将微珠移植至鸡胚肢体发育区域以鉴定影响基因表达的信号转导通路

摘要

通过将浸泡过生长因子或特定信号通路抑制剂的微珠移植到发育中的胚胎中，可直接检测这些因子的作用效果 体内在此方案中，将含有分子的微珠植入肢芽，以确定这些分子对基因表达和信号转导的影响。

摘要

利用鸡胚可直接检测生长因子或信号通路特异性抑制剂对基因表达及信号转导通路激活的影响。该技术能够在精确设定的发育阶段，于特定时间内递送信号分子。随后可收获胚胎并检测基因表达，例如通过 原位 杂交，或通过免疫染色观察到的信号转导通路激活。

在此视频中，将浸有 FGF18 的肝素珠或浸有 MEK 抑制剂 U0126 的 AG 1-X2 珠移植至肢芽中 在卵内这表明FGF18可诱导MyoD表达及ERK磷酸化，且内源性及FGF18诱导的MyoD表达均可被U0126抑制。经视黄酸拮抗剂浸泡的琼脂珠可增强FGF18对MyoD的过早诱导。

该方法可与多种不同的生长因子和抑制剂联用，且易于适用于发育中胚胎的其他组织。

引言

鸟类胚胎多年来为发育研究提供了强有力的工具¹。其最有用的特性之一是相对易于操作。由于胚胎体外发育，可以打开蛋壳以接触胚胎，并进行多种显微操作，例如经典的鹌鹑-鸡嵌合体系统用于研究细胞命运^2,3，在发育过程中通过注射逆转录病毒实现特定组织中的基因过表达^4,5，以及通过外植体培养来鉴定发育信号来源⁶。最近，将非标记宿主与表达GFP的转基因鸡系供体组织构建的嵌合体研究表明，经典移植技术与遗传修饰相结合可为发育机制提供重要见解^7,8。

禽类胚胎易于操作的特性使其成为研究肢体发育的优良模型⁹特定生长因子在肢体发育过程中的应用 体内 在鉴定影响肢体模式形成的因素方面发挥了关键作用^10,11 并持续为这一过程提供新的见解¹²该方法还被用于研究调控肌肉发育的因素，并揭示了多种信号分子的作用，例如 Wnts¹³BMPs¹⁴ 和HGF¹⁵.

最近，该技术已被用于研究控制肢芽中成肌基因表达的信号，结果表明FGF18与视黄酸之间的相互作用可以调控MyoD表达的时间¹⁶。通过结合使用可加载到琼脂糖珠上的生长因子和小分子，并在特定发育阶段将其直接移植到特定组织中，可以在发育过程中的几乎任何时间和区域进行干预。该方法已被用于研究多种发育过程，包括体节模式形成^17,18、神经特化¹⁹、神经嵴细胞迁移²⁰以及体轴延伸²¹。

本文介绍了一种将浸泡过生长因子或抑制剂的珠子移植到发育中鸡胚肢体的方法。该方法已用于通过分析肌肉特异性基因表达来确定这些信号分子对肌生成的影响。 原位 杂交。我们描述了使用肝素浸泡的珠粒进行移植物操作，这种珠粒用于递送生长因子，或使用AG 1-X2珠粒递送疏水性小分子，如视黄酸或特定信号通路的小分子抑制剂。然而，也有其他类型的珠粒可用于递送FGFs²² 和 Shh²³.

方案

伦理声明：所有这些实验均遵循诺丁汉大学的动物护理与伦理准则。

1. 准备用于移植的肝素珠

1. 使用前用 PBS 充分洗涤肝素珠。注意：珠子可作为 PBS 悬液在 4 °C 下保存。
   1. 用 20 µl 移液器将珠子从储备液中移至 1 ml PBS 液滴中，以选择用于移植的珠子。然后使用设定为 2 µl 的微量移液器将珠子转移至 3 cm 培养皿中 20 µl 的 PBS 液滴内。根据珠子大小进行挑选，并在体视解剖显微镜下使用 P2 移液器吸头转移所选珠子；直径约 100 µm 的珠子最为理想。
2. 去除珠子中的 PBS。先用 20 µl 移液器吸除大部分液体，再用精细钟表镊通过毛细作用除去残留液体。注意：应尽可能彻底去除液体，以免加入生长因子时被稀释。
3. 将生长因子直接滴加到珠子上。对于 FGF18，加入 0.5 µl 用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬至 0.5 mg/ml 的重组 FGF18。在培养皿边缘放置数滴水，以防止液体蒸发。
4. 在室温下孵育珠子 1 小时。用巴斯德移液管吸除培养皿边缘的水滴，然后将珠子置于冰上，准备用于移植。
5. 如需要（针对透明珠子），在移植前将 4–5 个珠子转移至 2% 酚红溶液中，以帮助可视化观察。在转移至胚胎前用 PBS 洗涤。

