我们详细介绍了一种利用活体共聚焦显微镜在麻醉小鼠的肠系膜静脉中监测中性粒细胞和单核细胞在稳态及炎症条件下行为的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
有效的免疫反应依赖于白细胞从血液中快速迁移至感染或损伤部位。 研究白细胞迁移 体内 对于理解白细胞跨内皮迁移及其与血管内皮相互作用的分子基础至关重要。一种有效的方法是利用表达荧光蛋白的转基因小鼠进行活体显微成像。
本文介绍了一种利用倒置共聚焦显微镜对经尾静脉注射橙色染料标记的中性粒细胞的 CX3CR1gfp/wt 小鼠体内单核细胞和中性粒细胞进行成像的实验方案。通过采集持续 30 分钟 至数小时的延时成像视频，可在稳态和炎症状态下分析白细胞在肠系膜静脉中的行为。我们还描述了使用 TLR2/TLR1 激动剂 Pam3SK4 局部诱导血管炎症，并监测随后中性粒细胞和单核细胞募集的实验步骤。
该技术还可用于监测其他白细胞群体，并利用其他刺激物或转基因小鼠研究参与白细胞募集或迁移的分子。
引言
中性粒细胞和单核细胞是先天免疫系统的细胞，持续在血液中循环。在发生损伤或感染时，炎症信号会诱导白细胞穿过血管壁迁移至受损或感染的组织，从而启动细胞免疫反应1-3。白细胞动员的速度决定了免疫反应的积极结果。这些复杂过程依赖于炎症内皮细胞上表达的特定分子（例如，选择素、内皮结合的趋化因子），这些分子有助于循环白细胞与内皮之间黏附接触的形成1-3。为了深入了解参与白细胞募集级联反应的分子机制，有必要对细胞募集的动力学过程进行可视化，并追踪各个细胞/细胞群的行为。一种有效的方法是利用表达荧光蛋白的转基因小鼠进行活体显微成像。
迄今为止，已有多种利用活体显微技术成像血管系统的方法被开发出来4,5。例如，通过活体共聚焦显微镜对耳部真皮血管系统或肠系膜静脉进行成像，已用于在稳态条件下识别小鼠Ly6Clow单核细胞和人CD14dimCD16+单核细胞在血管腔侧的巡逻行为6-8。小鼠提睾肌血管模型常用于在转基因小鼠中监测中性粒细胞或炎症性Ly6Chigh单核细胞在炎症或缺血条件下的行为。在此模型中，通过鞘内注射IL1β、CCL2、TNFβ或fMLP刺激提睾肌。注射后2-4小时，将组织手术暴露并利用活体共聚焦显微镜进行分析9-11。
以下方案描述了一种利用任意倒置荧光共聚焦显微镜同时监测单核细胞和中性粒细胞的方法。此外，本方法详细说明了如何在炎症发生前（稳态条件）和炎症发生后对同一血管进行成像，并追踪白细胞募集的动力学过程。为此，我们采用CX3CR1gfp/wt小鼠，其单核细胞表达eGFP，并通过静脉注射橙色染料标记的小鼠中性粒细胞。利用倒置共聚焦显微镜，可以实现：（1）在稳态条件下追踪和分析巡逻型Ly6Clow单核细胞；（2）在同一血管中观察炎症局部化后单核细胞和中性粒细胞的募集过程。在此，我们通过使用TLR2/TLR1激动剂Pam3CSK412来建立炎症条件。此外，若在特定基因敲除小鼠中进行该成像实验，或在阻断性抗体存在下开展实验，则此类成像有助于确定特定分子在白细胞募集级联反应各个步骤中的作用6,9,13。
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方案
注意：动物实验程序均依照瑞士日内瓦机构动物护理伦理委员会及州兽医办公室的规定进行。授权编号 GE/63/14。
1. 从骨髓制备单细胞悬液
- 通过颈椎脱位法处死小鼠（8-12周龄）。用70%乙醇对后肢进行消毒，剥除后肢皮肤。
- 解剖取出小鼠股骨和胫骨，用手术刀去除附着组织。用90%乙醇冲洗骨骼，然后放入盛有PBS的培养皿中。
- 在超净工作台内，用手术刀进一步清理股骨和胫骨上的组织，并在膝关节处分离两骨。切除每根骨骼的两端。
- 使用23G针头和装有预处理培养基（无酚红DMEM/F12，1%大鼠血清）的1 ml注射器，从每根骨骼中冲洗出骨髓，收集至50 ml螺旋盖离心管中。通过23G针头和1 ml注射器轻轻反复吹打，以分散细胞团块。用预处理培养基定容至25 ml。
