体框架无弯曲。检查ONI的前端与前和光学接口的插入之后明确擦拭它。
10. 事先测量从光纤的末端的激光强度的光学的插入l接口到大鼠脑的目标部位。调整激光强度到3.5毫瓦，通过手术前步骤所确认，在光纤的前端。
11. 插入ONI进入内囊的目标区域（-7.8毫米从手术前工序确认）通过钻孔。
12. 保持photothrombosis期间体温在37.5±0.5℃。较低的体温可能不会产生梗死的预期程度。通过尾静脉注射玫瑰红（2毫升/千克）。
13. 打开孟加拉玫瑰红注射后的532纳米绿光激光器90秒1分钟。照射后，轻轻地从大脑中删除ONI。清洗手术部位后，固定伤口保护与3-0尼龙缝合伤口;从立体定位框架释放鼠，并将其转移到一个回收室。
14. 对于假手术组（SOG），执行相同的病变制作过程中，除了盐水注射（0.2ml毫升/ 100克）代替玫瑰孟加拉。
15. 保持体温（37℃）下加热垫手术后和通过肌内注射施用抗生素（第二代头孢菌素，0.1％，1毫升）。不要离开无人看管的动物，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧。不要手术后动物回归由其他动物占据了笼子，直到完全康复。
    注:在相同的步骤中进行的初步实验，以找到从1毫瓦的最佳的光强到5毫瓦和可能需要的程序以获取病变的令人满意的程度在不同​​的条件下。

3.荚膜梗死损毁评估

1. 行为测试和实验动物分组
   1. 执行单粒料达到如Whishaw 等人描述的任务^。14冲程造型后每天评估前肢的运动缺陷为1周。执行单个颗粒达成任务使用透明有机玻璃（30×15×35厘米高）用1厘米宽的狭缝和在前壁的中部的前面一个食品成品（SPRT）在食品限制动物（90％的控制体重）。
   2. 放置食品货架倾斜对侧优选前肢上的颗粒。辖每节20丸3周。
      注:SPRTs的成功数定义为在动物掌握食物颗粒，并把它放进嘴里没有放弃它范围。
   3. 计算分数为成功达到的百分比，其由下式定义:
      
      注:我们把动物分为3组:假手术组（SOG），中度恢复组（MRG），差恢复组（PRG）。如果一个中风后SPRT得分> 50％，我们归类大鼠作为MRG，这表明相当病变的存在，但た的不完全破坏rget。如果笔划后SPRT得分<50％的行程预SPRT得分相比，我们分类的组作为PRG，这表明在目标完全损毁。
2. 梗塞损毁的Neurohistological确认
   1. 如前所述，用4％多聚甲醛进行心脏灌注。后的脑在30％蔗糖溶液完全下沉，在一厚度为10微米，并用切片机或cryotome ⁴的200微米间距进行冠状切片。
   2. 染色用H＆E尼氏，Luxol坚牢蓝-PAS，神经丝蛋白-L或胶质纤维酸性蛋白染色，并观察组织学的研究结果，以确定可以覆盖在所述目标区域中的内囊，观察染色的整个广度的最佳的光强^4,17。
   3. 使用ImageJ软件，测量大脑幻灯片内囊的光化学梗塞面积的体积。
      1. 为了测量梗死区的体积，启动"ImageJ的"软件。要打开的文件堆放，选择"图像到堆栈"（"图像"→"栈"→"图像叠图"）。编辑文件名，选择"设置规模"（"分析"→"设置规模"）来编辑的规模。
      2. 在"插件"中，选择"测量栈"来计算图像的体积或面积。将2个图像的间隔距离为"切片间隔"。让所有图像的ROI的图纸（感兴趣区域），然后单击"度量"。
         注:该软件的ImageJ的"自动计算面积和每个图像的数量和它们的总体积。

结果

这里介绍的方法的目的是创建一个持久的运动障碍外切囊梗塞。因此，重要的是正确地判断在手术前的工序中的内部胶囊内的目标。内囊锥体纤维的躯体映射尚未解决日期。正确地识别内部胶囊内的目标，前肢区域必须划定。 AAV-GFP的注射入运动皮层的前肢区域可以跟踪锥体纤维的轴突内囊（图1）。其它神经示踪剂，如生物素化的葡聚糖胺（BDA），可以用于相同的目的。内部胶囊内的目标的立体坐标可以通过跟踪轴突突起从运动皮层到内囊的前肢区域起源阐明。

图1.源自运动皮层的前肢区域的AAV-GFP。GFP转导的轴突纤维的注射后2周的内囊的前肢区的鉴定在丘脑（箭头）的腹外侧核示出并内囊（箭头）的尾部分。虚线表示的内囊的轮廓，和数字是指从囟的距离。...

