在实时麻醉小鼠成像中性粒细胞和单核细胞在肠系膜静脉用活体显微镜

Summary

我们详细介绍了一种方案，用于在稳态和炎症条件下使用麻醉小鼠的活体共聚焦显微镜监测肠系膜静脉中性粒细胞和单核细胞的行为。

Abstract

有效的免疫反应是依赖于血液中的白细胞的快速动员到感染或损伤的部位。 调查白细胞迁移体内对于理解白细胞跨内皮迁移和相互作用与血管内皮的分子基础是至关重要的。一种有效的方法包括在表达荧光蛋白在感兴趣的细胞转基因小鼠活体显微镜。

在这里，我们提出了一个协议，用于成像的单核细胞和中性粒细胞在CX ₃ CR1 ^{GFP /}鼠标^重量静脉注射橙色染料标记的嗜中性粒细胞用倒置的共聚焦显微镜。时间推移电影收集从30分钟到几个小时的成像允许的白细胞行为在肠系膜静脉两个稳态和炎性条件下分析。我们还描述的步骤，以在本地引起血管炎症TLR2 / TLR1激动剂Pam3SK4和监控subsequeNT招聘中性粒细胞和单核细胞。

所提出的技术也可以用于监测白细胞的其他人口和调查使用等刺激或转基因小鼠的分子参与了白细胞招聘或贩运。

Introduction

嗜中性粒细胞和单核细胞是先天免疫系统，它在血液中循环连续的细胞。在损伤或感染，炎症信号诱导白细胞血细胞渗出到受损和感染的组织中，本文引发细胞免疫应答^1-3。白细胞动员的快速性决定了免疫应答的积极成果。这些复杂的过程依赖于特定的分子 （如选择素，血管内皮细胞结合的趋化因子）出现在发炎的内皮细胞，帮助循环白细胞和血管内皮细胞^1-3之间建立接触胶。要得到牵连白细胞分子见解招募级联，可视化细胞募集的动力学和跟踪每个小区/群体的行为是重要的。一种有效的方法包括在表达荧光蛋白在感兴趣的细胞的转基因小鼠活体显微镜。

内容">迄今为止，使用活体显微镜几种方法被开发以图像脉管^4,5，例如，耳真皮脉管或肠系膜静脉由活体共聚焦显微镜成像被用来确定的鼠的Ly6C ^低的单核细胞和人巡逻行为CD14 ^变暗 CD16 ^{+单核细胞}上的血管的稳定状态条件下^6-8腔侧，鼠标提睾脉管模型通常用于监测炎症或缺血性病症中的转基因小鼠嗜中性粒细胞之下或炎症的Ly6C ^高的单核细胞的行为。在这情况下，提睾通过阴囊内注射IL1β，CCL2，TNFβ或fMLP的刺激后2-4小时，组织，然后手术形象化和活体共聚焦显微镜^9-11分析。

以下方案描述了一种方法来监控单核细胞和中性粒细胞的同时与任何倒置荧光共聚焦显微镜。此外，我们的方法，详细介绍了如何前映像相同的容器（稳态条件）和炎症后如何遵循白细胞募集的动力学。为此目的，我们使用在CX ₃ CR1 ^{GFP /重量}鼠标，其单核细胞表达eGFP的，静脉注射一种橙色色素标记的鼠中性粒细胞。使用倒置共聚焦显微镜，它是可能的（1）来跟踪和分析稳态条件和（2）以符合两个单核细胞和中性粒细胞在同一容器中的后局部炎症招募下巡逻的Ly6C ^低的单核细胞。在这里，我们创建了炎症的使用TLR2 / TLR1激动剂Pam3CSK4 ^12。而且，这样的成像可有助于确定是否对特定敲除小鼠或在阻断抗体^6,9,13的存在下进行的，在各个步骤的白细胞募集级联感兴趣的特定分子的作用。