- 250 × g离心5分钟，4 °C。弃上清液。将沉淀重悬于15 ml螺旋盖离心管中的1 ml红细胞裂解缓冲液（RBLC缓冲液：8.3 g NH4Cl，1 g NaHCO3，1 ml EDTA（100 mM），加蒸馏水至1 L，0.22 µm滤膜过滤）中，冰上孵育30秒 。
- 加入10 ml预处理培养基，250 × g离心5分钟，4 °C。弃上清液，将沉淀重悬于2 ml预处理培养基中。
2. 通过负向选择富集中性粒细胞
- 加入150 µl小鼠中性粒细胞富集混合液（细胞分离平台试剂盒，如EasySep）。混匀后冰上孵育10分钟。
- 加入10 ml酚红-free DMEM。轻轻倒置一次，于4 °C下以250 × g离心3分钟。
- 弃去上清液。将沉淀重悬于5 ml聚苯乙烯圆底试管中的1.75 ml预处理培养基中。加入250 µl生物素标记选择混合液。混匀后冰上孵育10分钟。
- 涡旋振荡磁性颗粒（来自细胞分离平台试剂盒）30秒，以充分重悬颗粒。向细胞悬液中加入500 µl磁性颗粒。混匀后冰上孵育10分钟。
- 将试管放入磁力架中，静置3分钟。
- 将磁力架倒置于一个新的5 ml聚苯乙烯圆底试管上，收集目标未标记细胞。切勿吸取管壁残留的最后一滴液体。不需要的细胞将保留在磁力架内的原试管中。将该试管丢弃至生物危害废物容器中。
- 将新试管放入磁力架中，静置3分钟。
- 将磁力架倒置于一个新的15 ml螺旋盖试管上，收集目标未标记细胞。切勿吸取管壁残留的最后一滴液体。
- 用酚红-free DMEM补足体积至5 ml。
3. 中性粒细胞的标记
- 加入0.5 µl橙色染料，如Cell Tracker Orange（工作浓度1 µM，CMRA – 氯甲基罗丹明乙酰乙酸酯，DMSO中储存液为10 mM）。在37 °C孵育2分钟。
- 加入2.5 ml制备培养基。在4 °C下以250 × g离心5分钟。
- 弃去上清液。将沉淀重悬于1.5 ml离心管中的1 ml制备培养基中。
- 取一部分样品，用血细胞计数板进行细胞计数。
- 在37 °C孵育5分钟。在4 °C下以250 × g离心5分钟。
- 弃去上清液。将沉淀重悬于1 ml PBS中。在4 °C下以250 × g离心5分钟以洗涤细胞。
- 弃去上清液。将沉淀重悬于PBS中，调整至每100 µl含10×106个细胞。置于冰上保存，直至进行静脉注射。注意：细胞应尽快完成静脉注射。通常每只小鼠可获得6–12×106个中性粒细胞。
4. 活体显微成像实验中小鼠的制备
注意：步骤 4.1）和 4.2）应在实验开始时进行，以避免标记的中性粒细胞在冰上长时间等待。
- 称量 CX3CR1gfp 小鼠（8-12 周龄）。
- 准备 800 µl 麻醉剂（在 PBS 中配制，含氯胺酮 60 mg/kg、赛拉嗪 4.5 mg/kg、乙酰丙嗪 1.75 mg/kg）。
- 对小鼠进行麻醉。按每 20 g 体重注射 200 µl 的剂量进行腹腔注射。通过脚趾夹捏反应和呼吸频率监测麻醉状态。
- 通过侧尾静脉或眶后窦静脉注射中性粒细胞（10×106 个细胞溶于 100 µl PBS 中），具体路径由实验人员根据操作便利性选择。
- 将小鼠置于加热垫上，并使用眼用凝胶保护眼睛。
- 将一个玻璃盖玻片（直径 35 mm）放入底部带有 30 mm 直径圆孔的 10 cm 组织培养皿中。使用油使组织培养皿与盖玻片保持紧密接触。
- 用剪刀切开腹部皮肤以暴露腹膜，再用剪刀切开腹膜以暴露肠道。
- 向腹腔内注入 200 µl 预热至 37 °C 的 PBS。用手托起小鼠并轻轻翻转使其朝下，使肠道在轻压作用下自然移出腹腔。将小鼠放置于组织培养皿中。
- 用无菌棉签轻轻将肠道展开并滚动至盖玻片上，以暴露肠系膜血管。
- 将纸巾裁成条状，并用 37 °C 预热的 PBS 浸湿。用这些湿纸巾固定肠道，以减少肠蠕动引起的移动。
- 将组织培养皿及小鼠置于倒置显微镜定制载物台上的 37 °C 恒温腔内。通过皮下注射向后肢注入含有麻醉剂的注射器。注：此外，可通过面罩向小鼠提供氧气（0.5 L/min）。
