通过定量实时PCR评估小鼠乳腺肿瘤模型中的肺转移

摘要

本方案描述了如何使用定量实时 PCR（QRT-PCR）检测小鼠肺组织中代表转移灶的肿瘤细胞特异性 mRNA。

摘要

转移性疾病是指恶性肿瘤细胞从原发性癌症部位扩散至远端器官，是癌症相关死亡的主要原因¹。常见的转移部位包括肺、淋巴结、脑和骨²。驱动转移的机制是癌症研究中的重点领域。因此，能够有效检测远端转移部位转移负荷的实验方法对癌症研究至关重要。在乳腺肿瘤模型中，肺转移的评估通常通过解剖后对肺组织进行肉眼定性观察来完成。目前用于评估转移的定量方法主要局限于基于ex vivo和in vivo成像的技术，且需要用户设定参数。许多此类技术处于整体生物体水平，而非细胞水平^3-6。尽管利用多光子显微镜的新型成像方法能够在细胞水平上评估转移⁷，但这些高度精密的技术更适用于研究播散机制，而非对转移负荷进行定量评估。本文介绍一种简单的in vitro方法，可用于定量评估转移。通过定量实时PCR（QRT-PCR），可在小鼠肺组织中检测到肿瘤细胞特异性的mRNA。

引言

qRT-PCR分析被提议作为一种评估肿瘤转移的方法。该方法可为有意评估转移但可能无法获得特定设备（如 体内 成像设备或具备荧光功能的体视显微镜。本文介绍了常用方法的讨论，随后展示了定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析如何作为独立方法或辅助方法用于评估转移。该操作有望提供对转移负荷的定量分析。

传统的肉眼分析方法包括在体视显微镜下观察肺组织，以及连续切片后对肺组织进行苏木精和伊红（H&E）染色，这些方法虽可量化，但高度依赖于研究者自定义的计数参数^2-5。使用体视显微镜评估整肺时，仅能观察到较大的表面转移灶，且分析过程要求研究者对肺的解剖结构具有充分了解，以判断何为转移性病灶。通过荧光标记物（如GFP）对肿瘤细胞进行标记，并使用配备合适激发/发射波长滤光片组（例如，GFP约为470/510 nm）的体视显微镜，有助于该过程的观察，但仅能检测到表面的肿瘤结节。此外，在与GFP相同参数下可见的血液污染所发出的荧光，可能导致对潜在转移病灶的误判。

对肺组织进行切片并进行苏木精和伊红（H&E）染色以观察肺转移，是评估微转移灶及其他微观过程（包括免疫细胞浸润）的有效方法。然而，该方法通常需要使用完整的肺组织进行石蜡包埋、切片和染色，因此后续实验操作难以开展。尽管该方法可进行定量分析，但研究人员需评估每只动物大量的染色肺切片，以确保分析涵盖肺组织的完整三维结构。因此，此类检测耗时较长，容易产生计数误差，且分析结果在很大程度上依赖于研究人员的主观判断。

目前，多种 体内 成像技术（例如 MRI、PET、SPECT）被用于在实验性啮齿类动物模型中进行或检测生物学过程⁸。体内 生物发光成像是一种常用方法，用于整体观察转移情况⁹。该技术通常用于评估由于肿瘤细胞在特定器官（如肿瘤细胞植入后的乳腺组织或自发转移后的肺组织）中积聚而产生的荧光素酶报告基因活性，这些肿瘤细胞经过基因工程改造，含有荧光素酶响应元件¹⁰。荧光素酶报告基因活性的可视化依赖于荧光素底物（D-荧光素）的存在。荧光素酶催化D-荧光素的氧化脱羧反应生成氧化荧光素，从而产生生物发光信号。尽管该方法具有信息价值，但其应用受到若干因素的限制，包括底物稳定性（即 半衰期短）、底物在体内的分布是否充分（这取决于向实验动物递送底物的方式）以及检测灵敏度较低⁹。该技术的一个主要优点是具有非侵入性，可在活体动物上重复进行，并可检测到在常规解剖时可能未被采集的多个器官中的肿瘤细胞转移灶^9,10。

