通过流式细胞术测定甲型流感病毒在A549细胞中的吸附与内化

摘要

我们介绍一种实验方案，描述了通过流式细胞术半定量检测甲型流感病毒与A549细胞的结合以及病毒颗粒向靶细胞内吞作用的方法。

摘要

流感病毒A型（IAV）生命周期的最初步骤是病毒与靶细胞的结合以及随后的内化过程。本文提供了一种详细方案，用于检测病毒颗粒与人肺上皮细胞系A549细胞结合量的相对变化，以及进入细胞内部的病毒颗粒数量的变化。我们使用生物素标记的病毒，通过Cy3标记的链霉亲和素（STV-Cy3）染色后可方便地进行检测。文中描述了广泛使用的IAV实验室毒株A/WSN/33的增殖、纯化及生物素标记过程。将低温条件下结合在A549细胞表面的生物素化IAV颗粒用STV-Cy3染色，并通过流式细胞术进行定量分析。为研究病毒颗粒的摄取情况，将低温结合的病毒在37 °C条件下孵育，使其发生内化。为了区分细胞表面结合的病毒与已内化的病毒，实验中设置了封闭步骤：利用未标记的链霉亲和素（STV）封闭细胞表面已结合病毒上暴露的生物素结合位点。随后对细胞进行透化处理并用STV-Cy3染色，从而特异性检测细胞内的病毒颗粒。我们提供了一种计算方法，用于确定内化病毒的相对量。该检测方法适用于评估药物处理或其他干预措施对IAV结合或内化过程的影响。

引言

甲型流感病毒（IAV）的入侵是一个多步骤过程，起始于病毒与靶细胞质膜上受体的结合¹。IAV的受体是唾液酸，其广泛存在于多种糖蛋白和糖脂上。IAV包膜中的血凝素（HA）蛋白可与唾液酸结合，从而介导病毒颗粒与靶细胞质膜的附着²。病毒主要通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞，但也有研究报道了其他入侵途径，例如巨胞饮作用^3-6。HA与唾液酸之间的相互作用似乎足以同时介导病毒颗粒的附着和内化启动⁷。然而，目前已有研究提出可能存在其他替代性入侵受体，其在IAV入侵过程中的作用正在被进一步研究^1,8,9。

目前，研究人员正致力于鉴定参与病毒生命周期的宿主因子，旨在开发亟需的新型抗病毒疗法^10-12。病毒进入是抑制甲型流感病毒（IAV）增殖的一个理想靶点，可在感染最早期阶段阻断病毒入侵。实验上检测IAV进入的不同阶段具有挑战性，通常需要大量病毒才能检测到进入细胞的病毒。此外，由于缺乏病毒复制，病毒进入变化的检测范围仅呈线性。这凸显了对高灵敏度检测方法的需求。

本文所介绍的检测方法可用于检测与细胞结合的病毒总量中，附着于细胞表面的病毒以及被细胞内吞的病毒。利用生物素标记的野生型病毒，通过STV-Cy3染色并结合流式细胞术检测，可实现便捷的定量分析。将生物素标记的病毒在低温条件下与细胞结合，可使病毒颗粒附着于细胞....

方案

开始前注意事项：操作活病毒时，须使用层流罩及适当的生物安全防护措施。本文所述为适合培养流感病毒株 A/WSN/33 的生长条件。感染复数（MOI）及孵育时间可能因所用病毒株的不同而有所变化。

1. 生物素化A/WSN/33病毒的制备

1. 使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Pen/Strep）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），将Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞接种至T175 cm²培养瓶中。在37 °C下培养细胞，直至细胞融合度达到约70%。
2. 感染前，吸除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0–7.3）洗涤细胞，加入足够体积的PBS以完全覆盖细胞单层。
3. 吸除PBS，用MOI为10^-4的A/WSN/33病毒感染细胞。将病毒稀释于含有0.02 mg Mg²⁺、0.01 mg Ca²⁺、0.3%牛血清白蛋白（BSA）和1% Pen/Strep的PBS（感染用PBS）中。T175 cm²培养瓶使用4 ml接种液。
4. 在37 °C下孵育1小时，吸除接种液，用移液器加入10 ml添加0.3% BSA、20 mM HEPES和1% Pen/Strep的DMEM至培养瓶中。
5. 在37 °C下继续孵育约3天，直至出现明显的细胞病变效应（CPE），然后....

结果

描述四种不同实验条件的示意图见图1。代表性实验结果见图2–图5。在“0分钟”样本中，生物素标记的病毒在低温下结合至靶细胞，可通过STV-Cy3染色观察到（图1和图2）。当进行阻断步骤（即“0分钟+STV”样本）时，细胞表面的病毒不再能被STV-Cy3染色检测到。因此，“0分钟+STV”样本中的信号强度相较于“0分钟”样本显著降低（图1和图2）。当温度升至37 °C后，附着的病毒被细胞摄取（“30分钟”样本）。内化的病毒对未标记STV的阻断不敏感，因此与未进行STV阻断的“30分钟”样本相比，“30分钟+STV”样本中的信号强度下降幅度较小（图1和图2）。

对照组包括模拟感染、NA 处理和 SA 处理。 图3 显示第4节所述所有实验条件下Cy3阳性细.......

讨论

本方案描述了一种通过流式细胞术简便检测病毒吸附与内化的实验方法。该方法可使用标记的野生型病毒，相较于病毒样颗粒（VLP），更接近真实的病毒感染过程。尽管本方案已针对甲型流感病毒（IAV）的吸附与内化检测进行了优化，但亦可轻松适用于其他病毒。此外，由于采用流式细胞术进行检测，可在实验中便捷地加入共染步骤。 例如 用于在敲低或过表达目标蛋白后检测其表达水平。因此，该实验可根据具体需求对方案进行相应修改。值得注意的是，本实验还可设置一系列时间点，以测量病毒随时间推移的内化过程，从而获得动力学信息。若将该实验方法应用于内化动力学未知的其他病毒，获取此类动力学数据可能尤为重要。

然而需要注意的是，由于缺乏病毒复制，黏附或内化差异以线性尺度发生，因此检测的时间窗口相对较小。为了提高结果的可信度并降低背景噪声，我们建议设置对照组（例如 上述对照）并进行多次重复实验。尽管图中展示的是一个代表性实验结果，但我们观察到不同实验之间具有良好的一致性：例如，在病毒黏附实验中，Cy3阳性细胞的比例在60–80%之间；在病毒内化实验中，该比例介于40–60%之间。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Life Technologies	41966-052
FBS	Life Technologies	10270-106
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-蔗糖	Fluka	84100
TRIS	Biosolve BV	20092391
EDTA	Sigma-Aldrich	3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN 试剂盒	Fisher Scientific	W9971E
Bio Rad 蛋白定量测定试剂盒	Bio Rad	500-0006
深孔管（1.2 ml 微量管）	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem  Electron microscopy sciences	15710
超速离心管	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
叠氮化钠	Fluka	71290
细菌神经氨酸酶/唾液酸酶	Sigma-Aldrich	N6514-1UN