我们展示了用于癌症光声成像的含金纳米棒细胞载体的制备方法，并探讨了其可行性。
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本文内容
摘要
摘要
金纳米棒因其在近红外窗口具有强光学吸收、低细胞毒性以及靶向肿瘤的潜力，在癌症的光热消融和光声成像等多种生物医学应用中备受关注。然而，金纳米棒向肿瘤部位的有效递送仍然是一个挑战。一种创新策略是利用肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤的趋向性，将金纳米棒负载于这些细胞中实现靶向输送。 体外在此，我们描述了含有金纳米棒的细胞载体的制备及其光声检测方法。聚乙二醇化的金纳米棒经季铵盐化合物修饰，以获得阳离子特性。当这些颗粒与普通培养皿中的小鼠巨噬细胞接触时，可被大量内吞进入内吞囊泡。随后，将这些细胞包埋于生物聚合物水凝胶中，以验证颗粒在纳入细胞载体后仍能保持其光声转换的稳定性。我们相信，这些结果可能为开发将等离激元颗粒递送至肿瘤的新策略提供新的启发。
引言
在过去十年中，各种等离激元颗粒（如金纳米棒、纳米壳和纳米笼）因其在生物医学光学中的应用而受到广泛关注1,2,3,4。与传统的金纳米球不同，这些新型颗粒在近红外（NIR）窗口具有共振特性，该窗口可实现光在生物组织中的最深穿透，并对内源性成分提供最高的光学对比度1。这一特性激发了其在光声（PA）成像和肿瘤光热消融等创新应用中的研究兴趣。然而，多个问题限制了这些颗粒的临床应用。例如，其光学激发往往导致颗粒过热，并使其功能形态向更接近球形的结构转变，从而引发光不稳定性5,6,7,8,9。另一个在科学界备受关注的问题是这些颗粒向肿瘤部位的系统性递送。具体而言，金纳米棒的尺寸既有利于穿透具有增强通透性和滞留效应的肿瘤组织，又易于与特异性恶性标志物探针偶联，因此被认为可通过直接注射进入血液循环的策略是可行的10,11,12,13。然而，该途径仍存在挑战，大多数颗粒在体内循环过程中会被单核吞噬细胞系统捕获10
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方案
注意：所有金纳米棒的浓度均以名义上的金摩尔浓度表示。为便于与其他研究进行比较，请注意，在本实验中，1 M 金大约相当于 20 µM 金纳米棒。
1. 阳离子金纳米棒的制备
注意：本方法首先采用抗坏血酸对 HAuCl4 进行自催化还原，合成由十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）包覆的金纳米棒，该步骤依据 Nikoobakht et al.25 提出的方案，并参照 Ratto et al.26 的方法进行调整。随后，通过结合聚乙二醇链10,11,27,28 和季铵化合物22，对这些金纳米棒进行修饰，以提高其生物相容性及对血浆膜的亲和力。
- 通过两次离心（12,000 × g，30 分钟）和倾倒操作，纯化 24 ml 浓度为 450 µM Au 的 CTAB 封端金纳米棒。确保本方案中所有离心步骤的残留体积与初始体积之比约为 1/200 或更低。使用 500 µM 水相 CTAB 作为洗涤液，最后将颗粒转移至 6 ml 含有 500 µM CTAB 和 0.005% (v/v) 吐温 20 的 100 mM 乙酸盐缓冲液（pH 5）中。....
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结果
本文展示了含有金纳米棒的细胞载体用于癌症光声成像的可行性，并展示了该方案的典型实验结果。
透射电子显微镜（TEM）图像 图1 显示步骤1后颗粒的典型形态以及步骤2后的细胞载体情况。颗粒和细胞用于透射电子显微镜成像的制备方法 elsewhere 有描述17阳离子型金纳米棒在巨噬细胞内大量聚集，而巨噬细胞保持正常的形态。这些颗粒被限制在紧密的内吞囊泡内。
图 2a 显示了在第3步之后，含有阳离子金纳米棒并分散于壳聚糖仿组织中的巨噬细胞的光学透射图像。如该显微照片所示，壳聚糖水凝胶包埋并未影响细胞形态。细胞在样品中分布均匀。不含细胞但含有金纳米棒的壳聚糖薄膜对照组呈均质状态。 图2b 表明当金纳米棒被巨噬细胞摄取后，.......
