通过流式细胞术测定甲型流感病毒在A549细胞中的吸附与内化

摘要

我们介绍一种实验方案，描述了通过流式细胞术半定量检测甲型流感病毒与A549细胞的结合以及病毒颗粒向靶细胞内吞作用的方法。

摘要

流感病毒A型（IAV）生命周期的最初步骤是病毒与靶细胞的结合以及随后的内化过程。本文提供了一种详细方案，用于检测病毒颗粒与人肺上皮细胞系A549细胞结合量的相对变化，以及进入细胞内部的病毒颗粒数量的变化。我们使用生物素标记的病毒，通过Cy3标记的链霉亲和素（STV-Cy3）染色后可方便地进行检测。文中描述了广泛使用的IAV实验室毒株A/WSN/33的增殖、纯化及生物素标记过程。将低温条件下结合在A549细胞表面的生物素化IAV颗粒用STV-Cy3染色，并通过流式细胞术进行定量分析。为研究病毒颗粒的摄取情况，将低温结合的病毒在37 °C条件下孵育，使其发生内化。为了区分细胞表面结合的病毒与已内化的病毒，实验中设置了封闭步骤：利用未标记的链霉亲和素（STV）封闭细胞表面已结合病毒上暴露的生物素结合位点。随后对细胞进行透化处理并用STV-Cy3染色，从而特异性检测细胞内的病毒颗粒。我们提供了一种计算方法，用于确定内化病毒的相对量。该检测方法适用于评估药物处理或其他干预措施对IAV结合或内化过程的影响。

引言

甲型流感病毒（IAV）的入侵是一个多步骤过程，起始于病毒与靶细胞质膜上受体的结合¹。IAV的受体是唾液酸，其广泛存在于多种糖蛋白和糖脂上。IAV包膜中的血凝素（HA）蛋白可与唾液酸结合，从而介导病毒颗粒与靶细胞质膜的附着²。病毒主要通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞，但也有研究报道了其他入侵途径，例如巨胞饮作用^3-6。HA与唾液酸之间的相互作用似乎足以同时介导病毒颗粒的附着和内化启动⁷。然而，目前已有研究提出可能存在其他替代性入侵受体，其在IAV入侵过程中的作用正在被进一步研究^1,8,9。

目前，研究人员正致力于鉴定参与病毒生命周期的宿主因子，旨在开发亟需的新型抗病毒疗法^10-12。病毒进入是抑制甲型流感病毒（IAV）增殖的一个理想靶点，可在感染最早期阶段阻断病毒入侵。实验上检测IAV进入的不同阶段具有挑战性，通常需要大量病毒才能检测到进入细胞的病毒。此外，由于缺乏病毒复制，病毒进入变化的检测范围仅呈线性。这凸显了对高灵敏度检测方法的需求。

本文所介绍的检测方法可用于检测与细胞结合的病毒总量中，附着于细胞表面的病毒以及被细胞内吞的病毒。利用生物素标记的野生型病毒，通过STV-Cy3染色并结合流式细胞术检测，可实现便捷的定量分析。将生物素标记的病毒在低温条件下与细胞结合，可使病毒颗粒附着于细胞表面，同时阻止其内吞。此时对细胞进行固定、通透化处理，再用STV-Cy3染色，即可检测附着在细胞表面的病毒。若在固定前增加一个封闭步骤，即用未标记的链霉亲和素（STV）孵育细胞，则可消除细胞外附着病毒颗粒的信号。接下来，在生物素标记的IAV完成结合后，将温度升至37 °C，使病毒颗粒发生内吞。由于已内吞的病毒颗粒被保护起来，无法与STV结合，因此可有效区分细胞外与细胞内的病毒。

每个实验条件下需要四个样品：“0 min”：第一个样品标记为“0 min”，用于检测细胞表面冷结合的病毒。“0 min + STV”：第二个样品标记为“0 min + STV”，提供实验的基线信号强度。通过STV封闭已结合的病毒，经STV-Cy3染色后的信号应明显低于“0 min”样品。“30 min”：第三个样品“30 min”包含由于温度转移至37 °C持续30分钟而导致的附着和内化病毒。“30 min + STV”：第四个样品“30 min + STV”用于测量病毒的细胞内组分。STV封闭步骤在30分钟孵育后进行。因此，细胞表面的病毒颗粒被STV结合，仅留下内化病毒可被STV-Cy3染色。内化病毒的相对量可通过“30 min + STV”样品测得的内化病毒量除以“30 min”样品代表的总病毒量计算得出。