Protocol

注:动物的程序是按照动物护理在瑞士日内瓦的机构伦理委员会和州兽医办公室进行。授权号GE / 63/14

1.准备一个单细胞悬液，从骨髓

1. 牺牲小鼠（8-12周龄）颈椎脱位。消毒后腿以70％的乙醇。从后腿去除皮肤。
2. 解剖出鼠标的股骨和胫骨和腿部用手术刀去除组织。冲洗的腿与90％的乙醇和地方变成培养皿填充有PBS。
3. 根据培养罩，干净的纸巾，从股骨和胫骨用手术刀和独立的膝关节。切断骨头的两端。
4. 从每个骨骼使用23G针和1ml注射器填充有制备培养基（无酚红的DMEM / F12，1％大鼠血清），到50毫升冲洗骨髓的螺旋管。通过经由23Gね微妙传代破坏细胞聚集体edle和1ml注射器。把总体积25毫升的准备中。
5. 离心机250 XG，5分钟，4℃。弃上清。在1ml重悬沉淀红细胞溶解RBLC缓冲液（8.3克_氯化铵 ，1克_{碳酸氢钠，加入1ml} EDTA（100毫米），完整到1L蒸馏水，过滤0.22微米）在15ml的螺旋管。孵育30秒在冰上。
6. 加入10毫升制备培养基和离心机250×g离心5分钟，4℃。弃上清，悬浮在2毫升的准备中。

2.中性粒细胞富集阴性选择

1. 加入150微升鼠标中性粒细胞富集的鸡尾酒（细胞分离试剂盒的平台，如EasySep）。混合并在冰上孵育10分钟。
2. 加入10毫升酚红的DMEM。倒置一次和离心机250×g离心3分钟，4℃。
3. 弃上清。悬浮颗粒在1.75毫升制备介质在5毫升聚苯乙烯圆底管。加入250微升比奥在选择鸡尾酒。混合并在冰上孵育10分钟。
4. 涡磁性粒子（从细胞分离平台盒）30秒重悬颗粒。加入500μl磁性粒子的细胞悬浮液。混合并在冰上孵育10分钟。
5. 将管插入磁铁。等待3分钟。
6. 反转磁铁到一个新的5毫升聚苯乙烯圆底管，收集所需的未标记细胞。不要把最后一滴挂在管。不需要的细胞将保留在磁铁内部的管。丢弃该管成生物危险废物。
7. 将新管插入磁体。等待3分钟。
8. 反转磁铁到新款15毫升螺旋管，收集所需的未标记细胞。不要把最后一滴挂在管。
9. 完整体积至5ml用酚红的DMEM。

3.标签中性粒细胞

1. 添加0.5微升橙色染料如细胞跟踪橙色（工作浓度为1μM，CMRA - 氯甲基rodol乙酸酯，库存的10mM在DMSO中）。在37℃下2分钟。
2. 加入2.5毫升的准备中。离心机250 XG，5分钟，4℃。
3. 弃上清。重悬沉淀在1ml制备介质在1.5ml管中。
4. 以等分用血细胞计数器计数。
5. 孵育5分钟，在37℃。离心机250 XG，5分钟，4℃。
6. 弃上清。重悬沉淀在1ml PBS中。离心机250×g离心5分钟，4℃下洗。
7. 弃上清。悬浮颗粒每100微升PBS 10×10 ^6个细胞 。置于冰上，直到静脉注射。注:电池必须IV尽快注射越好。 6-12x10 ⁶中性粒细胞/鼠标，通常获得的。

