利用单感器记录技术检测臭虫嗅觉神经元对化学信号物质的电生理反应

摘要

臭虫依靠其触角嗅觉感受器中的嗅觉受体神经元来探测环境中的化学信号物质。通过单感受器记录技术，我们展示了一种评估臭虫对化学信号物质反应的方法，并探讨了其中涉及的编码过程。

摘要

昆虫的嗅觉系统在探测环境中化学信号分子方面起着重要作用。特别是触角上的嗅觉感受器，其内部包含一个或多个神经元，被认为是响应化学刺激的主要结构。通过在刺激暴露后直接记录嗅觉感受器中的动作电位，单感受器记录（SSR）技术为研究昆虫对化学刺激的神经反应提供了一种强有力的手段。对于臭虫这一臭名昭著的人体寄生虫，已鉴定出多种类型的嗅觉感受器。在本研究中，我们利用SSR方法展示了臭虫嗅觉感受器对两种化学刺激物的神经反应，以及对其中一种刺激物的剂量依赖性反应。该方法使研究人员能够对作用于臭虫嗅觉感受器的单个化学刺激物进行早期筛选，从而为开发新型臭虫引诱剂或驱避剂提供有价值的信息，并有助于推动臭虫防控工作。

引言

常见的床虱 Cimex lectularius L（半翅目：臭虫科）是一种暂时性体外寄生虫，属于专性吸血昆虫，其生存、发育和繁殖需要从包括人类和动物在内的宿主身上获取血液资源^1,2。尽管目前极少有因 C. lectularius 引起病毒传播的报道，但其叮咬所造成的困扰在生理和心理上均对宿主产生严重影响³。化学杀虫剂的引入和广泛使用，特别是滴滴涕（DDT）的应用，曾显著降低了床虱侵扰的风险，到20世纪50年代末，侵扰水平已降至不再被视为严重公共卫生问题的程度。然而，多种潜在因素导致了全球范围内床虱种群的重新暴发，例如杀虫剂使用减少、公众防范意识下降、旅行活动增加以及对杀虫剂抗性的产生^4-9。

昆虫通过触角和下颚须等嗅觉器官来检测和识别环境中的化学信号。昆虫触角上的嗅觉感器在检测这些化学信号中起着关键作用。化学分子通过表皮表面的孔隙进入触角表皮。触角淋巴液中的气味结合蛋白与这些化学分子结合，并将其转运至气味受体¹⁰。气味受体及其共受体在神经膜上形成非选择性阳离子通道，当气味受体识别这些化学分子后，该通道将发生去极化¹¹。

单感器记录技术（SSR）用于检测施加化学或非化学刺激后动作电位在细胞外发生的变化。通过将记录电极插入感器淋巴液中，同时将参考电极插入昆虫身体的其他部位（通常为复眼或腹部），即可记录神经元对刺激的放电频率¹²。放电峰数量的变化反映了昆虫对特定刺激的敏感性。不同性质和浓度的化学刺激会引发不同的神经反应，表现为不同的放电频率和时间结构，因此可用于研究昆虫对特定化学物质的信息编码过程。

对于常见的床虱，两种性别在触角上的嗅觉感器分布模式相同：9个具沟的钉状C型感器，29个毛状E型（E1和E2）感器，以及各一对的Dα、Dβ、Dγ光滑钉状感器^13,14。由于已在每种感器类型中鉴定出多个神经元，因此难以区分同一感器内不同神经元的动作电位。因此，在本实验中，分别在刺激前后离线统计500毫秒时间内的总动作电位数量。然后用刺激后的动作电位数减去刺激前的动作电位数，再乘以2，以量化每个单独感器每秒放电频率的变化（单位：峰/秒）¹⁵。

