腹腔内卵巢癌转移的定量分析

摘要

卵巢癌转移的特点是存在大量弥散性腹膜内病灶，因此准确目视量化肿瘤负荷具有挑战性。本文描述了一种方法 原位 和 离体 利用红色荧光蛋白（RFP）标记的肿瘤细胞和光学成像技术定量检测转移性肿瘤负荷。

摘要

上皮性卵巢癌（EOC）是美国妇科恶性肿瘤致死的首要原因。其高死亡率主要源于约75%的患者在确诊时已处于晚期，此时癌细胞已发生转移。EOC的特征是腹膜内广泛播散的弥漫性转移。原发肿瘤脱落的癌细胞附着于腹腔衬里的间皮细胞以及大网膜中，导致多灶性转移，常伴有腹腔积液。本实验室的研究致力于更深入地理解调控EOC转移成功的关键因素。然而，由于转移病灶数量多、体积小且在腹膜内分布广泛，对转移性肿瘤负荷进行定量评估构成了重大的技术挑战。本文介绍了一种利用红色荧光蛋白（RFP）标记细胞并结合荧光成像技术分析EOC转移的方法 体内 多光谱成像。在向小鼠腹腔内注射RFP标记的肿瘤细胞后，每周进行成像，直至处死动物。此时，通过手术暴露腹腔，并对器官进行成像。 原位将解剖得到的器官置于标记好的透明模板上并进行成像 离体利用多光谱解混技术在图像处理过程中去除组织自发荧光，可实现对肿瘤相对负荷的准确定量。该方法适用于多种应用场景，包括治疗学研究，用于评估可能抑制转移并从而提高总体生存率的化合物。

引言

上皮性卵巢癌（EOC）是妇科恶性肿瘤中最常见的致死原因，2015年美国预计有21,290例新发病例，约14,180例死亡¹. 绝大多数（> 75% 的女性在确诊时已处于晚期（III 期或 IV 期），表现为弥漫性腹膜内转移，预后较差。一线化疗后腹腔内疾病复发也较为常见，是导致死亡的主要原因之一。^2,3卵巢癌通过一种独特的转移机制进行扩散，该机制既包括原发肿瘤直接蔓延至邻近的腹膜器官，也包括原发肿瘤表面的细胞以单个细胞或多细胞聚集体的形式脱落或解离。这些细胞被释放到腹膜腔中，并在其中抵抗失巢凋亡。⁴腹腔积液的积聚较为常见，因为脱落的肿瘤细胞会阻塞腹膜淋巴引流，同时肿瘤分泌的生长因子可改变血管通透性。部分脱落的肿瘤细胞附着于腹腔器官及结构表面，包括肠、肝、大网膜和肠系膜，随后锚定并增殖，形成多个广泛播散的继发性病灶。^3,5血行转移较为罕见。因此，临床管理通常包括减瘤手术，如 "最佳减瘤"，定义为切除所有可见肿瘤（无论其大小）。完全细胞减灭术与总生存期的显著延长密切相关^6,7 并与病灶的识别和切除难题相关 < 0.5 cm

小型动物模型在卵巢癌研究中已显示出重要价值，有助于加深对疾病进展的理解，同时在预后生物标志物的鉴定以及新型化疗药物或联合治疗策略的测试中发挥重要作用。由于卵巢癌发生和转移的主要部位是腹膜腔，因此上皮性卵巢癌（EOC）转移的原位模型涉及对腹腔内病变的分析与表征。尽管近年来在肿瘤细胞成像能力方面已有显著提升，甚至能够实现单细胞水平的检测，但对EOC转移性肿瘤负荷的定量仍存在重大挑战。这些困难主要源于转移病灶的数量、大小及其解剖位置。此外，还需要对癌细胞进行标记，以将其与正常的宿主细胞区分开来。以往的研究采用基于抗体的标记方法，或通过转染使肿瘤细胞表达荧光素酶^8,9。1997年，Chishima 及其同事首次报道了对癌细胞的直接荧光标记方法¹⁰。荧光标记无需添加外源性底物，且具有极高的肿瘤细胞特异性，为追踪癌症转移提供了更为有效的方法^11,12。

本文介绍了一种利用同源异位移植模型进行转移性疾病定量分析的光学成像方法，该模型由表达红色荧光蛋白（RFP）标记的小鼠ID8卵巢癌细胞¹³和免疫功能健全的C57/Bl6小鼠组成。我们展示了一种新颖的相对肿瘤负荷定量方法，结合了活体（in vivo）与离体（ex vivo）成像，并去除了组织自发荧光的干扰。该方法在研究特定遗传、表观遗传或微环境改变和/或治疗手段对卵巢癌器官特异性转移的影响中具有潜在应用价值。