4.鼠标准备活体显微镜

注意:步骤4.1）和4.2）应在实验开始时进行，以避免对IC标记的嗜中性粒细胞的延长的等待时间即

1. 称量CX ₃ CR1 ^GFP小鼠（8-12周龄）。
2. 制备800微升麻醉药（氯胺酮60毫克/公斤，甲苯噻嗪4.5毫克/千克，acepromazone 1.75毫克/公斤的PBS）。
3. 麻醉鼠标。注射IP用200微升/ 20克鼠标。按捏脚趾并通过检查呼吸频率控制麻醉。
4. 注入的中性粒细胞（10×10 ^6个细胞在100μlPBS中）静脉内使用的侧面尾静脉或眶后窦，在实验者的便利性。
5. 把鼠标放在加热垫，保护眼睛，眼部凝胶。
6. 的玻璃盖玻片（直径为35毫米）放置在10厘米组织培养皿，它有一个直径30毫米的孔。使用油是维持组织培养皿中的盖玻片接触。
7. 切开腹部皮肤用剪刀，露出腹膜。腹膜切开用剪刀，露出肠。
8. 加入200μl的PBS（预加热，在37℃）到peritoneal腔。拿鼠标在你的手，把它面朝下，使肠道得到了腹腔中有一个温和的压力。鼠标放置在组织培养皿。
9. 轻轻deroll用消毒棉签将肠道到盖玻片，以暴露肠系膜血管。
10. 切纸组织的乐队，与37℃加热PBS弄湿。固定与面纸的部分小肠，以减少从肠蠕动而产生的运动。
11. 把组织培养皿和鼠标37℃恒温室内部到倒置显微镜的定做托盘阶段。引入含有麻醉药SC到后腿的注射器。注:此外，鼠标可以接收氧气（0.5升/分钟）用的掩模。
12. 控制鼠标麻醉通过脚趾捏和检查呼吸频率每30分钟。如果需要，提供麻醉药的提升（20微升）妥善维持麻醉。不E:应避免脉管的干燥。因此，它的湿度是通过定期润湿用于固定肠用37℃温热的PBS的纸巾保持。

5.测量中性粒细胞和单核细胞行为发炎的血管在体内使用活体显微镜

1. 设置激光器488-和561-在需要避免激光诱导光毒性最低的功耗。在我们的实验中，这是低于0.5％。绿色荧光蛋白在单核细胞和橙色染料中性粒细胞的强度是如此明亮，通常为0.3％就足够了。注意:此表示0.15〜0.25毫瓦与我们的系统的激光功率。
2. 收购的512×512像素（ 即 635微米）的2.2秒的图像，使用倒置显微镜的20X干客观开放的针孔。使用10的Z深度20微米，以确保足够的信号与低功率的激光。
   注:我们通常用做实验用12至16的Z深度56，M。在呈现附图和电影的情况下，在z深度为20微米。相衬允许内皮墙壁的识别和成像肠系膜上静脉进行。由于巡逻细胞移动相当缓慢，5-10微米/分钟⁶的速度，记录的关注的一个领域，每20秒令人满意。所描述的设置，电动阶段允许感兴趣多达7字段的同时记录。
3. 鼠标放置在显微镜的恒温室中的肠系膜血管被允许他们从获取的第一部电影的前准备30分钟恢复。在此期间，选择感兴趣的几个领域。重点放在最接近目标容器的腔表面。如果需要，采取轻微的自体荧光血管内皮细胞的优势，设置焦点。
   注:鼠标准备在手术过程中稍微强调内皮。因此，轧制中性粒细胞和/或单核细胞所用的第一15分钟以下鼠标制剂中观察到。
4. 录制的第一部电影稳态条件下30分钟，一张图片，每20秒。
   注:该软件获取的每个感兴趣字段在2.2秒和电动阶段自动地从一个场移动到另一个。这又回到了在20秒内的第一个位置，在记录电影的30分钟。
5. 要启动血管炎症，加入20微升PBS含100微克TLR2的下降/ TLR1激动剂Pam3CSK4 ¹²直接到成像的船只。
6. 控制聚焦为每个感兴趣的领域。
   注:在收购的过程中，总有重点的对Z轴的细微变化。尽管10-20微米的z深度，这会导致降低的荧光强度的。因此，手动重新集中的每个感兴趣字段在每部电影的最后，如果需要的话。 30分钟时段和最多3个小时，拍摄电影TAL炎症开始后。
7. 在实验结束时，通过颈脱位牺牲麻醉小鼠。

