用于猪流感病毒A检测与分离的鼻拭子方法

摘要

作者提出了一种采集猪鼻拭子以检测和分离甲型流感病毒的实验方案。

摘要

对猪群中甲型流感病毒的监测对于人类和动物健康至关重要，因为甲型流感病毒在猪群中进化迅速，不断出现新的毒株。猪能够感染多种谱系的甲型流感病毒，使其成为新型甲型流感病毒毒株出现和持续传播的重要宿主。在商业养猪场、农业展览会和活体动物市场等不同环境中对猪进行采样，有助于全面了解当前流行的各种甲型流感病毒（IAV）毒株。目前公认的活体采样金标准技术（i.e. 鼻拭子采集）劳动强度较大，因其需要对猪只进行物理保定。鼻拭纸采样则仅需将一块织物在猪的吻部擦拭，几乎无需对动物进行保定。鼻拭纸采样操作简便，无需由具备专业兽医或动物操作经验的人员执行。尽管其敏感性略低于鼻拭子，但病毒检出率和分离率足以满足检测需求，因此在需要低应激采样方法时，鼻拭纸可作为个体猪只采样的有效替代方案。下述实验方案详细说明了如何从单头猪采集合格的鼻拭纸样本。

引言

甲型流感病毒（IAV）可导致多种物种发生呼吸道疾病，包括家禽、猪和人类。由于分段的IAV基因组可能发生重配，病毒可快速进化，新的IAV毒株也频繁出现。猪是一种可作为多种宿主来源IAV重配“混合容器”的物种。¹ 目前在北美猪群中常见流行的主要有三种IAV亚型（H1N1、H1N2、H3N2），但多次从人类传入的IAV导致了这些亚型内部存在广泛的病毒多样性。² 自1998年以来，感染猪的IAV快速进化趋势日益明显，当时一种包含人源、禽源和猪源病毒基因片段的三重重配IAV³ 在美国猪群中广泛传播。⁴ 此种三重重配IAV的内部基因片段至今仍在当前感染猪的IAV中高度流行。⁵

全球范围内，甲型流感病毒（IAV）是导致猪呼吸道疾病的重要原因，其典型临床症状包括发热、厌食、嗜睡、咳嗽、呼吸困难、打喷嚏、鼻部分泌物以及增重不良。在种猪场，IAV 可造成显著经济损失，已有文献记录表明，因 IAV 引起的发热可导致繁殖障碍，以及弱仔猪出生率增加^6,7。在美国，商业猪群中普遍可检测到 IAV，且感染猪只的 IAV 存在广泛的抗原性和基因组多样性，并持续发生进化，这阻碍了对该病毒的有效防控^8-11。

2009年，源于猪体内基因重配的流感病毒（IAV）毒株引发全球大流行，使人们长期以来对公共卫生的担忧成为现实。该大流行毒株是一种具有猪源谱系的IAV，其基因片段来源于北美三重重配猪流感谱系和欧亚类禽猪流感谱系，可在人群中造成全球性传播¹²。自那以后，该大流行病毒（A(H1N1)pdm09）与在猪群中地方性流行的IAV毒株发生了基因重配^13,14，其中一些新产生的重配毒株已再次传播给人类¹⁵。鉴于基因重配事件频繁发生，且不断出现具有大流行潜力的新型IAV毒株，对猪群中循环的IAV病毒开展主动监测显得至关重要，尤其是在猪与人接触密切的界面区域。

猪与人之间的接触界面对于甲型流感病毒（IAV）的双向种间传播具有重要意义。在商业化养猪生产中发生的人传猪传播，是目前猪群中IAV多样性的重要来源。农业展览会在美国是人群与猪只聚集接触的最大场所，也是IAV发生动物向人传播（人畜共患病传播）的已知地点^15-21。2012年，在一次H3N2变种IAV暴发期间，93%的病例报告在发病前数日曾参加过农业展览会¹⁵。对参展猪只分离病毒与人类分离病毒进行基因组分析，证实了人畜共患病传播的发生²¹。感染IAV的参展猪通常不表现出明显的临床症状^21-23，表明有必要开展直接的诊断检测。

仅对明显患病的猪进行采样无法有效识别猪群中甲型流感病毒（IAV）的流行情况，也不能依赖该方法来发现猪群中出现的新IAV毒株。主动监测对于发现猪群中 emerging 的IAV毒株并评估其对猪只和公共卫生的威胁至关重要。目前大多数IAV监测活动均为自愿开展，因此需要采用干扰最小的监测方法。用于检测感染猪只IAV的三种主要活体采样方法为：鼻拭子、口腔液和鼻部擦拭。当前推荐的个体猪只采样方法是将合成纤维头拭子插入鼻腔，以采集鼻腔分泌物和上皮细胞^24,25。由于猪只可能试图躲避该操作，因此需要一组经过培训的人员根据动物体型采用手动或套索方式对其进行固定²⁶。该固定过程对操作人员而言劳动强度大，对猪只则会造成应激反应。此外，参展猪只通常会在展会上参加多项比赛，因此饲养者可能担心额外的应激会影响比赛表现，从而对监测工作产生抵触情绪。