方案

1. 实验仪器、刺激溶液及臭虫的准备

1. 配制50% KNO₃溶液₂ 溶液（w/v）置于20 ml瓶中。
2. 将两根钨微电极在 KNO₃ 中 sharpen₂ 以5 V电压通过反复将钨电极浸入和抽出溶液来处理溶液。
   1. 通过将约10 mm长的钨丝反复浸入熔融的KNO₃中，对其进行粗略打磨。₂ 以每秒2次浸入的速度将溶液处理 约5分钟，这会极大地消耗钨丝的前端。
   2. 通过以每秒2次的频率将金属丝尖端约1 mm部分浸入并抽出溶液，精细地 sharpen 电极 至少 1 分钟 以便使电极尖端细而锐利。在显微镜下频繁检查电极尖端直径，直至达到0.2–0.5 µm，此尺寸足以刺穿臭虫嗅觉感器的角质层。
      注意：手动打磨电极时，钨丝浸入 KNO₃ 溶液的速度应保持缓慢且稳定。₂ 溶液的流速并非始终恒定。随着操作熟练度的提高，更容易在电极尖端打磨过程中保持相对恒定的速度。打磨时间也不确定，具体取决于所需电极的精细程度。此处，电极尖端直径约为0.2 µm即足以刺入嗅觉感器。
3. 将每种化学刺激物用二甲基亚砜（DMSO）从纯化合物稀释至1:10 v/v的初始浓度，作为储备液。根据实验所需的剂量数量，再用DMSO对每种化学物质的储备液进行系列十倍稀释。此处使用10% (+)-β-蒎烯和桉叶素。
4. 将未进食或吸血后七天的成年臭虫（雄性或雌性），来自Ft. Dix种群（由肯塔基大学Dr. Haynes惠赠），用于实验时置于培养皿中。
   注：在培养皿中放置的床虫数量没有确切规定，可以是几只，也可以是很多只。

2. 臭虫触角制备

1. 将臭虫置于冰上麻醉（2-3 分钟）。
2. 用双面胶带将触角和虫体固定在显微镜盖玻片上，并用精细剪刀去除足部。
3. 使用细小的针轻轻触碰触角，使其稳定地粘附在胶带上。
4. 将盖玻片靠在一个小球状牙科蜡（直径约 1 cm）上以方便操作，并调整至适当角度（约 90°），便于记录电极插入（图 1）。
5. 固定后，将臭虫置于体视显微镜下，打开冷光源，调节光照强度直至触角清晰可见，并在高倍镜（720X）下聚焦于臭虫触角的第二节鞭节。
   注意：实验中使用的光照强度未进行量化，实际强度取决于实验者对光照强度的主观感受。

3. 单感器记录

1. 将前置放大器（10X）连接至信号采集控制器，该控制器与用于信号记录和可视化的计算机相连。打开计算机并启动软件。 例如，AutoSpike32 并单击 "记录" 从菜单栏中选择模式。然后选择 "波" 以便开始记录波形信号。
   注意：此时应可见一条从监视器左侧反复延伸至右侧的水平直线。此处记录窗口持续时间为40秒，最大波形记录时长为10秒。选定采样率为96000，数字采样率为240。偏移量为0%，记录信号无滤波、无整流。软件中的所有这些参数设置均可根据需要进行调整。
2. 打开连接至前置放大器的扬声器，用于呈现触角感器神经元反应的音调模式。
3. 将参考电极插入已固定的臭虫腹部。
   注意：参比电极由固定在气浮台上的金属支架通过磁力固定。
4. 将参考电极连接至臭虫腹部后，移动与前置放大器相连并由显微操作器操控的记录电极，使其靠近臭虫触角的后端。
5. 当记录电极接触天线右端时，打开显微镜，并在低倍镜下定位电极。
6. 在显微镜下逐渐增加放大倍数的同时调整记录电极，直至电极与触角感器处于同一平面且清晰可见。
   注意：此时显微镜通常已调至最高放大倍数。
7. 使用显微操作器将记录电极插入感器的杆部，若背景噪声较动作电位高，可略微加深插入深度。
8. 当从记录的感受器中观察到清晰的动作电位后，用10% (+)-β-蒎烯填充一支微移液管。将10 µl的10% (+)-β-蒎烯滴加到置于玻璃巴斯德吸管内的一条滤纸条（约3 × 15 mm）上。
   1. 将已装液的移液器连接至刺激控制器脉冲流管的出口，并将移液器尖端插入朝向触角方向的导管小孔中。
9. 当所有连接稳定后，踩下刺激控制器的脚踏开关，向持续湿润的气流中注入一次持续0.5秒的刺激气流（0.5 L/min）。动作电位的记录将在踩下脚踏开关的同时启动，记录过程持续10秒，自刺激开始前1秒起计。
10. 离线统计刺激前和刺激后两个500毫秒时间段内的动作电位数量。将刺激后500毫秒内的放电频率变化减去前一个500毫秒内记录的自发活动放电频率，并将计数结果乘以2，换算为常规单位（spikes/s）。