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讨论
靶向肿瘤相关巨噬细胞的概念正逐渐成为一种强大的抗癌策略34,35,36。在此，我们并非破坏这些细胞，而是利用其趋向性，将其招募为细胞载体，将金纳米棒递送至肿瘤内部。这一策略需要对颗粒进行精心设计，并考虑其在细胞内的整合与表征。我们发现，负载阳离子金纳米棒的小鼠巨噬细胞的光稳定性并未因颗粒被限制在内吞囊泡中而受到影响，这表明其等离子体耦合和交叉过热效应并不显著。我们推测，聚乙二醇（PEG）链的存在以及非共振形态（如金纳米球）的掺杂，可防止颗粒之间过于紧密的接触——这种接触距离分别约为颗粒直径17（约10 nm）和一个热扩散长度（在5纳秒内约30 nm），而这正是发生等离子体耦合和交叉过热的临界距离。
该方案在粒子设计及其光稳定性研究方面相较于现有方法具有创新性。步骤1中金纳米棒的设计结合了Vigderman et al.22 的观察结果，即季铵化合物能够驱动金纳米棒大量进入内吞囊泡，以及带正电荷特性的细胞穿透剂
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作部分由托斯卡纳大区和欧洲共同体在ERANET+项目LUS BUBBLE和BI-TRE框架内资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 十六烷基三甲基溴化铵 | Sigma-Aldrich | H6269 | 用于合成金纳米棒 |
| 三水合氯化金(III) | Sigma-Aldrich | 520918 | 用于合成金纳米棒 |
| 硝酸银 | Sigma-Aldrich | S6506 | 用于合成金纳米棒 |
| L-抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A5960 | 用于合成金纳米棒 |
| 硼氢化钠 | Sigma-Aldrich | 用于合成金纳米晶种 | |
| 甲氧基聚乙二醇硫醇（MeO-PEG-SH） | Iris Biotech | PEG1171 | 用于金纳米棒的聚乙二醇化修饰，分子量约为 5,000 Da。 |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | 320099 | 用于金纳米棒的聚乙二醇化修饰及溶解壳聚糖 |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | S8750 | 用于金纳米棒的聚乙二醇化修饰 |
| (11-巯基十一烷基)-N,N,N-三甲基溴化铵 | Sigma-Aldrich | 733305 | 用于通过季铵化合物修饰金纳米棒 |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | 276855 | 用于溶解(11-巯基十一烷基)-N,N,N-三甲基溴化铵 |
| 吐温-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 用于离心聚乙二醇化修饰的金纳米棒 |
| PBS | Lonza | BE17-516F | 用于在细胞孵育前悬浮金纳米棒以及处理细胞沉淀 |
| J774a.1 | ATCC | TIB-67 | 小鼠单核细胞/巨噬细胞系 |
| DMEM | Lonza | BE12-707F | 细胞培养基 |
| FBS | Lonza | DE14-801F | 需添加至细胞培养基中 |
| L-谷氨酰胺 | Lonza | BE17-605E | 需添加至细胞培养基中 |
| 青霉素/链霉素 | Lonza | DE17-602E | 需添加至细胞培养基中 |
| 培养皿 | NEST | 705001 | 细胞培养皿 |
| 细胞刮刀 | EuroClone | ES7018 | 用于剥离细胞 |
| 甲醛 | Fluka | 47630 | 用于固定细胞 |
| 低分子量壳聚糖 | Sigma-Aldrich | 448869 | 脱乙酰度 75-85%，分子量约为 120,000 Da。 |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | 306576 | 用于使壳聚糖不溶并形成水凝胶 |
| 聚苯乙烯细胞培养板 | NEST | 702011 | 用作制备壳聚糖水凝胶的模具 |
| 由Q开关Nd:YAG激光器三倍频泵浦的光学参量振荡器 | Continuum, Santa Clara, USA | Surelite OPO plus | 光声测试的光学激发源 |
| 热电探测器 | Gentec, Quebec, Canada | QE8SP | 用于监测光声测试中的光通量 |
| 预放大针式水听器 | Precision Acoustic, Dorset, UK | 传感器直径1 mm，频率范围1-20 MHz | 用于测量光声信号 |
参考文献
- Ratto, F., Matteini, P., Centi, S., Rossi, F., Pini, R. Gold nanorods as new nanochromophores for photothermal therapies. J. Biophotonics. (1-2), 4-41 (2011).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev
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