我们详细介绍了一种利用活体共聚焦显微镜在麻醉小鼠的肠系膜静脉中监测中性粒细胞和单核细胞在稳态及炎症条件下行为的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
有效的免疫反应依赖于白细胞从血液中快速迁移至感染或损伤部位。 研究白细胞迁移 体内 对于理解白细胞跨内皮迁移及其与血管内皮相互作用的分子基础至关重要。一种有效的方法是利用表达荧光蛋白的转基因小鼠进行活体显微成像。
本文介绍了一种利用倒置共聚焦显微镜对经尾静脉注射橙色染料标记的中性粒细胞的 CX3CR1gfp/wt 小鼠体内单核细胞和中性粒细胞进行成像的实验方案。通过采集持续 30 分钟 至数小时的延时成像视频，可在稳态和炎症状态下分析白细胞在肠系膜静脉中的行为。我们还描述了使用 TLR2/TLR1 激动剂 Pam3SK4 局部诱导血管炎症，并监测随后中性粒细胞和单核细胞募集的实验步骤。
该技术还可用于监测其他白细胞群体，并利用其他刺激物或转基因小鼠研究参与白细胞募集或迁移的分子。
引言
中性粒细胞和单核细胞是先天免疫系统的细胞，持续在血液中循环。在发生损伤或感染时，炎症信号会诱导白细胞穿过血管壁迁移至受损或感染的组织，从而启动细胞免疫反应1-3。白细胞动员的速度决定了免疫反应的积极结果。这些复杂过程依赖于炎症内皮细胞上表达的特定分子（例如，选择素、内皮结合的趋化因子），这些分子有助于循环白细胞与内皮之间黏附接触的形成1-3。为了深入了解参与白细胞募集级联反应的分子机制，有必要对细胞募集的动力学过程进行可视化，并追踪各个细胞/细胞群的行为。一种有效的方法是利用表达荧光蛋白的转基因小鼠进行活体显微成像。
迄今为止，已有多种利用活体显微技术成像血管系统的方法被开发出来4,5。例如，通过活体共聚焦显微镜对耳部真皮血管系统或肠系膜静脉进行成像，已用于在稳态条件下识别小鼠Ly6Clow单核细胞和人CD14dimCD16+单核细胞在血管腔侧的巡逻行为6-8。小鼠提睾肌血管模型常用于在转基因小鼠中监测中性粒细胞或炎症性Ly6Chigh单核细胞在炎症或缺血条件下的行为。在此模型中，通过鞘内注射IL1β、CCL2、TNFβ或fMLP刺激提睾肌。注射后2-4小时，将组织手术暴露并利用活体共聚焦显微镜进行分析9-11。
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方案
注意：动物实验程序均依照瑞士日内瓦机构动物护理伦理委员会及州兽医办公室的规定进行。授权编号 GE/63/14。
1. 从骨髓制备单细胞悬液
- 通过颈椎脱位法处死小鼠（8-12周龄）。用70%乙醇对后肢进行消毒，剥除后肢皮肤。
- 解剖取出小鼠股骨和胫骨，用手术刀去除附着组织。用90%乙醇冲洗骨骼，然后放入盛有PBS的培养皿中。
- 在超净工作台内，用手术刀进一步清理股骨和胫骨上的组织，并在膝关节处分离两骨。切除每根骨骼的两端。
- 使用23G针头和装有预处理培养基（无酚红DMEM/F12，1%大鼠血清）的1 ml注射器，从每根骨骼中冲洗出骨髓，收集至50 ml螺旋盖离心管中。通过23G针头和1 ml注射器轻轻反复吹打，以分散细胞团块。用预处理培养基定容至25 ml。
- 250 × g离心5分钟，4 °C。弃上清液。将沉淀重悬于15 ml螺旋盖离心管中的1 ml红细胞裂解缓冲液（RBLC缓冲液：8.3 g NH4Cl，1 g NaHCO3，1 ml EDTA（100 mM），加蒸馏水至1 L，0.22 µm滤膜过滤）中，冰上孵育30秒 。
- 加入10 ml预处理培养基，250 × g离心5分钟，4 °C。弃上清液，将沉淀重悬于2 ml预处理培养基中。
2.....
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结果
该论文描述了一种优化的实验方案，可简便地实时监测麻醉小鼠肠系膜静脉中单核细胞和中性粒细胞的行为。该方案利用一种 37 °C-恒温装置是必需的，以维持小鼠体温，并因为白细胞的运动具有温度依赖性。小鼠的准备工作如图所示 图1。图2 显示显微镜下观察到的全部区域。透射光可用于识别肠系膜静脉（红色箭头）和动脉（蓝色箭头）。
使用 ImageJ 软件处理所获得的图像，生成电影文件，例如 视频 1 和 视频 2. 图3 首次时间点图像处理的不同步骤 视频 1. 视频 1 显示Ly6C的巡逻行为低 稳态条件下单核细胞的分离，如先前所述 6,8,14 而所有中性粒细胞均在血液循环中，无一在血管内皮壁处进行巡逻。 视频 2 显示在局部施加 TLR2/TLR1 激动剂 Pam3CSK4 以启动炎症反应后 90 分钟的同一兴趣.......
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讨论
本论文所述方法为在稳态和炎症条件下高效研究肠系膜静脉中单核细胞和中性粒细胞行为提供了统一的途径。
制备过程中的关键步骤是用 PBS 湿润的组织固定肠道。若操作得当，肠系膜血管将充分暴露于盖玻片上，便于图像采集。这使得可选择多个感兴趣区域，以监测肠系膜静脉中白细胞的行为。
本方案涉及在实验开始前暴露肠系膜血管，从而能够（1）在被监测的血管上直接诱导炎症，（2）记录刺激后的早期时间点，以及（3）在同一条血管中连续观察炎症诱导前后白细胞募集的动力学过程及其行为变化。
我们采用相同遗传背景的小鼠骨髓中纯化的中性粒细胞，而非血液来源的中性粒细胞，因为每只动物可获得的细胞数量更多（每只小鼠 6–12×106 vs 0.5–2×106）。如果更倾向于使用血液中性粒细胞，也可采用相同的方案进行细胞纯化。
在活体成像中，肠系膜血管的可视化可通过透射光实现。此外，也可通过静脉注射抗PECAM1.......
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披露
作者声明不存在竞争性经济利益。
致谢
本工作由EMBO（资助Y.E.）、Machaon基金会（资助Y.E.）和SNSF（资助B.A.I.）提供支持。我们感谢生物成像核心设施提供尼康A1r显微镜及技术支持。感谢Clara Bartley女士对英文文本的校正。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5 ml 聚苯乙烯圆底管 | 贝克顿·迪金森 | 352058 | |
| 10倍 CFI 平场复消色差 0.45 DT：4毫米 | 尼康 | ||
| 20倍 CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT：1毫米 | 尼康 | ||
| 细胞示踪橙 CMRA 染料 | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep 磁力架 | 干细胞技术 | 18000 | |
| EasySep 小鼠中性粒细胞富集试剂盒 | 干细胞技术 | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| 香柏油 A 型 | 尼康 | 任何粘稠油状物 | |
| 生命盒温度控制系统 | 活体成像 | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| 尼康A1R共聚焦显微镜 | Nikon | A1R | 倒置显微镜，电动x/y/z载物台，NIS Elements软件 |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| 酚红-free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | 任何不含酚红的培养基均适用 |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | 用 PBS 重悬 |
| 大鼠血清 | 干细胞技术 | EasySep 小鼠中性粒细胞富集试剂盒中包含 | |
| 组织培养皿 100 | TPP | 93100 |
参考文献
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers....
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