体外测定磷脂酰乙醇胺甲基转移酶活性的实验方法

摘要

本报告描述了一种 体外 使用酶法测定磷脂酰乙醇胺甲基转移酶活性 利什曼原虫 细胞提取物。该实验基于放射性甲基从 S-[甲基-³H]腺苷-L-甲硫氨酸转移至内源性磷脂酰乙醇胺。

摘要

磷脂酰乙醇胺甲基转移酶是一类生物合成酶，可催化将甲基从 S-腺苷-L-甲硫氨酸转移至磷脂酰乙醇胺、单甲基磷脂酰乙醇胺或二甲基磷脂酰乙醇胺，生成单甲基磷脂酰乙醇胺、二甲基磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。这类酶普遍存在于动物细胞和真菌中，也见于约10%的细菌中。除在脂质代谢中的直接作用外，它们还在胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化、细胞生长或毒力等细胞生理过程中发挥多种重要功能。本文报告了一种简单的无细胞酶学检测方法，利用全细胞提取物作为酶源，通过检测氚标记的甲基从S-[甲基-³H]腺苷-L-甲硫氨酸转移至磷脂酰乙醇胺的过程来测定酶活性。反应生成的甲基化磷脂酰乙醇胺具有疏水性，因此可通过有机溶剂萃取将其与水溶性的S-[甲基-³H]腺苷-L-甲硫氨酸分离。该方法原则上可适用于其他各类细胞，并可用于筛选针对特定磷脂酰乙醇胺甲基转移酶的抑制剂或药物，而无需预先纯化该酶。

引言

磷脂酰乙醇胺甲基转移酶（PEMT）催化一个或多个甲基从甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）共价连接到磷脂酰乙醇胺（PE）、单甲基-PE 或二甲基-PE 上，生成单甲基-PE、二甲基-PE 和/或磷脂酰胆碱（PC）。这类酶几乎普遍存在于动物细胞和真菌中。此外，它们也存在于某些植物¹以及约10%的细菌中，尤其是那些与真核生物相互作用的细菌²。

PEMT不仅通过参与磷脂酰胆碱（PC）的合成而与细胞生物学密切相关——PC是动物细胞中的主要脂质类别，同时还具有其他重要的细胞功能。在哺乳动物中，PEMT主要在肝脏中表达，对于极低密度脂蛋白的正常分泌至关重要，并且还参与饮食诱导的肥胖³、动脉粥样硬化⁴以及胰岛素抵抗⁵。此外，哺乳动物的PEMT也在脂肪细胞中表达，尽管表达水平较低，但仍参与脂肪沉积^6,7。PEMT在癌症发生⁸、细胞凋亡⁹和细胞生长¹⁰中的作用也已有报道。在细菌中，PEMT酶已被证明对正常细胞生长²、毒力²以及与宿主植物的共生关系¹¹具有重要作用。

本实验方案的目标和原理是从全细胞提取物中直接测定PEMT活性，而无需纯化该酶。目前已开发出两种不同的方法来测定PEMT活性。第一种也是最常用的方法是通过检测放射性标记的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）中的氚标记甲基基团转移至磷脂酰乙醇胺（PE）的量来测定，这也是本文的主题。该方法最初是为测定酵母中的PEMT活性而开发的 ¹² 和哺乳动物细胞（肝脏） ¹³ 以了解这些细胞中磷脂酰胆碱（PC）的生物合成过程，并确定这些酶的特异性。此后，该技术已被应用于其他细胞类型，例如细菌。 ² （尽管使用基础pH值进行检测） ¹⁵以及原生动物寄生虫 ¹⁴该技术可用于全细胞提取物以及纯化酶，并可潜在地应用于任何细胞提取物系统。此外，还设计了一种非放射性检测方法，该方法依赖于对产物的酶法定量分析 S-腺苷同型半胱氨酸，SAM的转甲基化产物 ¹⁶后者检测方法可能更为便捷，因其不涉及放射性，但仅适用于纯化的酶。