作为对照，建议包括未感染的细胞。未感染细胞经STV-Cy3染色后所得信号反映了染色方案本身产生的背景信号。用于流感病毒（IAV）吸附的对照是用细菌神经氨酸酶（NA）对细胞进行预处理。NA可从细胞糖蛋白上切除唾液酸，从而去除细胞表面的吸附受体。叠氮化钠（SA）是一种强效的代谢抑制剂，可阻断内吞作用¹³。经叠氮化钠处理的细胞应表现为病毒结合阳性，但病毒内化呈阴性。

方案

开始前注意事项：操作活病毒时，须使用层流罩及适当的生物安全防护措施。本文所述为适合培养流感病毒株 A/WSN/33 的生长条件。感染复数（MOI）及孵育时间可能因所用病毒株的不同而有所变化。

1. 生物素化A/WSN/33病毒的制备

1. 使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Pen/Strep）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），将Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞接种至T175 cm²培养瓶中。在37 °C下培养细胞，直至细胞融合度达到约70%。
2. 感染前，吸除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0–7.3）洗涤细胞，加入足够体积的PBS以完全覆盖细胞单层。
3. 吸除PBS，用MOI为10^-4的A/WSN/33病毒感染细胞。将病毒稀释于含有0.02 mg Mg²⁺、0.01 mg Ca²⁺、0.3%牛血清白蛋白（BSA）和1% Pen/Strep的PBS（感染用PBS）中。T175 cm²培养瓶使用4 ml接种液。
4. 在37 °C下孵育1小时，吸除接种液，用移液器加入10 ml添加0.3% BSA、20 mM HEPES和1% Pen/Strep的DMEM至培养瓶中。
5. 在37 °C下继续孵育约3天，直至出现明显的细胞病变效应（CPE），然后收集上清液。CPE表现为细胞变圆，继而脱落并死亡¹⁴。
6. 将上清液在450 × g下离心5分钟，以去除细胞碎片。将上清液转移至新的离心管中，并重复此步骤一次。弃去沉淀。
7. 将上清液转移至超速离心管中，在上清液下方小心铺入5 ml用NTE缓冲液（10 mM Tris [pH 7.4]、100 mM NaCl、1 mM EDTA）稀释的30%蔗糖溶液。平衡离心管后，用PBS补足至终体积30 ml。在超速离心机中以112,398 × g（对应SW28转子25,000 rpm）离心90分钟。
8. 小心用移液器吸除上清液，将病毒沉淀在4 °C下用250 µl PBS浸泡过夜。通过反复吹打重悬沉淀。采用Bradford法测定纯化病毒的蛋白含量¹⁵。
9. 使用生物素标记试剂盒制备生物素化A/WSN/33病毒。按照试剂盒制造商的说明进行操作。
10. 简而言之，向纯化病毒中加入适量生物素，在冰上孵育2小时。将病毒转移至超速离心管中，用PBS补足至终体积30 ml。在超速离心机中以112,389 × g离心90分钟。用移液器吸除上清液，加入250 µl PBS。将沉淀在4 °C下过夜浸泡。分装后于-80 °C保存，可稳定至少24个月。
    注意：可通过标准噬斑实验测定生物素化IAV制备物的滴度，这可能有助于后续分析。但需注意，后续实验方案仅检测生物素化病毒颗粒。由于生物素化不完全而残留的未标记病毒颗粒将贡献于噬斑实验的感染性滴度，但不会在病毒吸附/内化实验中产生检测信号。