2. 用于接枝的AG 1-X2珠的制备

1. 使用前，用 0.2 N 甲酸对珠子进行衍生化处理。
   1. 使用刮勺将珠子转移至 1.5 ml 微量离心管中，加入 1 ml 0.2 N 甲酸，在摇床上洗涤 1 小时。
   2. 然后用 p1000 移液器吸除甲酸，加入 1 ml 水，洗涤 1 小时，并重复此步骤六次，以去除残留的甲酸。
   3. 用 p1000 移液器吸除剩余液体，将珠子储存在 4 °C。注意：此阶段无需完全去除残留水分。
2. 使用小刮勺从储备液中取出约 5–10 µl 体积的小珠子团块，放入一个 3 cm 培养皿中，并加入 1 ml DMSO（或药物所用的其他溶剂）。注意：此操作应可提供数百颗珠子，以便挑选合适尺寸的珠子。
3. 然后使用设定为 2 µl 的 P2 移液器，将直径约为 100 µm 的珠子转移至另一个 3 cm 培养皿中的 20 µl 溶剂液滴中。
4. 用 20 µl 移液器吸除溶剂，再用 2 µl 移液器吸除任何残留溶剂，随后加入 20 µl 待用药物。
   注意：为保证一致性，建议将药物溶解于 DMSO（或其他所用溶剂）中，浓度为 100 µM，分装为 20 µl 后储存于 -80 °C，因为某些小分子抑制剂不稳定，应避免反复冻融。如有需要，可在浸泡珠子前将药物稀释至所需浓度。每种药物的有效浓度可能需要通过实验确定。
5. 孵育 1 小时。由于这些分子中许多对光敏感，需避光操作。
6. 移植前，使用设定为 2 µl 的 p2 移液器将 4–5 颗珠子转移至 20 µl 含 2% 酚红的水溶液中。此步骤需在体视显微镜下进行，以便观察珠子。用精细钟表镊或金属环取出单个珠子，在转移至胚胎前用 PBS 漂洗。珠子在 2% 酚红溶液中停留不得超过 15 分钟，否则可能导致活性丧失。

3. 准备受钨针

1. 将细钨丝剪成3-4厘米长的小段。取一段钨丝插入玻璃巴斯德吸管末端，并在本生灯上加热熔化以固定位置。最多制备10根针具，以便在使用过程中如有损坏可替换备用。
2. 将金属丝末端放入喷灯火焰中，并保持至钨丝发白光且尖端变尖锐（约2-3分钟）。注意：使用过程中可根据需要将针头在喷灯中清理并重新 sharpen。
   注意：这些针头也可用于制作转移微珠的环状工具。轻轻将针头接触台面，即可弯曲形成环状。

4. 准备受精卵用于珠粒移植

1. 将鸡蛋钝端朝上孵育，直至达到所需发育阶段（大多数肢芽操作为3-5天）。使用钝头镊子轻敲钝端以打破蛋壳，然后用镊子去除蛋壳并暴露胚胎。确保同时去除蛋壳膜。
   注意：若膜粘附于卵黄，可用巴斯德移液管加入1-2 ml PBS辅助操作。将PBS轻轻滴加至卵黄表面，用镊子夹住膜并小心避免损伤卵黄，然后轻轻将其从蛋中拉出。
2. 使用10 ml注射器和19 G针头从蛋中抽出最多5 ml蛋白液。仅抽取所需量，以确保胚胎不会接触到用于封口的胶带；抽取过多液体可能降低胚胎存活率。
3. 为观察胚胎，将5-6滴绘画用印度墨水加入含100 U青霉素和0.1 mg链霉素/ml的15 ml PBS中。使用1 ml注射器和25 G针头将0.5-1 ml该溶液直接注射至胚胎下方。
4. 向蛋内加入2-3 ml含1%胎牛血清及100 U青霉素和0.1 mg链霉素/ml的PBS，以防止胚胎脱水。使用 sharpened 钟表匠镊子去除卵黄膜，并打开发育中肢芽上方的羊膜。确保胚胎不干燥，必要时可补充PBS/FCS。
   注意：肢芽可清晰见为胚胎体侧成对的外突结构。在此阶段，胚胎通常会翻转，使右侧朝上。因此，通常更便于将珠子移植至右侧肢芽，并以左侧作为对侧对照。
5. 使用 sharpened 钨丝在拟植入珠子的部位切开肢芽。应尽量避免完全切透肢芽，但在较早期阶段此操作较为困难。
   注意：在较晚期胚胎（HH 22期及以上）中，可选择肢芽特定区域进行移植；而在较早期阶段，由于肢芽本身较小，操作难度较大。还需注意，肢芽将沿珠子远端方向继续生长，因此尤其在早期阶段，珠子将保留在近端肢体区域。
6. 使用超细钟表匠镊子或由钨针制成的环状工具，从生长因子或药物溶液中拾取珠子。若珠子曾浸泡于DMSO或酚红中，应用PBS冲洗后再施用于胚胎。用镊子或钨丝环将珠子转移至胚胎处，再用 sharpened 钨丝将珠子插入切口内。
7. 向蛋内加入1-2 ml PBS/FCS，确保胚胎保持湿润，但避免直接滴加于胚胎表面，以防损伤胚胎或导致珠子移位。用胶带密封蛋壳后放回培养箱。