方案

所有体内研究均经圣母大学动物护理与使用委员会批准，并采用雌性C57/BL6J小鼠。

1. 小鼠卵巢癌细胞培养

1. 配制ID8小鼠卵巢癌细胞培养基：在1 L的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中添加4%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素、5 µg/ml胰岛素、5 µg/ml转铁蛋白和5 ng/ml亚硒酸钠。
2. 使用商业获取的表达红色荧光蛋白（RFP）及筛选标记（杀稻瘟菌素基因）的慢病毒颗粒，对ID8小鼠卵巢癌细胞¹³进行转导。注意可使用绿色荧光蛋白，但其荧光信号较弱。
   1. 转导前，将细胞培养至50–70%汇合度，并加入不含青霉素/链霉素的新鲜培养基，同时加入1 ml聚凝胺（终浓度为5 µg/ml）。
   2. 将RFP慢病毒液（20 µl）轻柔地逐滴加入培养皿中，于37 ^oC孵育72小时。弃去培养基后，更换新鲜培养基继续孵育24小时。通过向培养基中加入杀稻瘟菌素（5 µg/ml）开始对转导细胞进行筛选，并使用荧光显微镜观察红色荧光细胞（图1）。
3. 将标记RFP的细胞接种于ID8培养基中，每培养皿接种约10⁶个细胞，每日在光学显微镜下观察，直至细胞单层达到完全汇合。
4. 当细胞完全汇合时，使用胰酶（0.25%，3分钟）消化细胞，并将培养瓶放回37 ^oC培养箱，直至细胞脱落。
5. 用含血清的6 ml ID8培养基中和胰酶活性。反复吹打培养皿底部，然后转移至15 ml锥形离心管中。以1,200 RPM离心2分钟，随后用玻璃移液管吸除上清液。
6. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞：将细胞轻柔重悬于6 ml预热的PBS中，按步骤1.5所述条件离心。再将细胞重悬于PBS中，调整终浓度为5 × 10⁶ 个细胞/ml。细胞在注射前保持37 ^oC温育状态。

2. ID8细胞的腹腔注射及 体内 成像

1. 通过腹腔注射（i.p.），每只小鼠注射 2 mL 温热的 ID8-PBS 溶液，共注入 1000 万个细胞。让肿瘤细胞生长 体内 约10周，每周进行活体成像。
2. 注射后立即称量小鼠体重，之后每周称重一次，然后使用异氟烷（2.5% 流速，0.5 L/min 氧气）对每只小鼠进行麻醉₂ 流）。注意： 小鼠的体重测量并非作为肿瘤负荷的定量指标，而是作为评估个体小鼠在整个研究过程中总体身体状况进展的通用指标。  小鼠体重与其自身先前的体重值进行比较。  
   1. 将小鼠置于异氟烷麻醉舱中进行麻醉。在扫描过程中，通过将小鼠头部固定于鼻罩内并持续暴露于2.5%流速的异氟烷，以维持稳定的麻醉状态。
3. 使用脱毛膏去除每只小鼠躯干和腹部的毛发，因为黑色毛发会导致荧光信号衰减。涂抹脱毛膏后，用温水清洗小鼠，并用室温纸巾擦干。  
4. 麻醉后，使用小动物光学成像系统对每只小鼠的整个身体进行扫描。在每个时间点对同一批次的所有小鼠进行扫描。使用以下参数 两步法 protocol (图2A):
   1. 在步骤1中，为了观察荧光标记（RFP）的肿瘤细胞，执行多光谱采集，使用440 nm、460 nm、480 nm、520 nm和540 nm的激发滤光片以及600 nm的发射滤光片，共采集5幅图像。采用以下采集参数：标准曝光时间为15秒，2×2 binning，视场（FOV）为160 mm，f_停止 1.1 节
   2. 在步骤2中，为了观察整个动物，使用开放的激发滤光片（白光）、开放的发射滤光片、标准曝光时间0.2秒，2×2 binning，视野（FOV）为16 cm，获取反射图像。  注：实际成像时间约为1分钟。 