6.代电影文件和白细胞跟踪

注:尼康采集软件生成.nd2文件，但下面的程序将与其他软件和品牌的同类。

1. 文件导出为TIFF系列。
2. 转到ImageJ的软件（http://rsb.info.nih.gov/ij/）。导入TIFF系列。每个信道为不同的文件。
3. 具有2.0像素为绿色和红色通道，以减少背景噪声（处理过程>滤波器>中位...）的半径应用中值滤波器。
4. 文件转换成二进制（流程>二进制>进行二进制）。启用软件来计算阈值的每个图像。
5. 合并频道合并为一个图像序列（图像>彩色>合并通道...）。选择格力的单核细胞n个信道，在红色通道，并在灰色通道的透射光的中性粒细胞。
6. 堆叠图像转换为RGB颜色（图像>颜色>堆栈RGB）。
7. 文件保存为.AVI
8. 数据被导入并在了Imaris软件（位平面）编制。单核细胞和中性粒细胞的运动即期跟踪向导，然后跟踪。

Results

手稿描述了一种优化的协议来方便地监视单核细胞和嗜中性粒细胞中的实时麻醉的小鼠的肠系膜静脉的行为。使用37℃-恒温室的是强制性的，以保持鼠标的温度，也由于白细胞的温度相关的运动。鼠标的制备显示于图1中。图2示出了所有在显微镜下看到的面积。透射光使肠系膜静脉（红色箭头）和动脉（蓝色箭头）的标识。

治疗ImageJ的软件生成的视频文件，如电影1和 Movie 2获取的图像，图3显示的不同步骤的图像处理为电影的第一个时间点1。电影1显示的Ly6C ^低的单核细胞在稳态条件下的巡逻，如前面解划线^6,8,14而所有中性粒细胞在血液中循环。不嗜中性粒细胞被巡逻的内皮墙。 电影2示出了感兴趣90分钟，同场加的TLR2 / TLR1激动剂Pam3CSK4的局...

Discussion

在这个手稿中描述的方法提供了一个一致的方法来有效地研究单核细胞和中性粒细胞行为的稳态和炎症的条件下肠系膜静脉。

制剂的关键步骤是用PBS-湿的薄纸肠的固定。如果执行得当，肠系膜血管是很好的暴露在盖玻片进行图像采集。这使得感兴趣的几个领域的选择，监测肠系膜静脉白细胞行为。

我们的方案涉及肠系膜血管的外化的实验开始前，使（1）直接诱导所监视船只炎症，和（2）刺激后，记录的早期时间点，（3），以跟进的动力学招募白细胞和前和诱导炎症后在同一容器中它们的行为。

我们TRANSF嗜中性粒细胞呃从相同遗传背景的小鼠骨髓纯化，并不会从血液随着更多的细胞可以每只动物得到（6-12x10 ⁶ VS 0.5-2x10 ⁶ /小鼠）。如果使用血液嗜中性粒细胞是优选的，相同的协议，可以进行用于细胞纯化。

在活体成像，脉管的可视化是通过在肠系膜血管的情况下的透射光启用。可替代地，针对PECAM1荧光抗...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 ml 聚苯乙烯圆底管	贝克顿·狄金森	352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45  厚度：4mm	尼康
20x CFI 平面复消色差器 VC 0.75 DT：1mm	Nikon
Cell Tracker Orange CMRA 染料	Life Technologies	C34551
EasySep 磁体	干细胞技术	18000
EasySep 小鼠中性粒细胞富集试剂盒	Stem Cell Technologies	19762
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
FCS	PAA	A15-042
浸泡油 A 型	尼康		任何粘稠油
Life Box温度控制系统	Life Imaging
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
NH4Cl	Sigma Aldrich	A9434
尼康A1R共聚焦显微镜	尼康	A1R	倒置显微镜，电动x/y/z载物台，NIS元件软件
PBS	Life Technologies	D8537
不含酚红DMEM/F12	Life Technologies	21041-025	任何不含酚红的培养基都适用于
PAM3CSK4	Invivogen	tlrl-pms	在 PBS
大鼠血清	EasySep 小鼠中性粒细胞富集试剂盒中包含的	干细胞技术
组织培养皿 100	TPP	93100