讨论

这里提出的囊梗死模型表明，在前肢的功能显着和持久的运动障碍有针对性的病变。皮质下囊中风之前的机型都表现出了足够的程度运动功能障碍和快速恢复过程^6,8,9的。在这个意义上，该模型类似于表现出长期的功能障碍的临床荚膜梗塞例。

在一个外接荚膜梗塞模型的发展中的最重要的步骤是:1），以正确地识别旨在禁止内部胶囊内的功能的主体部的躯体表示; 2）识别绿色激光，它可与邻近的灰质结构最小侵入破坏内囊的整个广度的最优强度;和3），以精确地放置光纤在目标结构。虽然呈现技术可诱发外接具有高的复制率（> 70％）D囊梗死模型，破坏完整性的定位和程度小的差异覆盖内囊的整个宽度可能占不同的运动障碍。

尽管躯体组织¹⁵的争议皮质脊髓束坐落在人类内囊的后肢的前半部分。与此相反，一直没有等效分类或在啮齿动物内囊的躯体组织的详细解释。关于躯体组织的知识的缺乏往往导致梗塞损毁的不正确的目标与囊梗死模型中不同的电机结果的内囊中。然而，我们确定在内部胶囊的尾部的GFP转导的轴突，这可能代表前肢运动纤维的路径。此外，损...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
直流温度控制器	WORLD PRECISION INSTRUMENTS， INC.
数字立体定位仪器	STOELTING CO.	51900
电刺激器	CyberMedic Corp.	EMGFES 2000
环氧树脂	Precision Fiber Products， Inc. 精密纤维产品公司	PFP-353ND1	混合比： 10（A）：1（B-固化剂） 按重量计算  固化时间表： 1 分钟 @150 °C 2 ~ 5 分钟 @120 °C 5 ~ 10 分钟 @100 °C 15 ~ 30 分钟 @80 °C
光纤划线器	THORLABS， INC	S90R
光纤跳线	韩国 OPTRON Corp.		外径：3 mm & Oslash;200 和微量;m 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m
激光电源	长春新工光电科技有限公司	MGL-FN-532nm-200mW-14010196
压接环	DAWOOTECH CO.，LTD. 大宇科技股份有限公司		长度：19 mm 内径：3 mm 外径：3.8 mm 材质：SUS
Micro4-micro 注射泵控制器	WORLD PRECISION INSTRUMENTS， INC	95100
光功率计	THOLABS， INC	PM100D
金刚石研磨（抛光）板	THORLABS， INC	LF3D	粒度：3 µm
金刚石研磨（抛光）板	THORLABS， INC	LF6D	粒度：6 µm
Rose Bengal	SIGMA-ALDRICH CO. LLC.	330000
带笔尖脊髓麻醉针 （脊髓针）	B.BRAUN MELSUNGEN AG	4502027	尺寸：27 G 长度：88 mm 针：0.40 mm
防水砂纸	DEERFOS CO.，LTD	CC261	粒度：1,000 & micro;m
Nanofil 10 &微;l 注射器	WORLD PRECISION INSTRUMENTS， INC	NANOFIL
Nanofil 33 G BVLD 针	WORLD PRECISION INSTRUMENTS， INC	NF33BV-2
AAV-GFP 病毒	UNC 载体核心	AAV2-CamKIIa-eYFP	2 x 1012 病毒分子/ml
抗绿色荧光蛋白，兔 IgG 组分	Life Technologies，INC	A11122	一抗 （1：200）
山羊抗兔 IgG （H + L）	Life Technologies，INC	A11034	二抗抗体 （1：500）
Ceftezole	GUJU Pharma Co.，LTD.	A27802741	0.1%，1 ml
盐酸利多卡因注射液	JEIL PHARMACEUTICAL CO.，LTD.	A04900271	2%，1 ml
手钻	Seshin
数字光功率和能量计	THORLABS，INC	PM100D
酮洛芬	UNIBIOTech