在感染甲型流感病毒（IAV）的猪群中，口腔液检测IAV的概率为80%至100%，因此口腔液已成为用于猪群IAV分子检测的一种广受欢迎的鼻拭子替代方法。^27,28 此外，在初次感染后，口腔液可能比鼻拭子提供更长的IAV检测窗口期。然而，从口腔液中分离IAV一直存在困难，仅有50%的病毒分离尝试能够成功获得IAV。²⁹

在猪群中进行甲型流感病毒（IAV）监测时，使用鼻拭子替代鼻腔拭子可克服上述局限性。鼻拭子无需使用固定套索，操作过程中不会对动物造成应激，也不会使旁观者感到不适。采集鼻拭子样本所需的技术培训极少，使得非兽医专业人员（包括养猪户）也能够完成监测样本的采集。此前已有研究将鼻拭子与鼻腔拭子在甲型流感病毒检测和分离方面进行了比较³⁰，下文将详细描述这种非侵入性采样方法的具体操作步骤。

方案

所有用于获取以下数据的猪均受到俄亥俄州立大学机构动物护理与使用委员会（动物使用协议编号 2009A0134-R1）的保护。

1. 病毒运输培养基和样本采集管的制备

1. 将37 g脑心浸液加入900 ml纯化水中，加热至70 °C，同时使用磁力搅拌器和搅拌子充分搅拌，使粉末完全溶解。
2. 将肉汤在121 °C下高压灭菌15分钟。在实验台上冷却至室温。如需，可在4 °C冰箱中冷藏过夜。
3. 在室温下，使用磁力搅拌器将6.02 g青霉素G钠盐和10 g硫酸链霉素溶解于50 ml纯化水中。再加入纯化水，定容至100 ml。使用0.22 µm聚醚砜膜过滤器将溶液过滤至无菌瓶中。
4. 在无菌条件下，将过滤后的青霉素和链霉素溶液加入已冷却的脑心浸液肉汤中，充分混匀（使用搅拌子或手动旋转摇动烧瓶），制备成病毒转运培养基。
5. 无菌条件下检测病毒转运培养基的pH值；如需，使用HCl或NaOH将pH值调节至7.4 ± 0.2。
6. 按照Zhang和Harmon所述方法，通过rRT-PCR检测甲型流感病毒基质蛋白，对病毒转运培养基进行质量保证测试。²²
7. 将5 ml病毒转运培养基分装至容量为8 ml的无菌高密度聚乙烯瓶中。对瓶体进行标记，供野外使用。
8. 将制备好的分装瓶存放于标准冻存盒中，在-20 °C保存，直至用于样本采集。

2. 采集猪的鼻拭子样本

1. 在采样前立即解冻所需数量的冻存管，每头猪需使用一管。室温下解冻约需30–45分钟。解冻后的冻存管应置于冰袋上保持低温，直至使用。
2. 根据实际情况穿戴适当的个人防护装备（例如防护服、鞋套、呼吸器、耳塞，等）。
3. 进入动物区域。如有需要，将猪限制在较小区域内，但不要束缚。不要惊扰正在休息的动物。
4. 戴上一副一次性检查手套。注意避免接触猪只、人员或无生命物体，以防污染手套。
5. 用戴着手套的手从包装中取出一块无菌的5.08 cm × 5.08 cm（2 in. × 2 in.）棉纱布垫。应尽可能使用无菌纱布垫。单个独立包装的纱布垫比每包含两片的包装更便于使用。
6. 用一只手的指尖夹持棉纱布垫，尽可能多地暴露纱布表面以利于采样。
7. 用纱布垫擦拭猪的鼻部，尽量小心地插入外鼻孔。用同一块纱布垫收集可见的鼻腔分泌物（约1 ml）。
8. 用同一只手将纱布垫对折，以便放入含有病毒运输培养基的冻存管中。
9. 用另一只手打开冻存管盖，将折叠好的纱布垫放入管内。盖紧管盖并振荡，确保纱布垫与病毒运输培养基充分混合。
10. 脱下手套并放入适当的废弃物容器中。每采集一头猪的样本后均需更换新手套。
11. 核对冻存管标识。记录猪的编号、年龄、性别、临床症状以及研究人员认为必要的其他备注信息。
12. 样本采集后应立即冷藏。建议在冷冻前分装样本，以避免多次冻融循环。采集后应尽快将样本置于干冰上，运送到实验室。在检测开始前，将冻存管储存于-80 °C条件下。

