腹腔内卵巢癌转移的定量分析

摘要

卵巢癌转移的特点是存在大量弥散性腹膜内病灶，因此准确目视量化肿瘤负荷具有挑战性。本文描述了一种方法 原位 和 离体 利用红色荧光蛋白（RFP）标记的肿瘤细胞和光学成像技术定量检测转移性肿瘤负荷。

摘要

上皮性卵巢癌（EOC）是美国妇科恶性肿瘤致死的首要原因。其高死亡率主要源于约75%的患者在确诊时已处于晚期，此时癌细胞已发生转移。EOC的特征是腹膜内广泛播散的弥漫性转移。原发肿瘤脱落的癌细胞附着于腹腔衬里的间皮细胞以及大网膜中，导致多灶性转移，常伴有腹腔积液。本实验室的研究致力于更深入地理解调控EOC转移成功的关键因素。然而，由于转移病灶数量多、体积小且在腹膜内分布广泛，对转移性肿瘤负荷进行定量评估构成了重大的技术挑战。本文介绍了一种利用红色荧光蛋白（RFP）标记细胞并结合荧光成像技术分析EOC转移的方法 体内 多光谱成像。在向小鼠腹腔内注射RFP标记的肿瘤细胞后，每周进行成像，直至处死动物。此时，通过手术暴露腹腔，并对器官进行成像。 原位将解剖得到的器官置于标记好的透明模板上并进行成像 离体利用多光谱解混技术在图像处理过程中去除组织自发荧光，可实现对肿瘤相对负荷的准确定量。该方法适用于多种应用场景，包括治疗学研究，用于评估可能抑制转移并从而提高总体生存率的化合物。

引言

上皮性卵巢癌（EOC）是妇科恶性肿瘤中最常见的致死原因，2015年美国预计有21,290例新发病例，约14,180例死亡¹. 绝大多数（> 75% 的女性在确诊时已处于晚期（III 期或 IV 期），表现为弥漫性腹膜内转移，预后较差。一线化疗后腹腔内疾病复发也较为常见，是导致死亡的主要原因之一。^2,3卵巢癌通过一种独特的转移机制进行扩散，该机制既包括原发肿瘤直接蔓延至邻近的腹膜器官，也包括原发肿瘤表面的细胞以单个细胞或多细胞聚集体的形式脱落或解离。这些细胞被释放到腹膜腔中，并在其中抵抗失巢凋亡。⁴腹腔积液的积聚较为常见，因为脱落的肿瘤细胞会阻塞腹膜淋巴引流，同时肿瘤分泌的生长因子可改变血管通透性。部分脱落的肿瘤细胞附着于腹腔器官及结构表面，包括肠、肝、大网膜和肠系膜，随后锚定并增殖，形成多个广泛播散的继发性病灶。^3,5血行转移较为罕见。因此，临床管理通常包括减瘤手术，如 "最佳减瘤"，定义为切除所有可见肿瘤（无论其大小）。完全细胞减灭术与总生存期的显著延长密切相关^6,7 并与病灶的识别和切除难题相关 < 0.5 cm

小型动物模型在卵巢癌研究中已显示出重要价值，有助于加深对疾病进展的理解，同时在预后生物标志物的鉴定以及新型化疗药物或联合治疗策略的测试中发挥重要作用。由于卵巢癌发生和转移的主要部位是腹膜腔，因此上皮性卵巢癌（EOC）转移的....