2. 确定所需生物素标记病毒的量  

注意：在进行黏附/内化实验之前，必须确定感染样品中所有细胞所需的生物素标记病毒的用量。

1. 根据制造商说明书培养并用胰蛋白酶消化A549细胞。使用细胞计数板对细胞进行计数。将200,000个A549细胞移入FACS深孔管中。在450 × g条件下离心3分钟。弃去上清液，用200 µl PBS重悬细胞沉淀。将细胞置于冰上冷却10分钟。
2. 用感染用PBS对生物素化病毒原液进行5倍系列稀释。
3. 将含有细胞的管在4 °C、450 × g条件下离心3分钟。弃去上清液，用100 µl含病毒的感染用PBS重悬沉淀。以不含生物素化病毒的感染用PBS作为阴性对照。冰上孵育1小时。
4. 将管在4 °C、450 × g条件下离心3分钟。弃去上清液，用200 µl PBS重悬沉淀。重复此步骤一次。
5. 固定步骤：将管在4 °C、450 × g条件下离心3分钟。弃去上清液，用100 µl含3.7%多聚甲醛（PFA）的溶液重悬沉淀。室温孵育10分钟。然后重复步骤2.4中的洗涤步骤。
6. 通透步骤：将管在4 °C、450 × g条件下离心3分钟。弃去上清液，用100 µl含0.5% Triton X-100的PBS重悬沉淀。室温孵育6分钟。然后重复步骤2.4中的洗涤步骤。
7. 将管在4 °C、450 × g条件下离心3分钟。弃去上清液，用50 µl含STV-Cy3的2% BSA PBS溶液重悬沉淀。（请注意，应在实验开始前确定STV-Cy3的最佳浓度。建议起始浓度为1:200，并测试2倍系列稀释至1:2,400。在我们的实验中，1:1,000的稀释度效果最佳。）
8. 室温避光孵育1小时。然后重复步骤2.4中的洗涤步骤，但将沉淀重悬于200 µl用PBS稀释的2% BSA溶液中。
9. 通过流式细胞术¹⁶分析样品。圈选Cy3阳性细胞群体。选择能够使A549细胞群中Cy3阳性细胞数量达到最大值的最低生物素化病毒浓度。

3. 确定所需链霉亲和素的用量

注意：阻断来自细胞外病毒信号的效率决定了该检测方法的检测范围。因此，尽可能消除STV-Cy3信号至关重要。所需STV的用量取决于所使用的生物素标记病毒储备液的量（由第2节确定）。

1. 按照步骤 2.1-2.4 操作，但使用第 2 节中确定的病毒浓度。
2. 将 STV 用含有 2% BSA 和 0.1% 叠氮化钠的 PBS 进行五倍系列稀释。
3. 在 4 °C 条件下以 450 × g 离心 3 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 50 µl STV 稀释液中。作为阴性对照，使用不含 STV 的含 2% BSA 和 0.1% 叠氮化钠的 PBS。冰上孵育 30 分钟，然后重复步骤 2.4 中所述的洗涤步骤。
4. 按照步骤 2.5-2.9 操作。在内化实验中，选择能够导致 Cy3 信号显著阻断（与未添加 STV 的样本相比）的最低 STV 浓度。可通过 CY3 阳性细胞百分比或 Cy3 信号的平均荧光强度来判断。理想情况下，经 STV 处理的样本的 Cy3 信号应尽可能接近模拟感染细胞的信号水平。

4. 黏附/内化实验

注意：在开始检测前，务必准备好所有试剂。对于结果部分中列出的三个对照组（模拟感染细胞、神经氨酸酶预处理细胞和叠氮化钠处理细胞），需要对本方案进行少量调整。

1. 准备16个深孔管，每管含有200,000个A549细胞。除包含4个管的实验组外，另设3种对照条件，每种需4个管：模拟感染细胞、神经氨酸酶（NA）预处理细胞和叠氮化钠处理细胞。每组均包含标记为“0 min”、“0 min + STV”、“30 min”、“30 min + STV”的4个管。
2. 在4 °C、450 × g条件下离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µl PBS中。
3. 在4 °C、450 × g条件下离心。弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µl含0.3% BSA、20 mM HEPES和1%青霉素-链霉素的DMEM（孵育培养基）中。37 °C孵育30分钟。
   注：对于神经氨酸酶对照组：使用细菌来源的神经氨酸酶（例如 霍乱弧菌来源的唾液酸酶），以200 mU/ml的浓度用孵育培养基稀释后重悬细胞。
4. 在4 °C、450 × g条件下离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µl PBS中。重复此步骤一次，然后将管置于冰上冷却10分钟。
5. 在4 °C、450 × g条件下离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于100 µl生物素标记的病毒中（使用第2节中确定的病毒浓度，以感染用PBS稀释）。冰上孵育1小时。然后重复步骤2.4中的洗涤步骤。
   注：对于模拟感染对照组：使用不含病毒的感染用PBS。对于叠氮化钠对照组：使用含0.1%叠氮化钠的感染用PBS稀释病毒。
6. 冰上感染后的样品处理：
   1. 对于“0 min”样品，执行步骤2.5，并将样品在4 °C保存，直至其他样品完成固定。
   2. 对于“0 min + STV”样品，在4 °C、450 × g条件下离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于50 µl STV中（使用第3节中确定的浓度，以含2% BSA和0.1%叠氮化钠的PBS稀释，以防止样品处理过程中病毒内化）。冰上孵育30分钟。随后执行步骤2.4–2.5，并将样品在4 °C保存。
   3. 对于“30 min”样品，在4 °C、450 × g条件下离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于含2% BSA的200 µl PBS中。37 °C孵育30分钟。随后执行步骤2.4–2.5，并将样品在4 °C保存。
      注：对于叠氮化钠对照组：在37 °C孵育30分钟时，使用含2% BSA和0.1%叠氮化钠的PBS。
   4. 对于“30 min + STV”样品，在4 °C、450 × g条件下离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于含2% BSA的200 µl PBS中。37 °C孵育30分钟。然后在4 °C、450 × g条件下离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于50 µl STV中（使用第3节中确定的浓度，以含2% BSA和0.1%叠氮化钠的PBS稀释，以防止样品处理过程中病毒内化）。冰上孵育30分钟。随后执行步骤2.4–2.5，并将样品在4 °C保存。
      注：对于叠氮化钠对照组：在37 °C孵育30分钟时，使用含2% BSA和0.1%叠氮化钠的PBS。
7. 执行步骤2.6–2.8，并通过流式细胞术分析样品。测定各样品中Cy3阳性细胞的百分比。
8. 计算结合病毒的百分比及内化病毒的相对量。
   1. 为计算结合病毒的量，可使用Cy3阳性门控细胞的百分比或Cy3信号的平均荧光强度。为便于比较，将未处理细胞设为100%（图4B）。
      注：结合病毒的百分比由“0 min”样品表示。
   2. 为计算内化病毒的量，取“30 min + STV”样品与“30 min”样品的比值（图5B）。
      注：如上所述，可使用Cy3阳性门控细胞的百分比或Cy3信号的平均荧光强度。

