方法文章

外切囊梗死模型使用光化学技术

DOI：

10.3791/53281

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2016年6月2日

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1Department of Biomedical Science and Engineering, Gwangju Institute of Science and Technology, 2Department of Pathology, Chonnam National University Medical School, 3Departement of Neurosurgery, Presbyterian Medical Center

本文内容

摘要

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这份手稿描述囊梗塞的建模技术。在这里，我们利用与手术后前目标映射光的低强度改良光化学技术。使用这种技术，我们创造了持续性运动障碍外接囊梗死模型。

摘要

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最近白质中风患病率的增加需要在该领域进行专门研究。然而，缺乏相关的白质中风动物模型阻碍了研究调查。在这里，我们描述了一种创建局限性包膜梗死的新方法，该方法可以最大限度地减少对邻近灰质结构的损伤。我们使用腺相关病毒绿色荧光蛋白 （AAV-GFP） 的术前神经示踪来识别内囊内前肢区域的体位组织。根据灰质和白质的不同光学特性调整光强度有助于在灰质相对保留的情况下选择性破坏白质。视神经接口的准确定位可以破坏内囊中的整个前肢区域，从而导致明显且持续的运动缺陷。因此，该技术会产生高度可复制的包膜梗死病变，伴有持续的运动缺陷。该模型不仅有助于在行为、回路和细胞水平上研究白质中风 （WMS），还有助于评估其对开发新的治疗和康复干预措施的有用性。

引言

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直到最近，"灰质行程（GMS）模型"已经被专门用来了解中风的病理生理机制，并指导新治疗方法的发展。然而，出现了行程的患病率增加，影响在老年个体，这构成15皮层下白质-所有笔划1,2的25％。大量的研究已经进行使用GMS模型对中风，而有一些已经使用白质行程（WMS）模型的研究很少。在啮齿类动物中白质比在人类或灵长类白质基本上更少。因此，更难以在脑白质3选择性地访问和破坏靶区域。此外，没有有效的工具已经被开发迄今为止为选择性地破坏的靶向白质的计划的程度。因此，一直存在缺乏脑白质笔划研究适当的模型。

动物ST洛克模型经常用于监测马达恢复的新康复和治疗方法的发展的进展。它是理想的，利用表现出一个长期的神经功能缺损一致与人类中风4,5展示了解剖改变的动物模型。在这方面，马达赤字和脑以下梗塞损毁的广泛参与快速恢复可能不追求中风研究的现实的。以前荚膜梗塞模型已被制成由内皮素-1（ET-1）的内部颈动脉或脉络膜前动脉和扩散的闭塞进入内囊6-9。尽管如此，动脉闭塞，需要动脉小心剥离，但它产生的梗塞病灶的面积广，包括内囊，而不持久行为缺陷。此外，ET-1是不是扩散彻底摧毁内囊后肢，因此不太明显或持续BEHavioral赤字。

一个光化学梗死模型已被广泛地用于产生各种类型的皮质梗塞病灶和皮层下结构10的。该技术包括静脉内给药后焦距照明....

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方案

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所有程序均按照科学与技术（GIST）的光州研究所的机构准则进行的，所有的程序是由机构动物护理和使用委员会批准GIST。

1.预损毁步骤

  1. 利用AAV-GFP内囊前肢区的识别
    1. 按照机构和国家指导方针 - （13周〜400克，11）楼和处理SD大鼠。
    2. 消毒用适当的消毒器（蒸汽或等离子体灭菌器）的所有外科手术工具和电极。在121℃，使用蒸汽灭菌器作为消毒30分钟和干燥30分钟设置。
    3. 通过肌内注射麻醉用氯胺酮盐酸盐（100毫克/千克）和赛拉嗪（7毫克/千克）的混合物中的动物。通过捏爪子检查麻醉深度。通过在一个加热垫保持体温在37.5±0.5°C体内动物。
    4. 放置动物用耳棒和嘴座立体定位框架。
    5. 清洁和消毒手术部位用70％酒精和聚维酮碘溶液。渗入在预期颅骨切开区域的头皮下2％利多卡因盐酸盐，以减少手术的痛苦。
    6. 适用兽医眼药膏，以防止眼睛干燥。放置无菌披盖在动物的手术部位。保持在无菌条件下的所有过程。
    7. 执行使用手术刀2cm的中线颅骨切开并用导线拉钩双边缩回皮肤。干后用棉签和30％过氧化氢的头骨。
    8. 请使用手电钻片在运动皮层的前肢区域的孔（:从囟+2.5，ML:AP±2.5从中线），并清除与微currette病毒注射的道。
    9. 在冰上和负载1微升的解冻的AAV-GFP（2×10 12病毒分子/ ml）的病毒在....