方案

1. 细胞提取物制备

1. 在26 ºC条件下，将Leishmania细胞培养于带有密封盖的无菌塑料瓶中，培养基为添加了20 mM HEPES（pH 7.4）、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素、5 µg/ml血红素、0.35 g/L NaCO₂H、0.1 mM腺嘌呤和2 µg/ml生物蝶呤的1× M199培养基，不进行振荡。当细胞密度达到1–2 × 10⁷/ml时，在4 ºC下以1,500 g离心5分钟收集细胞。
2. 用移液器弃去上清液，并用血清学移液管将细胞沉淀重悬于相当于原培养液体积一半的冰冷磷酸盐缓冲液（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄，pH 7.4）中进行洗涤。根据生物安全二级（BL2）指南处理细胞上清液。
3. 再次在4 ºC下以1,500 g离心5分钟。用移液器弃去上清液。立即进行下一步操作，或将细胞沉淀在液氮中速冻，于-80 ºC长期保存（最长三个月）。
4. 配制2×裂解缓冲液（0.5 M蔗糖、0.1 M TrisHCl，pH 7.5、2 mM EDTA和2×蛋白酶抑制剂混合物），并在冰上置于4 ºC保存。
5. 将细胞沉淀（新鲜或冻存）用等体积的2×裂解缓冲液重悬。加入等体积的玻璃珠，在4 ºC下剧烈涡旋振荡10分钟。
6. 加入两倍体积的1×裂解缓冲液并混匀。在4 ºC下以1,500 × g离心10分钟，使未破裂的细胞和细胞核形成沉淀。
7. 用移液器将上清液转移至新的预冷离心管中，并将细胞提取物置于冰上，直至实验完成。

2. 使用蛋白定量试剂盒（如二辛可宁酸法）测定细胞提取物的蛋白浓度

1. 按体积比49:1混合BCA溶液与硫酸铜（II），配制二辛可宁酸（BCA）工作液（每管1 ml）。
2. 将10 mg/ml的牛血清白蛋白（BSA）储备液用BCA工作液稀释，配制成0、10、20、30、40、50和60 µg/ml的蛋白标准品，每份体积为1 ml。
3. 取2 µl细胞裂解物，加入1 ml BCA工作液中，每个样品设两个复孔。将标准品和待测蛋白样品置于预热至60 °C的水浴中孵育10分钟。
4. 将样品转移至冰上冷却3分钟，使用分光光度计在562 nm波长下测定标准品和蛋白样品的吸光度。
5. 参照试剂盒说明书，以BSA标准曲线为对照计算细胞裂解物的蛋白浓度，并用1×裂解缓冲液将细胞裂解物稀释至蛋白浓度为10 mg/ml。

3. 每管200 μl的酶学检测

注意：以下步骤需在化学通风橱中进行。

1. 在15 ml锥形管中，每个样品设置两个重复。每管准备20 μl 1 M TrisHCl（pH 7.5），并置于冰上。每管在室温下准备2 ml氯仿/甲醇（1:1（v/v）；终止溶液）。
2. 在冰上，向每个15 ml锥形管中加入20 μl 1 M TrisHCl（pH 7.5）。
3. 从此步骤起遵循放射性安全操作规范。每管加入等效于0.06 μM（0.2 μCi）S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine 和50 μM非放射性SAM，使SAM总浓度为50.06 μM。每管加入x μl冷蒸馏水，其中x = 200 -（20（缓冲液）+ 20（细胞提取物）+ 非放射性与放射性SAM的总体积）。
4. 将每根锥形管转移至预热至30 ºC的水浴中。向每管加入20 μl细胞提取物（相当于200 μg蛋白），以启动反应。孵育所需时间（0至45分钟）。
5. 通过向每管加入2 ml氯仿/甲醇（1:1；v/v；终止溶液）终止反应。将锥形管转移至室温（20–25 ºC）。