结果

描述四种不同实验条件的示意图见图1。代表性实验结果展示于图2–图5。在“0分钟”样本中，生物素标记的病毒在低温下结合至靶细胞，可通过STV-Cy3染色观察到（图1和图2）。当进行封闭步骤（即“0分钟+STV”样本）时，细胞表面的病毒不再能被STV-Cy3染色检测到。因此，“0分钟+STV”样本中的信号强度相较于“0分钟”样本显著降低（图1和图2）。当温度升至37 °C后，附着的病毒被细胞摄取（“30分钟”样本）。内化的病毒对未标记STV的封闭不敏感，因此在“30分钟+STV”样本中，相对于未进行STV封闭的“30分钟”样本，信号强度下降程度较小（图1和图2）。

对照组包括模拟感染、NA 处理和 SA 处理。 图3 显示第4节所述所有实验条件下Cy3...

讨论

本方案描述了一种通过流式细胞术简便检测病毒吸附与内化的实验方法。该方法可使用标记的野生型病毒，相较于病毒样颗粒（VLP），更接近真实的病毒感染过程。尽管本方案已针对甲型流感病毒（IAV）的吸附与内化检测进行了优化，但亦可轻松适用于其他病毒。此外，由于采用流式细胞术进行检测，可在实验中便捷地加入共染步骤。 例如 用于在敲低或过表达目标蛋白后检测其表达水平。因此，该实验可根据具体需求对方案进行相应修改。值得注意的是，本实验还可设置一系列时间点，以测量病毒随时间推移的内化过程，从而获得动力学信息。若将该实验方法应用于内化动力学未知的其他病毒，获取此类动力学数据可能尤为重要。

然而需要注意的是，由于缺乏病毒复制，黏附或内化差异以线性尺度发生，因此检测的时间窗口相对较小。为了提高结果的可信度并降低背景噪声，我们建议设置对照组（例如 上述对照）并进行多次重复实验。尽管图中展示的是一个代表性实验结果，但我们观察到不同实验之间具有良好的一致性：例如，在病毒黏附实验中，Cy3阳性细胞的比例在60–80%之间；在病毒内化实验中，该比例介于40–60%之间。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Life Technologies	41966-052
FBS	Life Technologies	10270-106
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-蔗糖	Fluka	84100
TRIS	Biosolve BV	20092391
EDTA	Sigma-Aldrich	3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN 试剂盒	Fisher Scientific	W9971E
Bio Rad 蛋白定量测定试剂盒	Bio Rad	500-0006
深孔管（1.2 ml 微量管）	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem  Electron microscopy sciences	15710
超速离心管	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
叠氮化钠	Fluka	71290
细菌神经氨酸酶/唾液酸酶	Sigma-Aldrich	N6514-1UN