一个积极的方面是 体内 成像技术的一个优势在于肺组织保持完整，可进行后续操作，如石蜡包埋或如本文所示的QRT-PCR分析。然而，由于QRT-PCR在理论上具有更高的检测灵敏度，肉眼评估可能无法发现肺组织中少量存在的肿瘤细胞。尽管上述成像技术具有实用价值，但仍可被当前所述的QRT-PCR方法替代或作为补充。QRT-PCR有望对肺组织中肿瘤来源的mRNA提供高灵敏度的检测。

方案

该方案遵循南卡罗来纳医科大学（MUSC）及其机构动物护理与使用委员会（IACUC）的指南和动物护理标准。

1. 肺组织解剖

1. 乳腺肿瘤解剖（根据研究目的以及是否进行了原发肿瘤分析或尾静脉注射，此步骤可选）。
   1. 根据IACUC及大学规定，使用致死剂量的异氟烷麻醉剂处死小鼠。通过手术脱位法确认动物死亡。 
   2. 将小鼠仰卧固定于泡沫板上，四肢展开，用解剖针固定。
   3. 用70%乙醇喷洒小鼠体表。
   4. 使用镊子夹住动物下腹部中央部位。
   5. 使用剪刀从腹部向上沿中线剪开皮肤，注意避免刺破小鼠腹膜腔。
   6. 向四肢方向剥离皮肤，暴露肿瘤组织。
   7. 分离出肿瘤组织，并采用适当方法（如冷冻或固定）保存以供进一步分析（本方案中不再详述）。 
2. 肺组织解剖。
   1. 若已按上述方法取下肿瘤组织，需将多余皮肤固定。
   2. 使用镊子夹住动物下端腹膜，向上剪至颈部基部。
   3. 沿肋骨左右两侧小心剪开，注意避免切断可能引起胸腔出血的血管。通过剪开膈肌及肋骨上部，在左右两侧切断以移除肋骨。
   4. 用镊子夹住小鼠气管并向前牵拉。
   5. 用解剖剪剪断气管，取出肺组织。
      注意：心脏可能仍附着于肺组织。若出现此情况，应小心将心脏从肺组织上分离，确保完整收集全部五个肺叶（见图1）。
   6. 用PBS轻轻冲洗，去除多余血液。
3. 肺组织的大体评估。
   1. 选项1：体内成像。
      1. 进行荧光素酶成像前约10分钟，通过腹腔（i.p.）注射给予动物150 mg/kg剂量的荧光素。在麻醉状态下的活体动物中进行肺部体内成像，或在解剖取出后进行成像（图2）⁵。
   2. 选项2：大体评估。
      1. 在体视显微镜下检查肺组织，观察肿瘤结节。注意：若细胞标记了GFP，可在处理前使用具备荧光检测功能的体视显微镜，配备合适激发/发射波长（例如约470/510 nm）的滤光片组，对肺组织进行荧光立体观察。
   3. 若需立即分析肺组织，请进入“RNA提取”部分。否则，使用液氮或干冰速冻组织，并于-80 °C保存。

2. RNA 提取

注意：在代表性分析中，RNA 使用 RNA 提取试剂盒（参见材料列表）进行分离。尽管当前分析使用的是某一个特定厂商的产品，但多个知名供应商均提供多种可用的提取试剂盒。此外，也可采用基于离心的非试剂盒方法。还应从阳性对照 RNA 样本（如细胞系或质粒）制备 cDNA，用于标准曲线分析。或者，也可购买针对引物探针组的特异性阳性对照（参见材料列表）。