方案

所有体内研究均经圣母大学动物护理与使用委员会批准，并采用雌性C57/BL6J小鼠。

1. 小鼠卵巢癌细胞培养

1. 配制ID8小鼠卵巢癌细胞培养基：在1 L的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中添加4%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素、5 µg/ml胰岛素、5 µg/ml转铁蛋白和5 ng/ml亚硒酸钠。
2. 使用商业获取的表达红色荧光蛋白（RFP）及筛选标记（杀稻瘟菌素基因）的慢病毒颗粒，对ID8小鼠卵巢癌细胞¹³进行转导。注意可使用绿色荧光蛋白，但其荧光信号较弱。
   1. 转导前，将细胞培养至50–70%汇合度，并加入不含青霉素/链霉素的新鲜培养基，同时加入1 ml聚凝胺（终浓度为5 µg/ml）。
   2. 将RFP慢病毒液（20 µl）轻柔地逐滴加入培养皿中，于37 ^oC孵育72小时。弃去培养基后，更换新鲜培养基继续孵育24小时。通过向培养基中加入杀稻瘟菌素（5 µg/ml）开始对转导细胞进行筛选，并使用荧光显微镜观察红色荧光细胞（图1）。
3. 将标记RFP的细胞接种于ID8培养基中，每培养皿接种约10⁶个细胞，每日在光学显微镜下观察，直至细胞单层达到完全汇合。
4. 当细胞完全汇合时，使用胰酶（0.25%，3分钟....

结果

卵巢癌的转移机制以广泛播散的腹膜内转移为特征，表现为大小不一的多发病灶，包括多个较小（< 2毫米）病灶。因此，使用RFP标记的肿瘤细胞（图1光学成像为病灶大小的手动计数和测量提供了一种替代方法。通过每周称量小鼠体重并测量腹部周长，可评估腹水的潜在发生情况，从而确定肿瘤负荷随时间的发展变化。 在体 光学成像为评估肿瘤负荷提供了一种互补的方法（图2）。卵巢癌会转移至腹腔内的多个部位，而介导特定部位转移的分子驱动因素目前尚不清楚。除了评估总体肿瘤负荷外，在处死动物后还可通过精细解剖来观察并量化特定部位的转移模式。因此，可对腹腔器官进行光学成像 原位 (图3A、B）结合 离体 个体器官评估（图3C,D) 可提供有关总体与器官特异性肿瘤负荷的有用数据。下图所示的扫描结果 图3 代表对具有不同程度肿瘤负荷的小鼠腹腔及各个器官进行扫描的结果。例如，

讨论

与必须在免疫缺陷小鼠中进行的人类卵巢癌细胞研究不同，上述方案使用免疫功能健全的 C57/Bl6 小鼠和同源小鼠卵巢癌细胞。虽然这使得能够评估免疫浸润在肿瘤进展和转移中的潜在作用，但腹部表面的深色毛发会降低成像的敏感性。在成像前使用脱毛剂去除毛发可改善图像采集效果，但对于需要长期成像的实验而言，该步骤较为耗时。本方案中可使用无毛发的“裸鼠”，从而无需进行脱毛处理。此外，裸鼠缺乏功能性免疫系统，因此也可用于评估人类卵巢癌细胞的生长，适用于不需分析免疫系统作用的实验。

还应注意，腹膜内肿瘤的深度也会带来技术上的挑战，因为光学荧光成像通常无法检测深度超过 5 mm 的肿瘤。此外，腹水液体的普遍存在以及腹水中肿瘤细胞的存在也增加了额外的复杂性。我们观察到，即使使用相同细胞系注射，不同小鼠间腹水的形成仍存在显著的个体差异。因此，在存在腹水的情况下，该方法更适合用于终点分析器官特异性肿瘤负荷，而非对肿瘤进展进行常规的纵向成像监测。在当前示例中，不同小鼠之间的肿瘤负荷变化显著，因此通常每组四至五只小鼠即可满足统计分析的要求。若肿瘤负荷差异较小，则需要增加实验动物数量以达到足够的统计效能。尽管本文所.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Corning	10-014-CM
胎牛血清	Gibco	10437-028
青霉素/链霉素
胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme 小动物成像系统	Bruker Corp.
Bruker 多光谱软件	Bruker Corp
携带红色荧光蛋白的慢病毒颗粒	GenTarget, Inc.	LVP023
细胞培养用胰蛋白酶	Corning	25-053-CI
PBS	Corning	21-040-CM
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ImageJ 软件	http://imagej.nih.gov/ij/		免费下载
解剖工具（镊子）	Roboz Surgical Instrument	RS 5130
解剖工具（剪刀）	Roboz Surgical Instrument	RS 5910