3. 流感病毒A核酸的检测 

1. 将样本置于37 °C干珠浴中解冻5分钟，随后在室温下于实验台面上继续解冻20-30分钟。同时向珠浴中加入多个冻存管会导致浴温升高；需注意避免样本过热。
2. 取100 µl病毒运输液用于RNA提取。
   1. 采用高通量（96孔板格式）磁珠 平台，用于从大量样本中提取RNA。³¹
3. 使用实时逆转录PCR检测方法快速检测甲型流感病毒。³¹

4. 从鼻拭子中分离甲型流感病毒

1. 按照第 3.1 节所述方法解冻样品。
2. 用硫酸庆大霉素（1,000 μg/ml）、两性霉素 B（22.5 μg/ml）和硫酸卡那霉素（325 μg/ml）处理解冻后的样品。
3. 如前所述接种至Madin-Darby犬肾（MDCK）上皮细胞中。³²

结果

成功应用该方法可获得rRT-PCR结果，结合RNA提取和rRT-PCR过程中内参的使用，表明样本中不含采样期间可能混入的环境杂质所导致的PCR抑制物。样本接种后，病毒分离孔应无可见的环境杂质残留。rRT-PCR结果与病毒分离结果之间具有一致性，但需注意PCR通常比病毒分离检出更高的甲型流感病毒（IAV）阳性率，因为PCR检测的是病毒核酸，而非一定是有活性的病毒。

结果表明，鼻拭子擦拭法是一种有效的替代方法，可取代目前流感病毒（IAV）采样的金标准技术——鼻拭子。Edwards et al. 对2013年在美国农业博览会上从猪只采集的鼻部擦拭样本与鼻拭子进行了比较研究。在该研究中，对每头猪同时采集鼻拭子和鼻拭子擦拭样本，并平行采用rRT-PCR和病毒分离法进行检测。Edwards 等人通过比较553对配对的鼻拭子和鼻拭子擦拭样本，证明了rRT-PCR和细胞培养中病毒分离在IAV检测和分离方面的一致性³⁰。在这些检测样本中，rRT-PCR检测结果的一致性达到93.5%（517/553）（表1），而使用MDCK细胞...

讨论

使用聚酯纤维头鼻拭子从猪只采集样本已被证实对开展甲型流感病毒（IAV）监测具有实用价值；然而，由于鼻拭子操作需要使用套绳固定猪只，限制了其在监测工作中的广泛应用。鼻拭擦拭法是对现有猪只采样技术的改进，旨在降低采样过程中人和猪的应激反应。尽管该方法已在展览用猪的场景中完成开发与验证，但亦可便捷地应用于其他需要进行猪只宰前IAV检测的情形。即 商用猪，活体动物市场，生物医学研究 等。)

如上所述，该采样技术的主要应用对象是参展猪群。在农业展览会上，猪只饲养者根据猪的整体状况竞争获取经济奖励和声誉。有轶事证据表明，如果猪的表现不佳，饲养者可能会将其归因于在保定和采样过程中猪只承受的压力水平。鼻拭子采样适用于需要尽量减少动物应激的个体动物监测工作。在实施鼻拭子操作时避免使用套索并减少对猪只的明显惊扰，已提高了公众对参展猪群中甲型流感病毒（IAV）监测工作的接受度³³。由于鼻拭子方法具有较低的应激性，也使其非常适用于商业化养猪场。此外，该方法还有助于降低成本，因其所需人员较少，且无需专门培训。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BBL 脑心浸液培养基	Becton, Dickinson and Company	211059
青霉素 G 钠盐	MP Biomedicals, LLC	021194537	1500 u/mg
硫酸链霉素	AMRESCO LLC	0382
庆大霉素溶液	Mediatech, Inc.	30-005-CR	50 mg/ml
两性霉素 B 溶液	Fisher	S 24 25	250 ug/ml
硫酸卡那霉素	Teknova	K2105	5000 ug/ml
TPP 快速 Filtermax 系统	TPP Techno Plastic Products AG	99150
Nalgen 诊断用瓶	Thermo Scientific	342002-9025	高密度聚乙烯材质，带白色聚丙烯盖
Dermacea 八层纱布海绵	Covidien	441211	5.08 cm × 5.08 cm (2 in. × 2 in)
腈类检查手套	Saftey Choice	19-170-010 (A-D)