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结果

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这里介绍的方法的目的是创建一个持久的运动障碍外切囊梗塞。因此，重要的是正确地判断在手术前的工序中的内部胶囊内的目标。内囊锥体纤维的躯体映射尚未解决日期。正确地识别内部胶囊内的目标，前肢区域必须划定。 AAV-GFP的注射入运动皮层的前肢区域可以跟踪锥体纤维的轴突内囊（图1）。其它神经示踪剂，如生物素化的葡聚糖胺（BDA），可以用于相同的目的。内部胶囊内的目标的立体坐标可以通过跟踪轴突突起从运动皮层到内囊的前肢区域起源阐明。


图1.源自运动皮层的前肢区域的AAV-GFP。GFP转导的轴突纤维的注射后2周的内囊的前肢区的鉴定在丘脑（箭头）的腹外侧核示出并内囊（箭头）的尾部分。虚线表示的内囊的轮廓，和数字是指从囟的距离。.......

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讨论

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这里提出的囊梗死模型表明，在前肢的功能显着和持久的运动障碍有针对性的病变。皮质下囊中风之前的机型都表现出了足够的程度运动功能障碍和快速恢复过程6,8,9的。在这个意义上，该模型类似于表现出长期的功能障碍的临床荚膜梗塞例。

在一个外接荚膜梗塞模型的发展中的最重要的步骤是:1），以正确地识别旨在禁止内部胶囊内的功能的主体部的躯体表示; 2）识别绿色激光，它可与邻近的灰质结构最小侵入破坏内囊的整个广度的最优强度;和3），以精确地放置光纤在目标结构。虽然呈现技术可诱发外接具有高的复制率（> 70％）D囊梗死模型，破坏完整性的定位和程度小的差异覆盖内囊的整个宽度可能占不同的运动障碍。

尽管躯体组织15的争议皮质脊髓束坐落在人类内囊的后肢的前半部分。与此相反，一直没有等效分类或在啮齿动物内囊的躯体组织的详细解释。关于躯体组织的知识的缺乏往往导致梗塞损毁的不正确的目标与囊梗死模型中不同的电机结果的内囊中。然而，我们确定在内部胶囊的尾部的GFP转导的轴突，这可能代表前肢运动纤维的路径。此外，损.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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这项工作是由来自医疗系统工程研究所（IMSE）从GIST GIST加州理工学院联合基金（K04592）的资助，并通过韩国NRF的基础科学研究计划由科学，信息和通信技术及未来规划部提供资金支持（NRF-2013R1A2A2A01067890）。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
直流温度控制器WORLD PRECISION INSTRUMENTS， INC.
数字立体定位仪器STOELTING CO.51900
电刺激器CyberMedic Corp.EMGFES 2000
环氧树脂 Precision Fiber Products， Inc. 精密纤维产品公司PFP-353ND1混合比：
10（A）：1（B-固化剂） 按重量计算 
固化时间表：
1 分钟 @150 °C
2 ~ 5 分钟 @120 °C
5 ~ 10 分钟 @100 °C
15 ~ 30 分钟 @80 °C
光纤划线器 THORLABS， INCS90R
光纤跳线韩国 OPTRON Corp.外径：3 mm
& Oslash;200 和微量;m
0.39 NA
FC/PC-FC/PC
1 m
激光电源长春新工光电科技有限公司MGL-FN-532nm-200mW-14010196
压接环 DAWOOTECH CO.，LTD. 大宇科技股份有限公司长度：19 mm
内径：3 mm
外径：3.8 mm
材质：SUS
Micro4-micro 注射泵控制器WORLD PRECISION INSTRUMENTS， INC95100
光功率计THOLABS， INCPM100D
金刚石研磨（抛光）板THORLABS， INCLF3D粒度：3 µm
金刚石研磨（抛光）板THORLABS， INCLF6D粒度：6 µm
Rose BengalSIGMA-ALDRICH CO. LLC.330000
带笔尖脊髓麻醉针 （脊髓针） B.BRAUN MELSUNGEN AG 4502027尺寸：27 G
长度：88 mm
针：0.40 mm
防水砂纸 DEERFOS CO.，LTDCC261粒度：1,000 & micro;m
Nanofil 10 &微;l 注射器WORLD PRECISION INSTRUMENTS， INCNANOFIL
Nanofil 33 G BVLD 针WORLD PRECISION INSTRUMENTS， INCNF33BV-2
AAV-GFP 病毒UNC 载体核心AAV2-CamKIIa-eYFP2 x 1012 病毒分子/ml
抗绿色荧光蛋白，兔 IgG 组分Life Technologies，INCA11122一抗 （1：200）
山羊抗兔 IgG （H + L）Life Technologies，INCA11034二抗抗体 （1：500）
CeftezoleGUJU Pharma Co.，LTD.A278027410.1%，1 ml
盐酸利多卡因注射液JEIL PHARMACEUTICAL CO.，LTD.A049002712%，1 ml
手钻Seshin
数字光功率和能量计THORLABS，INCPM100D
酮洛芬UNIBIOTech
ATC1000

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2012 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 125, 2-220 (2012).
  2. Debette, S., Markus, H. S. The clinical im....

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AAV GFP

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