膜运输过程由单一的蛋白质解析一个高度并行的纳米孔芯片分析系统

Summary

所提出的方案描述了使用跨孔无溶剂脂质双层在单个转运蛋白水平上分析膜蛋白介导的转运。这是通过创建批量生产的纳米孔阵列芯片，结合高度并行的数据采集和分析来实现的，从而能够在未来建立膜蛋白效应子筛选。

Abstract

上的单个蛋白质水平的膜蛋白运输仍然逃避详细的分析，如果易位衬底是非电的。相当大的努力在这一领域已经取得，但技术实现自动化高通量运输分析与膜转运的分析所需的无溶剂型脂质双层技术组合是罕​​见的。然而，这类转运体是细胞动态平衡至关重要的，因此迫切需要在药物开发和方法，以获得新的见解的主要目标。

在这里介绍稿件描述了一种新的生物芯片的膜蛋白介导的运输过程中的单一转运分辨率分析建立和处理。生物芯片是由通过纳米孔是在它的设计高度并行，可在工业级和数量来制造封闭微腔。蛋白窝藏脂质体可直接被应用到在芯片表面上形成使用SSM的技术自组装孔跨越脂质双层（固体支持的脂质膜）。孔横跨膜的部件是独立的，为基片易位接口进入或离开腔室空间，它可以随后在实时多光谱的荧光读数。标准操作规程（SOP）建立允许简单的建立几乎每一个膜蛋白的芯片表面，可以进行功能上的重组蛋白窝藏脂质双层的。唯一的先决条件是对非电的输送基板建立了荧光读出系统。

高内涵筛选的应用是通过使用自动化倒置荧光显微镜并行记录多个芯片的accomplishable。可以使用免费的定制设计分析软件进行分析大型数据集。三色多光谱荧光读出还允许无偏数据判别成不同的事件类，消除假阳性结果。

芯片技术目前基于SiO ₂的表面上，但使用涂覆金的芯片表面进一步官能也是可能的。

Introduction

膜蛋白质的分析已经成为过去20年中增加了对基础和制药研究兴趣。新型药物的开发依赖于识别和新的目标细致的刻画，目前正在限制因素之一。即所有的药物靶标-约60％是膜蛋白¹的事实，使得技术的发展，以阐明其功能最重要的。

在过去，电的通道和转运的研究技术已经开发在众多^{2 - 4。}在相反的非电的基材呈现出更为艰巨的任务。然而，它们特别感兴趣作为首要的药物靶标，因为它们控制穿过细胞膜和功能键受体溶质和营养物质的熔剂在信号级联^5。

相当大的努力已投入T的发展echniques研究膜转运蛋白^6,7的功能。 ^10，包括固体支持的脂质双层，拴系双层^11,12 microblack脂膜^13，14和原生泡囊阵列^15,16仅举几^-使用固体支持膜系统已在本领域⁸成为最有希望的工具。他们中的一些甚至可以作为商业设置^17，18。一些例子已经发表结合研究单膜....

Protocol

1.大单层脂质体的制备（的LUV）

1. 清洁的圆底烧瓶（10毫升体积）用氮气以除去任何灰尘颗粒。冲洗用乙醇圆底烧瓶中。
   注:残余乙醇是可以容忍的，并且不影响随后的步骤。
2. 洗1毫升玻璃注射器3倍，氯仿，以消除任何污染。加入4毫升SoyPC20（25毫克/毫升的氯仿溶液）向圆底烧瓶中并用另外DOPE ^{ATTO 390}的脂质溶液掺杂到0.1摩尔％的最终浓度。
   注意:除了DOPE ^{ATTO 390}其他荧光团标记的脂质或亲脂性染料也可使用，这取决于可用的激励源。
3. 圆底烧瓶连接到旋转蒸发器。干燥的脂质膜为40分钟，在300毫巴，30℃水浴温度和最大的旋转速度，以在烧瓶的玻璃壁的均匀脂质膜。
4. TRANSF尔烧瓶中在室温下高真空泵和干燥的脂质膜为30分钟。
5. 加入5毫升缓冲液（20毫摩尔Tris，150mM的氯化钠，pH值8.0;无菌过滤）和图8的玻璃珠（2.7毫米直径，乙醇洗涤，并干燥）到烧瓶中。将烧瓶连接到旋转蒸发器，并没有在50℃下真空以最大速度旋转。
   注意:玻璃珠从玻璃壁机械地位移的脂质膜，导致（多层）囊泡形成。后45分钟旋转的溶液出现乳状和没有残留的脂质膜应该在烧瓶壁可见。代替玻璃珠其他方法，如超声处理该烧瓶在水浴超声波仪，涡旋烧瓶或温和的补液方法也是适用的。
6. 在惰性气体（氩气）的烧瓶转移到超声波浴声处理，在....

Results

孔横跨膜可以很容易地在一个自组装方式的纳米结构化芯片表面上产生。然而，潜在的过程仍然细腻许多参数，如脂质体大小，脂质体人口，层数，脂质和盐的浓度和化学表面特性的单分散性的影响。大多数这些参数已经仔细表征和在上述协议标准化。其他参数应但是每一个新的准备过程中进行检查，以确保成功的实验。这些脂质体大小分布和人口分散度（图 2 的A）。为了达到最佳的孔隙跨越膜的形成和避免脂质体侵入到空腔空间脂质体大小以及细孔径以上是必要的。此外，单分散脂质体制剂已被证明，得到在膜最好的结果扩展和副食上。具有要检查的每一个制备的另一个关键步骤是复原后的蛋白质的活性。使用用于与^MSCLģ22℃重构脂质体荧光脱猝灭测定中，通道开口可通过荧光光谱进行监控，从而脂质体窝藏活性^MSCLģ22℃蛋白（图 2 <.......