4. SSR 中的刺激替代

1. 脚踏开关触发后，将移液器中的10% (+)-β-蒎烯递送到臭虫触角上，并记录该特定气味分子引起的反应，持续10秒，随后移除移液器。
2. 标记另一支新的移液器，用于测试0.001%桉油醇。将已加入10 µl刺激物的小片滤纸放入该移液器中。
3. 等待2至5分钟，直至刺激物在玻璃移液器中完全挥发。将移液器连接至脉冲气流管的出口端。
4. 将移液器尖端插入朝向触角方向的管壁小孔中。踩下脚踏开关，开始10秒的记录。
5. 断开移液器，准备另一支含有0.01%桉油醇的移液器。
6. 依次测试桉油醇其余各浓度梯度（从0.001%至10%）在触角感器上的反应，以观察剂量依赖性响应。测试顺序应从最低浓度到最高浓度进行。

结果

单感器记录是一种在昆虫化学生态学和神经生理学研究中广泛应用的强有力研究技术。通过研究昆虫神经对不同挥发性化合物的反应，尤其是那些被认为在生态上与昆虫生存和发育相关的化合物，不仅能够为我们提供关于昆虫嗅觉过程的宝贵见解，还可能开辟出新的研究途径，进而推动开发出可用于害虫防治的有效新试剂。

臭虫作为一种臭名昭著的城市害虫，无疑吸引了众多研究人员的关注。在与臭虫相关的诸多研究领域中，其嗅觉机制对于臭虫的化学生态学具有至关重要的意义。以往的研究已明确描述了臭虫触角上不同类型嗅觉感器的数量与分布情况。如图2A所示，臭虫的触角由四个节段组成（SC、PE、F1和F2）。大多数嗅觉感器分布于第2鞭节（F2）的末端后侧，但不同类型感器的分布模式明显不同：D型感器（即Dα、Dβ和Dγ）仅位于触角内侧（图2C），而C型和E型（E1和E2）感器则分布在触角两侧（图2B）。因此...

讨论

单感器记录技术已广泛用于检测果蝇、蚊子和床虱等昆虫对环境中不同化学刺激物的神经反应。这些化学刺激物通常溶解并稀释于一种常用溶剂中，以配制不同浓度的处理溶液。然而，不同溶剂可能导致刺激物释放速率存在显著差异。以往对某些研究较为深入的昆虫的研究表明 黑腹果蝇, Anopheles gambiae, 致倦库蚊 和 Aedes aegypti 有 通常使用石蜡油作为溶剂来溶解刺激物，因为这些昆虫对石蜡油相对不敏感^17-20石蜡油也曾在早期的臭虫单感器记录研究中使用，原因相同。¹⁴然而，最常用的溶剂未必对每种昆虫都最适宜。以床虫为例，在不同的研究中，均使用了石蜡油和DMSO来溶解刺激物，而床虫对这两种溶剂也表现出不敏感性。^14,15但相同剂量的刺激物溶解于DMSO时，对臭虫感受器的神经反应明显更强。例如，溶解于DMSO的R-(+)-柠檬烯和S-(-)-柠檬烯可使臭虫触角Dγ感受器产生≥70次/秒的神经放电反应，而溶解于石蜡油的柠檬烯仅引起Dγ感受器≤25次/秒的神经反应。这种神经反应减弱的现象...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钨丝	A-M SYSTEMS	#716500	用于制备电极
KNO₂	Sigma	#310484	用于打磨钨丝
交流电源	BK Precision	1653A	为打磨钨丝提供电压
Leica Z6 APO 显微镜	Leica	10447424	用于观察触角上的感觉器
刺激控制器	Syntech	CS-55	用于控制刺激施加
4通道USB信号采集控制器	Syntech	IDAC-4	记录前和记录期间所有信号的实时屏幕显示
光源	SCHOTT	A20500	为观察提供照明
显微操作器	Leica	115378	用于微调电极位置
扬声器	Juster	95a	连接至信号采集控制器IDAC-4，用于输出信号声音
磁力支架	Narishige	GJ-1	用于固定参考电极、固定臭虫以及刺激递送管
TMC 振动隔离台	TMC	63-500	用于隔离设备振动
盖玻片	Tedpella	2225-1	用于固定臭虫
双面胶带	3M	XT6110	用于将臭虫固定在盖玻片上
牙科蜡	Dentakit	DK-R012	用于支撑固定臭虫的盖玻片