3. 小鼠解剖与图像采集

1. 当活体成像显示存在广泛的腹腔内病灶，或动物出现腹水积聚（表现为腹部膨隆）、体重减轻或增加超过20%时， 嗜睡或其他痛苦迹象时，使用CO₂对每只小鼠实施安乐死₂ 麻醉后行颈椎脱位。
2. 从大腿顶部至肋骨下缘，使用尖头解剖剪沿小鼠腹侧正中线向前剪开皮肤。务必小心，仅切开皮肤层图2Bi）。轻轻分离皮肤与腹膜组织，注意不要刺穿腹膜壁。
3. 使用尖头解剖剪刀，沿肋骨底部和大腿上部横向剪开，形成两片皮瓣（图2B ii,iii).
4. 将每只小鼠置于腹侧卧位（腹腔朝下），拉开皮肤瓣，对每只小鼠及其器官进行扫描 原位 使用小动物光学成像系统（图3A,B).
   1. 使用与2.4.1-2.4.2节中所述相同的图像采集参数。
5. 继续解剖小鼠，分离出各个腹膜器官，包括肝脏、网膜/胰腺、胃、膈肌、小肠、大肠、左侧和右侧腹膜、卵巢、肾脏、肠系膜和脂肪垫。
   1. 观察、清点并记录各器官上可见的肿瘤。使用卡尺测量每个肿瘤的直径。
   2. 将肿瘤大小小于 2 mm 直径为 小，介于两者之间 2 和 5 mm 作为 培养基 且大于 5 mm 作为 大.
6. 将器官放置于 器官扫描模板 (图4) 以确定每个器官的预定位置。使用 PBS 保持器官湿润。
7. 使用小动物光学成像系统扫描每张器官切片图3C,D).
   1. 使用与步骤 2.4 中所述相同的图像采集参数。
8. 扫描后，将器官置于10%甲醛中，以备后续组织学处理。

4. 荧光图像中肿瘤负荷的定量分析

1. 为了减少每次多光谱扫描中的自发荧光量，首先使用小动物成像系统配套的软件对文件进行光谱分离。
   1. 首先加载 RFP：体内实验 光谱文件，随后是 自发荧光：活体红色 在“未混合图像”窗口中选择文件并选择 解混.
2. 将 .bip 文件导出为16位未缩放的 .tiff 格式。
3. 使用 ImageJ 软件离体 器官，然后是带有器官的完整小鼠身体 原位).
   1. 使用 文件 > 开放 在 ImageJ 中打开器官扫描模板文件的 16 位 .tiff 文件。
   2. 在……下方 图像 > 调节 > 亮度/对比度，选择 设置 的 最小显示值 到 0 和 最大显示值 到 +35353 然后在以下条件下 图像 > 查找表，选择 红色荧光标记. 注意：不同的动物模型需要不同的亮度水平，但在同一项研究中必须保持亮度一致。
   3. 使用 自由选择 工具，在每个器官周围绘制一个自由形态的感兴趣区域选择（ROI），并使用 测量 使用工具（CTRL+M）计算每个器官的表面积；记录表面积 面积 每个器官的数据记录在电子表格中。
   4. 在每个器官周围绘制好感兴趣区域（ROI）后，右键单击 ROI 内部，然后选择 重复 仅包含器官。
   5. 在观察单个器官时，其下方 图像 > 调节 > 阈值，选择 设置 图像的阈值调整为 较低阈值水平 的 + 1200 和一个 上限阈值水平 的 + 1700 仅选择荧光最明亮的区域，并勾选以确认选择 暗背景；选择 好的. 注意：在 ImageJ 中，图像可能需要手动调整阈值滑块，以便在分析步骤中选中先前最亮的区域，如上图所示。  不同的疾病模型需要设置不同的阈值限制，但在同一项研究中必须保持阈值水平的一致性。
   6. 在下方 分析 > 分析颗粒，更换 大小（像素²） 到 10至无穷大，选择 显示：轮廓，勾选以仅选择 "显示结果" 并单击 好的 测量这些被视为肿瘤的亮区的面积和原始积分密度。
   7. 记录表面的数值 面积 以及 原始积分密度 每种肿瘤选择所显示的 结果 同一电子表格中包含器官表面积的表格。
   8. 下 分析 > 工具 > 校准条，为器官图像添加标定比例尺。注意：本示例中，此步骤通过更改 位置 至 右上，the 填充颜色 到 布莱克, 的 标签颜色 到 白色，the 标签数量 到 5，该 小数位数 到 0， 字体大小 到 12 和 变焦倍数 到 4.0 并实现 加粗文本.
   9. 下 文件 > 另存为…，将该组合图像保存为 .Tiff 和 .jpeg.
   10. 使用 文件 > 打开 打开器官的 .jpeg 文件，然后在 插入 > 文本框，通过在每排器官下方创建文本框来添加器官标签。
   11. 使用 文件 > 打开 按小鼠编号顺序在 ImageJ 中打开全身扫描的 16 位 .tiff 文件。
   12. 下 图像 > 调节 > 亮度/对比度，选择 设置 的 最小显示值 到 0 以及 最大显示值 到 + 35353 然后在下方 图像 > 查找表，选择 红色荧光.
   13. 下 文件 > 另存为…，将拼合图另存为 .Tiff 和 .jpeg.