1. 若使用先前冷冻的组织，需在干冰上收集冷冻组织。
2. 使用以下方法之一进行组织匀浆：将组织在液氮中冷冻后，在干冰上用手持研钵和研杵研磨；根据制造商建议使用组织匀浆器或机械解离装置；超声处理，或其他首选方法。
   注意：在代表性分析中，推荐的匀浆化方法是超声处理。
   1. 对于所呈现的分析 图3，配制裂解缓冲液（RNA提取试剂盒中提供）与2-巯基乙醇，每1 ml裂解缓冲液中加入20 µl 2-巯基乙醇。每30 g组织用300 µl含2-巯基乙醇的裂解缓冲液重悬组织，在30%振幅下超声处理10秒。
   2. 若使用研钵和研杵，在研磨后将研碎的组织重悬于300 µl裂解缓冲液中。
3. 向590 µl TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA）中加入10 µl蛋白酶K。每300 µl样品中加入600 µl蛋白酶K溶液（即 每30 mg组织加入相应试剂，在室温下孵育10分钟。
   注意：消化时间可能有所不同。  
4. 以 ≥13,000 g 离心 10 分钟，去除碎片。
5. 将上清液转移至新试管中。
6. 每900 µl上清液中加入450 µl乙醇（96%-100%），以沉淀RNA。
7. 将700 µl裂解液/乙醇混合物转移至柱中。
8. 以 ≥13,000 g 离心样品 1 分钟，使 RNA 结合至层析柱。
9. 弃去废液，将剩余上清液加入层析柱中，再次离心。
10. 待所有裂解液通过柱子后，向柱子上部加入350 µl洗涤缓冲液1，于≥13,000 g离心30秒。
11. 弃去柱中的液体并更换上部。
12. 将每份样品的5单位DNase I酶与5 µl 10x DNase缓冲液及40 µl无DNase/RNase水混合，配制DNase工作液（每份样品总体积为50 µl）。
13. 向每个柱中加入 50 µl DNase 混合液，室温孵育 15 分钟。
14. 向柱中加入 350 µl 洗涤缓冲液 1，于 ≥13,000 g 离心 30 秒。
15. 弃去柱中的液体并更换上部。
16. 向柱中加入 600 µl 洗涤缓冲液 2，在 ≥13,000 g 条件下离心 30 秒。
17. 弃去柱中的液体并更换上部。
18. 加入250 µl 洗涤缓冲液2，以≥13,000 g离心2分钟。
19. 将部分柱体转移至新的收集管中，并弃去旧的收集管。
20. 向柱中加入 50–100 µl 无 RNase/DNase 的水，孵育 1 分钟。
21. 以 ≥13,000 g 离心 1 分钟。
22. 将收集的洗脱液重新通过层析柱，以提高RNA得率。
23. 立即使用时，将样品置于冰上并进行定量。如需后续使用，用干冰或液氮速冻，于-80 °C冰箱中保存至需要时取出。

3. 第一链合成

注意：在代表性分析中，反转录（RT）反应使用专为定量反转录 PCR（QRT-PCR）设计的第一链 cDNA 合成试剂盒进行（参见材料列表）。

1. 若样品先前已采集，请将管置于冰上解冻。
2. 使用分光光度计测定RNA含量。
3. 取0.5–2 µg总RNA，利用逆转录酶进行第一链合成，制备cDNA原液。
   1. 在无菌、无RNase/DNase的PCR管或板中配制反应体系（表1）。轻轻混匀并离心。设置标准PCR仪程序（表2）。
4. 使用无菌无核酸酶水将完成的反应体系稀释至所需体积（通常为50–100 µl）。