- 每 30 分钟通过脚趾夹捏和呼吸频率检查小鼠的麻醉状态。必要时追加麻醉剂（20 µl）以维持适当的麻醉深度。注：应避免血管组织干燥，因此需定期用 37 °C 预热的 PBS 浸润用于固定肠道的纸巾，以保持其湿润。
5. 测量炎症血管中中性粒细胞和单核细胞的行为 体内 使用活体显微镜技术
- 将激光器设置为488 nm和561 nm，功率调至尽可能低，以避免激光诱导的光毒性。在我们的实验中，该功率低于0.5%。单核细胞中的GFP荧光和中性粒细胞中的橙色染料荧光强度很高，通常0.3%的功率已足够。注：在本系统中，此激光功率相当于0.15至0.25 mW。
- 获取512 x 512像素的图像（即， 635 µm）在 2.2 秒内 使用倒置显微镜的20倍干镜，针孔保持开放状态。选择10至20 μm的z轴深度，以确保在低激光功率下获得足够的信号。
注意：我们通常在12至16 μm的z轴深度范围内进行实验。在本研究所展示的图像和视频中，z轴深度为20 μm。相差显微镜可用于识别内皮壁，成像部位为肠系膜静脉。 由于巡逻细胞移动较慢，速度为 5–10 µm/min 6，每20秒记录一次目标区域 结果令人满意。使用所述设置，电动载物台可同时记录最多7个目标区域。 - 将小鼠和肠系膜血管置于显微镜恒温腔内，使其从制备过程中恢复30分钟 在获取第一段录像之前，选择多个感兴趣的视野区域。聚焦于最靠近物镜的血管管腔表面。如有需要，可利用内皮细胞轻微的自发荧光来调节焦距。
注意：小鼠制备过程中的手术操作会对内皮细胞造成轻微应激，因此在前15分钟内可观察到中性粒细胞和/或单核细胞的滚动现象 小鼠制备后 - 录制一段30分钟的视频 在稳态条件下，每 20 秒采集一幅图像。
注意：该软件在 2.2 秒内采集每个感兴趣区域 电动载物台会自动从一个视野移动到另一个视野，并在20秒内返回初始位置 30 分钟内 录制的视频。 - 为诱导血管炎症，加入20 µl含100 µg TLR2/TLR1激动剂Pam3CSK4的PBS液滴 12 直接施加到成像的血管上。
- 控制每个感兴趣区域的焦点。
注意：在采集过程中，z轴焦点始终存在轻微变化。尽管z轴深度为10–20 μm，这仍可能导致荧光强度下降。因此，如有需要，在每段录像结束时手动重新对焦每个感兴趣的区域。炎症启动后，以30分钟为间隔进行录像，总时长最多至3小时。 - 实验结束时，通过颈椎脱位法处死已麻醉的小鼠。
6. 白细胞电影文件的生成与追踪
注意：尼康采集软件生成 .nd2 文件，但使用其他软件和品牌时，以下步骤类似。
- 将文件导出为 tiff 序列。
- 打开 ImageJ 软件（http://rsb.info.nih.gov/ij/），导入 tiff 序列，每个通道作为一个独立文件。
- 对绿色和红色通道应用半径为 2.0 像素的中值滤波器，以降低背景噪声（Process > Filters > Median…）。
- 将文件转换为二值图像（Process > Binary > Make Binary），并启用软件自动为每幅图像计算阈值。
- 将各通道合并为一个图像序列（Image > Color > Merge Channels…），选择绿色通道中的单核细胞、红色通道中的中性粒细胞以及灰色通道中的透射光。
- 将堆叠图像转换为 RGB 颜色模式（Image > Color > Stack to RGB）。
- 将文件保存为 .avi 格式。
- 将数据导入并整合至 Imaris 软件（Bitplane），随后使用 Spot Tracking Wizard 跟踪单核细胞和中性粒细胞的运动。
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结果
该论文描述了一种优化的实验方案，可简便地实时监测麻醉小鼠肠系膜静脉中单核细胞和中性粒细胞的行为。该方案利用一种 37 °C-恒温装置是必需的，以维持小鼠体温，并因为白细胞的运动具有温度依赖性。小鼠的准备工作如图所示 图1。图2 显示显微镜下观察到的全部区域。透射光可用于识别肠系膜静脉（红色箭头）和动脉（蓝色箭头）。