5. 数据分析

1. 分别添加每只小鼠各器官的肿瘤选择区域和原始积分密度，并记录每只小鼠各器官的肿瘤总面积。
2. 通过将每只小鼠各器官的肿瘤总面积和原始积分密度总值除以相应器官的表面积，对记录的面积和原始积分密度值进行器官大小归一化处理（表 1）。
3. 计算并绘制归一化后的肿瘤表面积和归一化后的原始积分密度值的平均值（图 5A,B）。
4. 将这些平均值与肉眼观察各器官转移病灶时所目视计数得到的肿瘤数量结果进行比较。

结果

卵巢癌的转移机制以广泛播散的腹膜内转移为特征，表现为大小不一的多发病灶，包括多个较小（< 2毫米）病灶。因此，使用RFP标记的肿瘤细胞（图1光学成像为病灶大小的手动计数和测量提供了一种替代方法。通过每周称量小鼠体重并测量腹部周长，可评估腹水的潜在发生情况，从而确定肿瘤负荷随时间的发展变化。 在体 光学成像为评估肿瘤负荷提供了一种互补的方法（图2）。卵巢癌会转移至腹腔内的多个部位，而介导特定部位转移的分子驱动因素目前尚不清楚。除了评估总体肿瘤负荷外，在处死动物后还可通过精细解剖来观察并量化特定部位的转移模式。因此，可对腹腔器官进行光学成像 原位 (图3A、B）结合 离体 个体器官评估（图3C,D) 可提供有关总体与器官特异性肿瘤负荷的有用数据。下图所示的扫描结果 图3 代表对具有不同程度肿瘤负荷的小鼠腹腔及各个器官进行扫描的结果。例如，

讨论

与必须在免疫缺陷小鼠中进行的人类卵巢癌细胞研究不同，上述方案使用免疫功能健全的 C57/Bl6 小鼠和同源小鼠卵巢癌细胞。虽然这使得能够评估免疫浸润在肿瘤进展和转移中的潜在作用，但腹部表面的深色毛发会降低成像的敏感性。在成像前使用脱毛剂去除毛发可改善图像采集效果，但对于需要长期成像的实验而言，该步骤较为耗时。本方案中可使用无毛发的“裸鼠”，从而无需进行脱毛处理。此外，裸鼠缺乏功能性免疫系统，因此也可用于评估人类卵巢癌细胞的生长，适用于不需分析免疫系统作用的实验。

还应注意，腹膜内肿瘤的深度也会带来技术上的挑战，因为光学荧光成像通常无法检测深度超过 5 mm 的肿瘤。此外，腹水液体的普遍存在以及腹水中肿瘤细胞的存在也增加了额外的复杂性。我们观察到，即使使用相同细胞系注射，不同小鼠间腹水的形成仍存在显著的个体差异。因此，在存在腹水的情况下，该方法更适合用于终点分析器官特异性肿瘤负荷，而非对肿瘤进展进行常规的纵向成像监测。在当前示例中，不同小鼠之间的肿瘤负荷变化显著，因此通常每组四至五只小鼠即可满足统计分析的要求。若肿瘤负荷差异较小，则需要增加实验动物数量以达到足够的统计效能。尽管本文所...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Corning	10-014-CM
胎牛血清	Gibco	10437-028
青霉素/链霉素
胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme 小动物成像系统	Bruker Corp.
Bruker 多光谱软件	Bruker Corp
携带红色荧光蛋白的慢病毒颗粒	GenTarget, Inc.	LVP023
细胞培养用胰蛋白酶	Corning	25-053-CI
PBS	Corning	21-040-CM
脱毛膏（如 Nair 脱毛乳液）	药店购买	n/a
ImageJ 软件	http://imagej.nih.gov/ij/		免费下载
解剖工具（镊子）	Roboz Surgical Instrument	RS 5130
解剖工具（剪刀）	Roboz Surgical Instrument	RS 5910