4. 实时荧光定量PCR

注意：在代表性分析中使用了SYBR Green，但用户可根据需要自行选择其他方法替代。

1. 使用阳性对照 cDNA，为每对引物建立标准曲线。
   1. 对于图3所示的分析，使用制造商推荐的阳性对照 cDNA（参见材料清单）制备人源HER2的标准曲线。对于小鼠gapdh，使用阴性对照肺组织 cDNA 生成标准曲线。针对每种探针，将 cDNA 进行1:4的系列稀释，制备5个标准品。
2. 计算总样本数量，应包括标准曲线样本和实验样本。
   注意：在本实验描述的分析中，每个样本分析了2-3个实验重复。通过标准曲线分析建立简单的线性回归模型，用于确定每个样本中HER2和gapdh的相对含量，从而计算最终的归一化定量值。该分析还可确保引物扩增效率适用于当前分析。
3. 在无菌、无RNase/DNase的离心管中配制主混合液（表3）。
   1. 计算每样本所需的主混合液量。若样本数量超过一个，则相应放大体积。针对每个目标实验基因以及内参对照（如gapdh）分别配制主混合液。gapdh引物的终浓度为200 nM。
      注意：当需要区分人源与小鼠细胞来源时，内参对照尤为有用。
      注意：HER2引物浓度已由制造商优化并确定。
4. 准备检测板，每孔加入对应于各标准品或实验样本的1 µl cDNA。每对引物探针至少分配一个cDNA样本/孔。每孔每对引物探针加入19 µl主混合液。
   注意：对于图3中的代表性数据，每个引物探针对每个cDNA样本进行了双复孔分析，并以两个样本的平均值作图。
5. 在QRT-PCR仪中运行反应，使用推荐或先前验证过的PCR程序。有关图3和图4代表性数据所用的PCR程序，请参见表4。 

结果

除了进行实验动物肿瘤细胞初次接种所需的时间外，若还需进行原代 体内 肿瘤分析、组织收获、RNA提取及定量逆转录聚合酶链式反应（QRT-PCR）分析为1-2天的实验流程（图1).

大体分析的一个示例是利用生物发光成像来评估肺组织中的肿瘤细胞。在此项实验中，研究人员开展了乳腺肿瘤发生研究，以评估一种靶向缝隙连接蛋白 connexin43（称为 ACT1）的在研药物是否能够抑制 4T1-luc 乳腺肿瘤细胞向肺部的自发性转移。经过数周的治疗后，接受安慰剂或试验药物的动物均被注射荧光素酶底物 luciferin，随后处死。解剖后，通过检测肺组织中的荧光素酶生物发光信号进行观察。从代表性图像可见，接受药物治疗动物的肺组织未显示荧光素酶活性，表明肺内无肿瘤细胞存在，提示 ACT1 治疗后可能抑制了转移（图 2A）。这些代表性图像的主要目的是证明生物发光成像是检测转移的一种合适方法...

讨论

本方案描述了使用定量逆转录聚合酶链式反应（QRT-PCR）结合异种移植小鼠模型，评估乳腺肿瘤细胞向肺部转移的方法。尽管其他技术（包括生物发光成像）也可用于检测转移，并且各有其优势与局限性，但已有研究认可这些方法的有效性。本文提供的数据表明，QRT-PCR 可有效检测肺组织中来源于肿瘤的 mRNA，从而实现对总体转移负荷的定量分析。因此，建议将 QRT-PCR 分析作为补充手段，或在特定情况下替代成像技术使用。该技术可能特别适用于缺乏特定设备的研究环境，或适用于关注转移负担而非深入机制研究的科研团队。

尽管具有信息性，但此处描述的实时定量 PCR（QRT-PCR）分析存在局限性。由于整个肺组织均用于 RNA 提取，因此无法进行其他下游分析，包括免疫组织化学（IHC）或免疫荧光（IF）染色。然而，若结合体内成像技术，则可在成像后分离肺组织，以进行此类二次分析。此外，该技术仅限于检测 mRNA，因此除非使用多功能提取试剂盒对肺组织进行处理，否则无法进行蛋白质分析。对所得蛋白质的分析仍局限于评估包含肿瘤和肺组织的总蛋白混合物，而 IHC/IF 则可通过 IHC/IF 染色...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Fisher	BP176-100
DNA酶	Thermo Scientific	EN0521
GeneJet RNA 提取试剂盒	Thermo Scientific	K0732
iScript 反转录超级混合液（用于定量反转录PCR）	Bio-Rad	1708841
iTaq 通用 SYBR Green 超级混合液	Bio-Rad	172-5121
PrimePCR SYBR Green 检测试剂：ERBB2，人源	Bio-Rad	100-25636
PrimePCR SYBR Green 检测模板：ERBB2，人源	Bio-Rad	100-25716
gapdh 引物序列			正向引物-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG 反向引物-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG