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光遗传功能磁共振成像

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DOI：

10.3791/53346

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2016年4月19日

 ,  ,  , 
1Neurology and Neurological Sciences, Stanford University, 2Electrical Engineering, Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

本文内容

摘要

本方案描述了成功实施光遗传功能磁共振成像（ofMRI）所需的步骤及数据分析方法。ofMRI 是一种新型技术，结合了高场强 fMRI 信号读取与光遗传学刺激，能够在整个活体大脑中实现特定细胞类型的神经功能环路及其动态变化的映射。

摘要

通过全脑完整状态下精确神经环路功能连接的研究，可借助光遗传功能磁共振成像（ofMRI）实现。ofMRI 是一种新兴技术，结合了高场强 fMRI 相对较高的空间分辨率与光遗传刺激的精确性。通过植入光纤，可在活体（in vivo）条件下将特定波长的光传递至脑深部目标区域，从而特异性激活已通过基因手段诱导表达光敏跨膜离子通道（称为视蛋白）的细胞类型。fMRI 提供了一种非侵入性方法，通过检测血氧水平依赖（BOLD）信号来反映大脑对特定神经环路光遗传刺激所产生的全局动态响应，而 BOLD 信号可间接反映神经元活动。本实验方案详细描述了光纤植入体的制备、植入手术操作、光刺激下的成像过程以及 ofMRI 成功实施所需的数据分析步骤。总之，ofMRI 所具备的精确刺激与全脑监测能力，使其成为研究健康与疾病状态下脑连接组学的强有力工具。

引言

光遗传功能磁共振成像（ofMRI）是一种新兴技术，它结合了高场强fMRI的空间分辨率与光遗传刺激的精确性1-11,38，能够实现全脑范围内特定细胞类型的功能神经环路及其动态过程的映射。光遗传学通过引入对光敏感的跨膜电导通道（称为视蛋白），可靶向特定类型的细胞进行刺激。神经环路中的特定组分可通过基因改造表达这些通道，从而在完整大脑中实现毫秒时间尺度上的活动调控1-15。fMRI提供了一种无创方法，通过检测血氧水平依赖（BOLD）信号16-18来确定大脑对特定神经环路光遗传刺激所产生的全局动态响应，该信号间接反映了神经元活动。

这两种技术的结合被称为光遗传功能磁共振成像（ofMRI），相较于电生理学等其他在刺激期间记录脑活动的方法具有优势，因为它能够以相对较高的空间分辨率提供全脑的活动图像。这使得研究人员能够在远离刺激位点的脑区检测神经元活动，而无需植入侵入性记录电极1-11。与在fMRI期间进行电刺激的传统方法相比，ofMRI也具有优势，因为电刺激会招募电极附近的多种细胞类型，从而混淆不同细胞群体的因果效应19。此外，用于电刺激的电极及其产生的电流可能在MR成像过程中引发伪影20。事实上，ofMRI结合先进的遗传靶向技术（如转基因动物中的Cre-Lox系统或启动子的应用），能够观察特定调控多种不同类型细胞对全脑活动的影响。通过使用NpHR抑制和ChR2激活特定细胞类型，ofMRI实现了光学操控与全脑监测的结合。可用于ofMRI的光遗传工具箱也在不断进步，例如引入了光敏感性更高或动力学性能更优的视蛋白、稳定阶跃函数视蛋白（SSFOs），以及红移视蛋白，后者可能消除对植入式光纤的需求，从而实现在成像过程中的非侵入性刺激21。这些能力是电刺激所不具备的。

然而，已有研究报道，由于向脑组织传递光所导致的组织加热会产生信号伪影22，其中温度变化引起的弛豫时间改变可产生假性激活信号。因此，进行ofMRI研究的研究人员应意识到这一潜在的混杂因素。通过合理的实验设计和对照措施，该问题可以得到解决。此外，fMRI在测量血流动力学反应时相对较低的时间分辨率，可能成为该技术在某些应用中的限制因素。

本方案首先描述了光纤植入装置的构建方法，该装置可将特定波长的光递送至脑深部区域 体内随后，该方案描述了通过立体定向手术将编码视蛋白的病毒载体递送至特定脑区的操作。接下来，方案介绍了在同步光刺激期间进行全脑功能磁共振成像的过程。最后，方案概述了对所获取数据的基本分析方法。

需要注意的是，此处描述的光遗传学技术需要通过慢性植入物进行光传递。然而，光纤植入物具有良好的稳定性与生物相容性，可在数月时间内实现对神经环路的纵向成像与研究23,24。

总之，ofMRI 的精确定刺激和全脑监测能力是使其成为研究脑连接组学强大工具的关键因素。此外，当结合不同的动物模型时，ofMRI 还可为神经系统疾病的机制提供新的见解25。事实上，ofMRI 已被用于阐明与癫痫发作相关的不同海马亚区的网络活动8。因此，致力于回答系统层面神经科学问题的实验室将发现该技术具有重要意义。

方案

伦理声明：本实验方案已获得斯坦福大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 准备补丁线缆和套管植入物

注意：尽管补丁线和套管植入物可从商业途径获得，但自行制备可实现特殊设计并降低成本。

  1. 为准备将激光光源的光传递至脑内植入物的光纤连接线，首先将光纤切割至所需长度。
    1. 使用光纤切割器对光纤进行端面处理，使其在端接点处形成平整的端面。如果光纤表面包有护套，请先使用光纤剥线工具去除护套。
    2. 将光纤的另一端切割至连接线所需的长度，确保该长度足以从光源延伸至扫描仪孔洞内的动物体内。
  2. 在下一步操作前，立即在一小片铝箔上按1:1比例混合少量环氧胶，因为环氧胶在混合5分钟后会变得过于黏稠而无法使用 。
  3. 使用一根细小的木棒，轻轻地将环氧胶涂抹在即将插入陶瓷插芯凹面部分的光纤段上，然后在插芯平面一侧的表面滴加少量环氧胶。将光纤插入插芯后，确保有小段光纤（<0.5 mm）从陶瓷插芯的平面端微微突出。为获得最佳效果，让环氧胶过夜固化 。
  4. 在光纤连接线将连接激光光源的一端，使用细小木棒将环氧胶轻轻涂抹在即将插入FC/PC连接器插芯凹面部分的光纤段上，然后在插芯平面一侧的表面滴加少量环氧胶。将光纤插入插芯后，确保有小段光纤（<0.5 mm）从插芯平面端微微突出。让环氧胶过夜固化以获得最佳效果。
  5. 使用抛光盘对连接线两端的插芯平面端进行抛光：用镊子夹住插芯，在氧化铝研磨片上以“8”字形轨迹轻轻施加向下的压力进行抛光（研磨粒径依次为3 µm、1 µm、0.3 µm）。
  6. 在100倍显微镜下检查插芯的平面端。确保平面端表面（包括光纤本身）无任何残留环氧胶；若仍有环氧胶残留，需继续抛光。同时确认光纤表面无断裂或崩边。
    警告：操作激光设备前，务必确保相关人员已接受适当的激光安全培训，并佩戴激光防护眼镜。
  7. 通过FC/PC连接器将光纤连接线与激光光源连接，并将光纤端面对准耦合器的焦点。使用功率计测量光纤的光传输功率，以确保输出光强充足。
    注：以下步骤用于制备可长期植入脑内的陶瓷插芯光纤；陶瓷插芯中心为空心结构，可容纳光纤，将来自连接线的光传递至脑内目标区域（ROI）。
  8. 使用光纤切割器对光纤进行端面处理，使其在端接点处形成平整的端面。如果光纤表面包有护套，请先使用光纤剥线工具去除护套。
  9. 切割光纤的另一端，使其达到适合脑内植入的长度。根据立体定位图谱确定光纤长度，以准确靶向脑内目标区域。
    1. 例如：若需靶向大鼠背侧海马（位于前囟下方3.5 mm处），则应确保从插芯端面伸出的光纤长度为3.5 mm + 0.25 mm（计入颅骨厚度并预留误差余量）。因此，最终光纤总长度应为3.5 mm + 0.25 mm + 10.5 mm（插芯长度）= 14.25 mm。
  10. 在下一步操作前，立即在一小片铝箔上按1:1比例混合少量环氧胶（环氧胶在混合5分钟后 会变得过于黏稠而无法使用）。
  11. 使用一根细小的木棒，轻轻地将环氧胶涂抹在即将插入陶瓷插芯凹面部分的光纤段上，然后在插芯平面一侧的表面滴加少量环氧胶。将光纤插入插芯后，确保有小段光纤（<0.5 mm）从陶瓷插芯的平面端微微突出。让环氧胶过夜固化以获得最佳效果。
  12. 使用抛光盘对插芯的平面端进行抛光：用镊子夹住插芯，在氧化铝研磨片上以“8”字形轨迹轻轻施加向下的压力进行抛光（研磨粒径依次为3 µm、1 µm、0.3 µm）。
  13. 在100倍显微镜下检查插芯的平面端。确保平面端表面（包括光纤本身）无任何残留环氧胶；若仍有环氧胶残留，需继续抛光。同时确认光纤表面无断裂或崩边。
  14. 使用插芯套筒将抛光后的插芯与光纤连接线连接，并将连接线接入激光光源。使用功率计测量光纤尖端的光传输功率，以确保传输效率充足。
  15. 记录每根植入用插芯为在光纤尖端输出目标光功率（本方案中为2.5 mW）所需连接线端的输出功率。丢弃衰减率超过50%或输出光斑非圆形的插芯。

2. 立体定位移植手术与病毒注射

  1. 确保涉及动物使用的任何实验操作均已获得当地动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。在进行可存活手术期间，应遵循无菌操作规程，包括使用无菌手套、无菌口罩、无菌手术单和灭菌的手术器械，以维持无菌条件。
    警告：在开始操作前，确保手术人员佩戴适当的个人防护装备（PPE），包括护目镜。处理腺相关病毒载体（AAV）时应遵循标准生物安全程序，注意避免溅洒。AAV废弃物应丢弃于生物危害容器中。
  2. 用微量注射器吸取足量AAV用于动物注射，并额外多取以补偿可能的体积损失（每只动物共4 µl ），使用前将注射器置于冰上。本方案中使用的病毒为AAV5-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP，滴度为4×1012 vg/ml。将动物置于异氟烷麻醉诱导舱中，连接至精密异氟烷挥发罐，氧气气源下设定浓度为3–4%。
  3. 使用电动剃刀剃除头部毛发，并用聚维酮碘进行三次外科擦洗，再以70%乙醇冲洗皮肤。
  4. 待动物进入深度麻醉状态（检查脚趾反射和呼吸频率）后，使用耳杆和门齿固定杆将动物头骨固定于立体定位仪中。
    注：从麻醉诱导到恢复，整个操作过程将持续1–2小时。
  5. 将麻醉水平调节至适当范围（挥发罐设定为1 –3%异氟烷），持续监测动物生命体征，并根据需要调整麻醉深度，以维持约每分钟40次的呼吸频率。在动物眼睛上涂抹眼用软膏，防止麻醉期间角膜干燥。
  6. 使用手术刀沿中线做15–20 mm长的头皮切口，用止血钳夹住骨膜并牵拉固定头皮。以λ点和前囟为参考，将钻头准确定位于目标脑区（ROI）坐标上方。
  7. 使用牙科钻在目标脑区（ROI）上方钻出一个小颅骨开窗（2–3 mm），注意避免刺破脑组织。将连接微量注射器的针头缓慢穿过颅骨开窗，插入脑内目标区域。
  8. 使用微量注射泵控制器，以150 nl/min的流速向目标脑区（ROI）注射2 µl 病毒溶液，以避免组织损伤。注射完成后，等待10 min 后再以0.5 mm/min的速度缓慢拔出注射针。
  9. 注射完成后，擦干颅骨表面。再次以前囟和λ点为参考确认坐标，然后以约0.5 mm/min的速度将套管植入物插入至目标深度（例如：背侧海马为前囟下方3.5 mm）。使用牙科水泥将套管植入物固定于颅骨上。待牙科水泥完全固化后，围绕水泥帽使用缝线（大鼠使用5-0号线）缝合切口。
  10. 术后将动物单独饲养于笼中，并将笼子一半置于加热垫上以促进麻醉恢复。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。在动物完全恢复前，不得将其与其他动物同笼饲养。
  11. 术后镇痛管理：以0.05 mg/kg剂量皮下注射布托啡诺，每12 hr 一次，持续24小时。在切口部位每日涂抹抗生素粉末，连续3天。
  12. 术后约两周拆除缝线，以防止结痂形成。
  13. 病毒注射后需等待4–6周，以确保光遗传学基因充分表达，方可进行后续实验。

3. 光遗传功能磁共振成像

警告：在 MRI 扫描仪的恒定磁场周围需谨慎操作。应将设备（包括函数发生器、光源、呼吸机、二氧化碳监测仪和气体罐）固定在足够远的位置（至少超出 5 高斯线范围）。

  1. 将动物置于连接精密异氟烷蒸发器的气体麻醉诱导室中，蒸发器设置为5%异氟烷，并连接氧气气源。
  2. 当动物进入深度麻醉状态后（通过检查足趾反射和呼吸频率确认），按照Rivard et al. (2006) 中详述的方案进行气管插管，以便通过微流测定法监测二氧化碳26。注意：在成像过程中，气管插管对于维持适当的呼气末CO2水平至关重要。
  3. 将动物固定在扫描仪托架中。
    注意：本方案中使用的托架为定制产品，但此类托架也可商业购得。大鼠托架的作用是在扫描过程中固定动物，同时提供麻醉气体、加热空气并限制动物运动。
  4. 通过托架中的导管输送异氟烷（浓度范围为1.2 - 1.5%）与约60%一氧化二氮和40%氧气的混合气体。确保动物头部牢固固定，以避免运动伪影。
  5. 通过托架中的导管提供加热空气，并插入润滑过的直肠温度计以监测体温。在动物眼睛上涂抹眼用软膏，防止麻醉期间角膜干燥。
  6. 将光纤跳线连接至激光光源，并使用功率计测量跳线陶瓷插芯末端的输出功率。
  7. 调节至适当功率水平（此前在步骤1.15中已确定），使植入脑内的光纤末端达到所需输出功率（本方案中为2.5 mW）。由于光纤输出功率过高可能引起脑组织损伤或组织加热，从而导致信号伪影，因此切勿显著提高激光输出功率超过预定值。
  8. 使用黑色电工胶带制成的锥形罩防止植入部位漏光，并遮盖动物眼睛。 使用陶瓷套筒将光纤跳线与动物头部的陶瓷插芯植入物连接。 
  9. 将线圈放置于动物头部上方。将带有动物的托架插入扫描仪孔内。
    注意：本方案中使用的单环发射-接收线圈为定制产品，且已预先调谐，以从脑组织接收最佳射频信号。
  10. 在整个过程中持续监测呼吸频率和体温，必要时调节人工呼吸机和加热装置，使生理参数保持在正常范围内（通过调节呼吸机旋钮控制呼吸频率和潮气量，确保呼气末CO2维持在3 - 4%；通过点击温度设定按钮，使体温维持在37 °C）。
  11. 选择定位序列以确定动物头部位置。若脑部未处于等中心位置，则调整头部位置并重复定位扫描，直至脑部位于等中心。选择线性匀场序列，在序列选择窗口中点击“加载”。随后点击“开始”以减少磁场的不均匀性。
    注意：匀场是直接影响fMRI数据质量的关键步骤。
  12. 选择T2加权序列，并在序列选择窗口中点击“加载”。随后点击“开始”，在fMRI扫描前获取高分辨率冠状面T2加权解剖图像，以评估脑组织整体完整性，并确认光纤植入位置。
    注意：这些图像可作为ofMRI扫描序列的解剖叠加图。
  13. 将MRI扫描仪触发端口的BNC电缆连接至函数发生器，使激光光源按照实验刺激范式工作。
    注意：本方案中采用的刺激范式为30秒 基线期，随后进行20秒 开启/40秒 关闭，持续六分钟。
  14. 选择多层梯度回波（GRE）序列，并在序列选择窗口中点击“加载”。随后点击“开始”，获取平面内冠状面图像，视野（2D FOV）为35 mm × 35 mm，空间分辨率为0.5 mm × 0.5 mm × 0.5 mm。
    注意：此处使用的GRE序列参数为重复时间（TR）和回波时间（TE），即TR/TE = 750/12毫秒，翻转角为30°。
  15. 扫描结束后，将动物从扫描仪中取出，并持续监测直至其从麻醉中苏醒，能够维持胸卧位。

4. ofMRI 数据分析

注意：以下步骤在 MATLAB 中进行，具体方法如关于高通量 ofMRI 的一篇出版物所述27。

  1. 将原始扫描数据传输至用于分析的计算机后，使用滑动窗重建方法，以四间隔螺旋读出、750毫秒重复时间（TR）和12毫秒回波时间（TE），在每次扫描序列中获取23个切片，并在每个TR时间点更新图像。与传统重建方法（仅在每个切片的所有间隔采集完成后才重建新的fMRI图像）不同，滑动窗重建方法在每次间隔采集完成后即进行图像重建27。
  2. 对原始数据进行二维网格化重建、运动校正以及时间序列计算，具体步骤如先前所述27。
  3. 采用阈值相干性方法，通过计算每个体素的BOLD信号相对于刺激前基线期的调制百分比，确定被激活的体素，方法如先前所述27。相干性值的计算方式为：在重复刺激周期频率处的傅里叶变换幅值，除以所有频率成分的平方和8。
  4. 基于每个体素的时间序列数据，首先对属于同一刺激范式的连续扫描中经运动校正的图像进行平均。然后，使用六自由度刚体变换结合各向同性缩放，将平均后的4D图像配准至统一的坐标系，以便在个体间及个体内进行比较，具体方法如先前所述27。

结果

图1 和 图2 展示了对运动皮层进行光遗传学刺激（20 Hz，脉冲宽度15毫秒，473 nm，占空比30%）后获得的代表性数据。实验采用的刺激范式为：30秒基线期，随后进行6分钟的“开启20秒/关闭40秒”循环。既往研究表明，该范式可由光遗传学刺激引发显著的BOLD信号1,8。图1 显示，在刺激局部位点（运动皮层）以及丘脑均检测到激活的体素，这是由于这两个脑区之间存在长距离突触连接所致。图2 表明，可通过血流动力学响应函数（HRF）获取时间信息，因为在光遗传学刺激后，丘脑的响应相较于运动皮层出现延迟（初始斜率较低）。

脑相干性分析、fMRI 数据、多帧成像、神经元活动可视化、实验结果。
图 1. 光遗传学刺激运动皮层中表达 CaMKIIa 的细胞所诱导的 BOLD 信号激活图谱。 活跃体素的相干值（定义为与重复刺激显著同步的体素）叠加显示在一幅 T2 加权冠状面解剖图像上。数据采集时长为 6 分 30 秒（初始 30 秒为基线期，随后进行六轮刺激，每轮刺激持续 20 秒，间隔 40 秒，使用波长 473 nm、频率 20 Hz、脉宽 15 msec 的光刺激），最终整合为一幅激活图谱。连续切片间距为 0.5 mm，光纤植入位置由三角形标示。请点击此处查看该图的放大版本。

显示运动皮层和丘脑中BOLD信号随时间变化的ofMRI信号图，以及血流动力学响应函数（HRF）。
图 2. 血流动力学响应函数（Hemodynamic Response Function）。（左）在对运动皮层进行光遗传学刺激期间（六轮刺激，每轮20秒开启/40秒关闭，使用473 nm光，20 Hz，15毫秒脉冲宽度），运动皮层和丘脑中激活体素的BOLD信号相对于基线的百分比调制程度。灰色阴影误差条表示感兴趣区域（ROI）内激活体素之间的标准误差。（右）血流动力学响应函数（HRF）展示了时间平均后的响应情况。丘脑的HRF相对于受刺激的运动皮层表现出延迟响应。蓝色条形表示473 nm光刺激的时段。灰色阴影误差条表示六轮刺激周期间的标准误差。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

成像过程中受试对象的运动是导致伪影的重要来源，可能引起数据失真。通过将动物适当地固定在成像托架上，并维持适当的麻醉水平，可最大限度地减少此类伪影。本研究中使用异氟烷作为麻醉剂，但也可考虑其他替代麻醉剂，如美托咪定，或氯胺酮联合赛拉嗪。 然而，麻醉剂的种类和剂量会影响大脑中的多种参数，包括血氧水平依赖（BOLD）反应28。异氟烷可改变神经元兴奋性29，而其他麻醉剂也可能影响GABA突触抑制30。因此，在进行功能性光学成像（ofMRI）时，由于麻醉剂可能影响神经元活动，麻醉方案的选择至关重要。在无麻醉条件下进行ofMRI是可行的，但动物运动增加会带来挑战；若对动物进行适应性训练，则可减轻运动干扰。此前已有相关清醒状态下的ofMRI研究报道，此类方法可避免麻醉对大脑功能的混杂效应9,10。此外，可采用图像后处理中的运动校正算法显著减轻运动带来的影响。目前已有多种此类方法，包括本实验方案中采用的逆高斯-牛顿算法，该算法通过最小化参考图像与待校正图像之间的平方和代价函数实现校正。该算法具有快速且稳健的优点，并利用GPU并行计算平台设计显著缩短处理时间27。

本方案中，数据重建采用在 MATLAB 环境下编写的自定义软件进行二维栅格化重建，将螺旋采样数据在 k 空间中重建为栅格化图像31-33。时间序列数据通过计算每个体素的 BOLD 信号相对于刺激前基线期的百分比调制程度而生成。若体素的时间序列与光遗传学刺激区块的相干值达到或超过 0.35，则定义为激活体素；该相干值对应的 P 值小于 10-98。相干值的计算方法为：在重复刺激周期频率处的傅里叶变换幅度，除以所有频率成分平方和的总和8,27。可采用 Bonferroni 校正法对多重比较进行族系误差（familywise error）控制。也可使用其他分析方法，包括参数统计检验，如一般线性模型（GLMs）。与传统的一般线性模型相比，相干性方法对血流动力学响应函数（HRF）的先验知识要求较低，因此在利用 ofMRI 探索性分析数据时具有优势。然而，该方法仅适用于采用区块设计或具有固定刺激间间隔的特定事件相关设计的数据，不能用于其他类型事件相关设计或混合设计的 ofMRI 数据。随后，可采用动态因果建模（DCM）分析通过 ofMRI 鉴定出的脑区间相互作用。DCM 是一种贝叶斯统计技术，专为分析 fMRI 实验中系统对实验输入的功能连接而开发34。

关于ofMRI的其他技术问题在此讨论。植入物可能受损或脱落，导致受累动物被排除出研究。由于重新植入手术难以确保与初次手术相同的靶向目标区域（ROI），且涉及动物福利问题，因此不建议进行再次植入手术。鉴于每只实验动物所投入的时间和资源均十分可观，在ofMRI研究中选择合适的牙科水泥时，材料的强度是一个重要考量因素。植入手术是决定植入物及实验动物使用寿命的关键因素。例如，在涂抹牙科水泥前确保颅骨干燥，并在陶瓷套管植入物周围施加足量的水泥，有助于在整个研究期间（可能持续数月）维持植入物的稳定性。此外，可与本地动物护理机构探讨并采用替代性的笼具设计，避免使用带有金属网盖的笼子，因为其食物和水瓶支架常伸入笼内，为动物损坏植入物提供机会。重要的是，必须谨慎选择牙科水泥以减少对成像造成干扰的伪影；在用于动物实验前，可通过将不同替代性水泥涂抹于模体上并在扫描仪中成像的方式进行预测试。通过多种牙科水泥的试用发现，本方案所采用的水泥产生的伪影相对较少。进行ofMRI的另一项技术挑战在于光纤放置到目标ROI的准确性，尤其是当脑内核团之间的距离极小时35。完成植入手术后，可通过T2加权解剖扫描图像叠加至脑图谱来确认放置位置是否正确。手术者的操作技能以及反复练习此类手术可提高准确放置的成功率。在研究结束时，可通过灌注动物并固定脑组织，利用免疫组织化学方法或标记在视蛋白上的报告蛋白的内源性荧光来验证视蛋白在目标ROI的特异性及其表达情况。这些报告蛋白还可与其他蛋白共定位，以确认视蛋白是否在目标神经细胞类型中表达1,8,15,25。如前所述，在ofMRI过程中，光传递可能导致组织加热，从而产生伪影22。组织加热会改变弛豫时间，导致出现假性的BOLD信号。为确保ofMRI中光刺激引起的激活信号并非由此类伪影所致，应设置无视蛋白表达的对照组，即对注射生理盐水的动物或注射对照荧光载体（如AAV-CaMKIIa-EYFP）的动物进行ofMRI。此外，应仅使用结构良好且光传输效率高的光纤植入物，以避免需要使用高激光功率。已有ofMRI研究显示，在适当条件下，由组织加热引起的假性激活并不构成问题1,6-8,10,11。

关于将所需光遗传学基因导入神经元进行表达的载体选择，腺相关病毒（AAV）在人类中未见致病报道，因此是一种便捷的选择，因其使用所需的生物安全等级较低（BSL-1）。此外，许多载体核心机构均储备有携带多种光遗传学基因、不同血清型的AAV。必须根据目标细胞群体选择适当的AAV血清型，以确保最佳的表达水平36,37。慢病毒也可使用，但需要更高的生物安全等级。光遗传学基因达到足够表达所需的时间因所使用的特定动物模型、具体AAV类型以及实验范式而异。在本方案中，使用11周龄的Sprague Dawley大鼠，光遗传学实验在病毒注射后4至6周开始。转基因小鼠也可用于光遗传学研究。有必要通过预实验确定视蛋白充分表达所需的具体时间。刺激范式可根据所使用的特定视蛋白而变化。在本方案中，使用AAV5-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP，刺激范式为20秒 开启/40秒 关闭。若使用SSFO，则刺激范式会有所不同，因为SSFO仅需短暂的光脉冲激活，再通过另一波长的短暂光脉冲即可终止其活性。

进行ofMRI实验时，另一个关键问题是防止在光遗传学刺激期间，光纤接头与光纤跳线接口处漏光，从而避免因视觉刺激引发混淆性的脑信号，即使动物处于麻醉状态也需注意。可使用黑色电工胶带制成的锥形罩来遮挡接头处的光线，并覆盖动物的眼睛。重要的是，在整个成像过程中，必须妥善维持受试动物的生理指标，包括呼气末二氧化碳（expiratory CO2）和体温。呼气末CO2应维持在3%–4%之间，体温保持在37 °C。此外，在开始ofMRI扫描前，需执行匀场（shimming）序列以最大程度减少磁场的不均匀性，这对最终获得的BOLD数据质量具有决定性影响。对这些因素的有效控制是获得可靠ofMRI数据的关键。在本实验方案中，采用半导体泵浦固体激光器（DPSS激光器）作为光遗传学刺激的光源。由于激光具有相干性，可通过光纤轻松提供充足光功率。市面上也有与光纤耦合的LED光源可供选择，但其缺点是光传输功率较低。激光光源需要针对每根特定的光纤跳线进行对准，但经过练习后，通常可在数秒至数分钟内完成对准。

ofMRI 的未来应用包括使用新一代视蛋白（如红移视蛋白），以实现在成像过程中进行非侵入性刺激。此外，在植入光纤的同时植入与 MRI 兼容的脑电图（EEG）或类似的记录电极，可同时获得高时间分辨率的数据和 MRI 提供的高空间分辨率数据。结合电生理记录的 ofMRI 可为脑功能连接性提供广泛的信息。总之，ofMRI 能够监测全脑对特定细胞群（基于基因或解剖学特征定义）刺激所产生的反应，使其成为研究神经系统疾病以及健康大脑连接组学的关键工具。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院/国立生物医学影像与生物工程研究所R00奖（4R00EB008738）、Okawa基金会研究资助奖、NIH主任新创新者奖（1DP2OD007265）、美国国家科学基金会CAREER奖（1056008）以及阿尔弗雷德·P·斯隆基金会研究奖学金的支持。J.H.L. 感谢Karl Deisseroth提供用于光遗传学实验的DNA质粒。作者们还要感谢Andrew Weitz和Mankin Choy对稿件的编辑，以及所有Lee实验室成员在ofMRI实验中提供的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
7 特斯拉扫描仪Agilent TechnologiesDiscovery MR901 System
斯普拉格-道利大鼠Charles RiverCrl:SD11 周龄
光纤切割刀FujikuraCT-05
多模光纤Thor LabsAFS105/125Y
光纤剥线钳  Thor LabsT08S13
陶瓷分体套管Precision Fiber ProductsSM-CS1140S
环氧树脂胶Thor LabsG14250
棉签Stoelting Co.50975
多模陶瓷氧化锆套管Precision Fiber ProductsMM-FER2002
FC/PC 多模连接器Thor Labs30128C3
光纤抛光盘Precision Fiber ProductsM1-80754
氧化铝研磨片，0.3 µmThor LabsLFG03P
氧化铝研磨片，1 µmThor LabsLFG1P
氧化铝研磨片，3 µmThor LabsLFG3P
双目生物显微镜 40X–1,000XAmscopeB100
激光防护眼镜KentekKXL-62W01
473 nm DPSS 激光器LaserglowLRS-0473
594 nm DPSS 激光器LaserglowLRS-0594
内六角扳手套装2.0 mm（5/64"），用于将光纤尖端与激光耦合器的焦点对齐
功率计，硅传感器，400–1,100 nmThor LabsPM121D
异氟烷（Isothesia）Henry Schein 50033
带诱导室的异氟烷蒸发器VetEquip901806
NanoFil 100 µl 注射器World Precision InstrumentsNANOFIL-100
带 SYS-Micro4 控制器的 UltraMicroPumpWorld Precision InstrumentsUMP3-1
函数发生器A.M.P.I. Master-8
小型动物立体定位仪David Kopf InstrumentsModel 940 
Model 683 小型动物呼吸机 Harvard Apparatus550000
Type 340 二氧化碳监测仪 Harvard Apparatus733809
牙科钻（旋转式微型电机套件）Foredom Electric Co.K.1070
眼科软膏（人工泪液）Rugby00536-6550-91
器械灭菌器CellPoint ScientificGerminator 500玻璃珠灭菌器
抗生素粉末PfizerNEO-PREDEF硫酸新霉素、醋酸异氟泼尼定和盐酸四卡因
布托啡诺镇痛药HospiraNDC:0409-2012三级管制药品，储备液浓度 0.3 mg/ml

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