4. 脂质提取

注意：以下步骤需在化学通风橱中进行。

1. 向含有酶促反应样品的每个试管中加入 700 μl 水。剧烈涡旋振荡 30 秒。室温下以 1,500 × g 离心 5 分钟，以分离有机相和水相。
2. 用移液管将下层有机相转移至新的15 ml锥形管中。向每管中加入1 ml水 "下相" 将含有样品的离心管剧烈涡旋振荡30秒。再次以1,500 × g离心5分钟，以分离有机相与水相。
3. 用移液管将下层有机相转移至闪烁瓶中。在氮气流下干燥样品。₂按照放射性物质处理规范，处置含有未掺入的放射性SAM及放射性锥形管的水相。
4. 每管加入 2 ml 闪烁液。根据制造商说明书和仪器使用指南，用闪烁计数器测定掺入的放射活性。
5. 使用以下通用公式计算酶活性（单位：nmol/mg 蛋白）：
   cpm 值 × 10³ x [SAM 总浓度（放射性与非放射性，mM）] x 5 放射性 SAM 的比活性（Ci/mmol）x [放射性 SAM 浓度（mM）]
   注意：上述方案可根据S-腺苷甲硫氨酸（SAM）浓度依赖性或蛋白质依赖性PEMT酶活性测定的需要进行调整。对于SAM浓度依赖性酶学测定，反应时间保持恒定（15分钟，处于线性范围），并在反应体系中加入不同量的非放射性SAM；而对于蛋白质依赖性PEMT测定，则保持SAM浓度（我们选用0.05 mM）和反应时间（15分钟）恒定。此外，若某些PEMT酶具有不同的最适pH值，可依据需要调整缓冲液的pH。

结果

图1显示了一个时间依赖性的PEMT测定，该测定以Leishmania全细胞提取物作为酶源，以内源性PE作为底物进行。通过闪烁计数法对有机相中的放射性进行了定量。所得数据用于计算转移到PE上的氚标记甲基基团的量。PEMT活性在约20分钟内呈线性增长，随后在约30分钟时达到平台期，并在此后保持恒定约15分钟。如预期所示，在未添加细胞提取物的测定中未检测到PEMT活性（图2）。此外，在存在100 μM十八烷基三甲基溴化铵（一种L. major PE甲基转移酶LmjPEM1和LmjPEM2的抑制剂¹⁴）的情况下，该活性被完全抑制。PEMT活性还依赖于蛋白浓度，且与酶学测定中所用蛋白量呈线性正比关系（图3）。最后，进行了S-腺苷甲硫氨酸（SAM）浓度依赖性PEMT测定，测试了不同浓度的SAM（图4）。当SAM浓度达到约0.5 mM时，PEMT活性趋于饱和。...

讨论

这种简单快速的PEMT检测方法利用全细胞裂解物作为蛋白质来源，通过将放射性甲基基团从SAM转移至PE，实现对甲基化形式PE的定量分析。该方法快速、灵敏、可重复，同样适用于纯化的酶 ¹⁷如果目标甲基转移酶对单甲基-磷脂酰乙醇胺（monomethyl-PE）或二甲基-磷脂酰乙醇胺（dimethyl-PE）具有底物特异性，而非对磷脂酰乙醇胺（PE）本身，则可在检测中添加单甲基-PE或二甲基-PE。 ^12,13,18,19若使用纯化的PEMT酶，可在测定中添加PE。本方案的一个局限性在于无法鉴定反应产物（单甲基-PE、二甲基-PE或PC）。然而，反应产物（单甲基-PE、二甲基-PE、PC）的身份可通过一维薄层色谱进一步分析，具体方法如所述。 ^20,21此外，一些SAM的降解产物，例如 S-S-腺苷高半胱氨酸和5'-甲硫基腺苷可能通过反馈抑制来抑制PEMT活性。然而， 利什曼原虫 具有一个 SS-腺苷同型半胱氨酸水解酶 ²²，可切割 S-腺苷同型半胱氨酸转化为腺嘌呤和 S...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
S-[甲基-3H]腺苷-L-蛋氨酸（比活度为 5–15 Ci/mmol）	Perkin Elmer	NET155050UC	分装试剂并于 -20 °C 冻存；使用该试剂时需遵循放射性安全操作规范
蛋白酶抑制剂混合物	Roche Life Sciences	11836170001	新鲜配制稀释液
玻璃珠，酸洗，425–600 mm	Sigma Aldrich	G8772
双辛可宁酸溶液	Sigma Aldrich	B9643
硫酸铜（II）	Sigma Aldrich	C2284
MicroBeta2 单检测器闪烁计数仪	Perkin Elmer	2450-0010
分光光度计 Biomate 3	Thermo Scientific	840208300
BSA 储存液（10 mg/ml）	New England Biolabs	B9001S
闪烁液	Research Product International Corp	111198
S-(5'-腺苷基)-L-蛋氨酸氯化物（盐酸盐）	Cayman Chemicals	13956	用 20 mM HCl 稀释试剂，并将分装样品于 -80 °C 冻存