使用 ImageJ 软件处理所获得的图像，生成电影文件，例如 视频 1 和 视频 2. 图3 首次时间点图像处理的不同步骤 视频 1. 视频 1 显示Ly6C的巡逻行为低 稳态条件下单核细胞的分离，如先前所述 6,8,14 而所有中性粒细胞均在血液循环中，无一在血管内皮壁处进行巡逻。 视频 2 显示在局部施加 TLR2/TLR1 激动剂 Pam3CSK4 以启动炎症反应后 90 分钟的同一兴趣...
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讨论
本论文所述方法为在稳态和炎症条件下高效研究肠系膜静脉中单核细胞和中性粒细胞行为提供了统一的途径。
制备过程中的关键步骤是用 PBS 湿润的组织固定肠道。若操作得当，肠系膜血管将充分暴露于盖玻片上，便于图像采集。这使得可选择多个感兴趣区域，以监测肠系膜静脉中白细胞的行为。
本方案涉及在实验开始前暴露肠系膜血管，从而能够（1）在被监测的血管上直接诱导炎症，（2）记录刺激后的早期时间点，以及（3）在同一条血管中连续观察炎症诱导前后白细胞募集的动力学过程及其行为变化。
我们采用相同遗传背景的小鼠骨髓中纯化的中性粒细胞，而非血液来源的中性粒细胞，因为每只动物可获得的细胞数量更多（每只小鼠 6–12×106 vs 0.5–2×106）。如果更倾向于使用血液中性粒细胞，也可采用相同的方案进行细胞纯化。
在活体成像中，肠系膜血管的可视化可通过透射光实现。此外，也可通过静脉注射抗PECAM1...
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披露
作者声明不存在竞争性经济利益。
致谢
本工作由EMBO（资助Y.E.）、Machaon基金会（资助Y.E.）和SNSF（资助B.A.I.）提供支持。我们感谢生物成像核心设施提供尼康A1r显微镜及技术支持。感谢Clara Bartley女士对英文文本的校正。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5 ml 聚苯乙烯圆底管 | 贝克顿·迪金森 | 352058 | |
| 10倍 CFI 平场复消色差 0.45 DT：4毫米 | 尼康 | ||
| 20倍 CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT：1毫米 | 尼康 | ||
| 细胞示踪橙 CMRA 染料 | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep 磁力架 | 干细胞技术 | 18000 | |
| EasySep 小鼠中性粒细胞富集试剂盒 | 干细胞技术 | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| 香柏油 A 型 | 尼康 | 任何粘稠油状物 | |
| 生命盒温度控制系统 | 活体成像 | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| 尼康A1R共聚焦显微镜 | Nikon | A1R | 倒置显微镜，电动x/y/z载物台，NIS Elements软件 |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| 酚红-free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | 任何不含酚红的培养基均适用 |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | 用 PBS 重悬 |
| 大鼠血清 | 干细胞技术 | EasySep 小鼠中性粒细胞富集试剂盒中包含 | |
| 组织培养皿 100 | TPP | 93100 |
参考文献
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