结果

在HH 21期，MyoD在发育中的肢体成肌细胞中不表达，但在发育体节的生肌节中可见染色信号图1A). 图1B 显示 原位 FGF18微珠移植后6小时进行MyoD杂交。靠近微珠的成肌细胞中MyoD被诱导表达，而对侧肢体无表达。共移植经U0126（MEK特异性抑制剂）浸泡的微珠可阻断FGF18对MyoD的诱导作用图1C）。同样，在HH 21期将U0126微珠移植至胚胎，并在24小时后检测MyoD表达，与未经处理的对侧肢体相比，MyoD的内源性表达降低图 1D、E).

在HH 19期的肢芽中，FGF18不能诱导MyoD的表达（图1F）。然而，共同移植经FGF18和视黄酸拮抗剂BMS493浸泡的琼脂珠可克服这一限制，并可检测到异位的MyoD表达（图1G）

为了证实 FGF18 通过 MEK 起作用，在植入珠子后 1 ...

讨论

将珠粒移植物直接应用于鸡胚发育组织是一种强大的工具，可用于解析生长因子信号在发育过程中的作用，能够无与伦比地控制其应用的发育阶段以及暴露持续时间。

为每种分子选择合适的珠子至关重要。小分子疏水性物质（例如本文所述的抑制剂和视黄酸）通常与衍生化的 AG 1-X2 珠子结合良好，但需通过实验经验性地验证每种抑制剂在这些珠子上的有效性。同样，对于生长因子，也可能需要测试不同类型的珠子。某些珠子是透明的，因此在操作过程中难以观察，但用酚红短时间处理后，再用 PBS 洗涤，即可使其着色足够长时间，便于完成移植操作。

在制备微珠时，特别是那些已浸泡过抑制剂的微珠，应尽可能避免光照。在初始处理和操作过程中，应将其遮盖，仅在转移微珠时才取出。最好使用 freshly thawed 分装试剂，因为某些试剂不稳定，若储存不当可能导致假阴性结果。此外，在移植前也不应将微珠在酚红中浸泡过久，以免降低微珠的活性。

这些珠粒移植中使用的生长因子和药物浓度通常非常高；FGF18 珠粒浸泡在 0.5 m...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
肝素丙烯酸珠	Sigma	H5263	所用的丙烯酸-肝素珠已停产。但有替代产品可供使用，即肝素琼脂糖珠，货号 H6508。这些珠子是透明的，因此操作难度较大，但可用酚红染色，方法与 AG 1-X2 珠相同。
AG 1-X2 珠	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel 蓝色珠	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	这些珠子已被用于多种生长因子（包括 Shh 和 FGFs），可作为肝素珠的替代品
FGF18	Peprotech	100-28	用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬，分装成每份 0.5–1 µl 的单次使用量，并于 -80°C 保存。不同批次和供应商的产品可能存在差异，因此应测试不同浓度以确定有效剂量。
U0126	Cell Signalling	9903	用 DMSO 配制成 20 mM 储存液，分装成单次使用量，于 -80°C 保存。避光。
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	用 DMSO 重悬，分装成单次使用量，于 -80°C 保存。避光。
黑色印度墨水	Windsor and Newton	5012572003384 (30 ml)	虽然该产品有替代品，但需谨慎选择，因为某些墨水对胚胎具有毒性
钨丝，直径 0.1 mm，纯度 99.95%	Alfa Aesar	10404
青霉素/链霉素	Sigma	P0781	在 PBS/墨水和 PBS/FCS 中稀释 100 倍