Discussion

这里提出的技术允许膜蛋白转运的一个高度并行分析。重构膜蛋白系统可以直接应用到生物芯片，使得理论上每膜转运的适应或信道成为可能。运输分析仅由建立的荧光读出系统的任通过直接荧光变化（荧光团的易位或荧光标记的底物）或间接荧光变化（pH敏感染料，次级酶反应）的限制。后者，但是还没有建立。

上的单个蛋白质水平膜通道或转运的功能特性是该技术的主要焦点。在使用自动显微镜组合，蛋白质效应建立的筛选应用也是可能的。该测定法设置允许的最多8个芯片的并行记录，与每个芯片上的多个检测点的。因为芯片的完全分离的，它是真正的平行，允许多个实验重复包括控制在一个单一实验运行，一旦条件已经成立。

设置实验中的关键步骤是真正单层囊泡的制备中，所选择的蛋白质的活性重组，芯片表面和悬浮脂质双层朝向在测定中使用的基板的保持能力上扩频脂蛋白体的效率。

而单层囊泡的制剂的基本重要性该测定，以避免建立悬浮脂质双层形成期间在芯片表面上的多层膜薄片，它是相当容易的通过在制备过程中超声处理的脂质体，以确保囊泡unilame.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂
[2-（三甲基铵）乙基] 甲烷乙硫磺酸盐	多伦多研究化学公司	T792900	MTSET;经水水解。以干燥的等分试样保存在 -80 °C 下。在缓冲液中溶解后立即使用（30 分钟）。
1 ml 气密注射器	Hamilton	#1001
10 ml 圆瓶	Schott Duran
2.7 mm 玻璃珠	Roth	N032.1
2-丙醇	Roth	9866.5
30 cm Luer-Lock 延长管	Sarstedt	744304
丙酮	Roth	5025.5
生物珠 SM-2吸附剂	Bio-Rad	152-3920	在首次使用前需要激活
CaCl2 Dihydrat	Roth	HN04.3
钙黄绿素	Sigma	C0875	在 -20 ° 避光储存;C
氯仿试剂级	VWR 化学品	22711324
DOPEATTO390	ATTO-TEC	AD 390-165	在 -20 ° 下避光存放;C
乙醇无水	Sigma-Aldrich	32205
Injekt 一次性注射器	Braun	460 60 51V
Injekt-F 一次性注射器	Braun	91 66 017V
Keck 夹	Schott	KC29
L-&α;-磷脂酰胆碱，20%（大豆）	Avanti 极性脂质	5416016	-20 &°g 的惰性气体下储存;C
NaCl 每年 99.5%	Roth	3957.2
纳米孔 E100 晶圆/芯片	Micromotive（美因茨/德国）		可根据要求提供
Nucleopore 径迹蚀刻膜 0.4 µm	Whatman	800282
俄勒冈绿葡聚糖 488 （70 kDa）	life Technologies	D-7173	在 -20 ° 处存放;C
oy647	Luminartis （Münster/德国）	OY-647-T-1mg	在 -20 ° 避光处储存;C
Rotilabo 注射器过滤，未灭菌，孔径 0.22 µm	Roth	P 818.1
Sephadex G-50	Sigma-Aldrich	G5080	色谱柱材料，用于尺寸排阻色谱
硅橡胶MDX4-4210	道康宁		固化剂，用于将芯片固定在盖玻片支架上
粘性-滑动 8 孔	ibidi	80828	多孔室，用于安装到载玻片上（芯片支架）
三通旋塞阀 蓝色	Sarstedt	744410001
Tris Pufferan 99.9% 超高质量	Roth	5429.2
Triton-X 100	Roth	6683.1
Whatman 0.2 µm 纤维素硝酸盐膜过滤器	Roth	NH69.1
名称	公司	><>目录号	评论
>设备
Büchi 461 水浴	Büchi
Büchi Rotavapor RE 111	Büchi
Cary Eclipse 荧光分光仪	瓦里安
LiposoFast 迷你挤出机	Avestin
隔膜泵	Vaccubrand	15430
Nanosight 纳米粒子追踪显微镜	Malvern / Nanosight	LM 14C
NyONE 显微镜	Synentec		可根据要求提供
泵控制	Vaccubrand	CVC 2II
超声波浴 Sonorex RK100H	Brandelin 电子	31200001107477
真空泵 RC5	Vaccubrand	1805400204
水浴 W13	Haake	002-9910
等离子清洁器 PDC-37G	Harrick 等离子清洁	PDC-37G
名称	>Company	目录号	评论
Software
ImageJ	开源	http://imagej.nih.gov/ij/	科学图像处理软件
NanoCalcFX	免费软件	http://sourceforge.net/projects/nanocalc/	用于大量传输动力学数据集的数据分析/评估软件
NTA 2.3 分析软件	Nanosight		用于纳米粒子跟踪的数据采集和分析软件显微镜
NTA 2.3 Temperature Comms	Nanosight		温度控制软件，用于纳米粒子跟踪显微镜