本方案介绍了利用跨孔无溶剂脂双层在单个转运蛋白水平上分析膜蛋白介导的转运过程。该方法通过制备大量生产的纳米孔阵列芯片，结合高通量数据采集与分析，有望实现膜蛋白效应物筛选的未来应用。
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本文内容
摘要
摘要
在单个蛋白质水平上，如果转运的底物不具有电化学性，则其膜蛋白运输过程仍难以进行详细分析。尽管该领域已付出大量努力，但能够实现自动化高通量运输分析、同时结合分析膜转运蛋白所必需的无溶剂脂双层技术的方法却极为罕见。然而，这类转运蛋白在细胞稳态中至关重要，因此是药物研发中的关键靶点，迫切需要新的方法来获得深入认识。
本文介绍了一种新型生物芯片的建立及其操作方法，该芯片可用于在单个转运蛋白分辨率下分析膜蛋白介导的转运过程。该生物芯片由被纳米孔包围的微腔构成，具有高度并行的设计特点，可实现工业化规模和批量生产。含有蛋白质的脂质体可直接施加于芯片表面，利用SSM技术（固相支持脂质膜）形成自组装的跨孔脂双层。膜的跨孔部分为游离状态，为底物向微腔内或外的转运提供了界面，且可通过多光谱荧光实时检测进行监测。标准操作程序（SOPs）的建立使得几乎所有能够功能性重建的膜蛋白均可在芯片表面高效地形成含蛋白脂双层。唯一前提是需建立针对非电活性转运底物的荧光检测系统。
通过使用自动倒置荧光显微镜并行记录多个芯片，可实现高内涵筛选应用。可利用免费提供的定制分析软件分析大规模数据集。三色多光谱荧光检测还能够对不同事件类别进行无偏的数据区分，从而消除假阳性结果。
芯片技术目前基于SiO2表面，但也可使用镀金芯片表面进行进一步功能化。
引言
在过去的20年中，膜蛋白的分析在基础研究和药物研发领域日益受到关注。新型药物的开发依赖于对新靶点的鉴定和深入表征，而这一环节目前仍是主要的限制因素。由于所有药物靶点中约有60%为膜蛋白1，因此发展用于阐明其功能的技术显得尤为重要。
过去，已开发出多种用于研究生电性通道和转运蛋白的技术2-4。相比之下，非生电性底物的研究则更具挑战性。然而，这类底物作为重要的药物靶点备受关注，因其可调控溶质和营养物质跨细胞膜的转运，并在信号转导级联中发挥关键受体功能5。
人们已投入大量努力开发用于研究膜转运蛋白功能的技术6,7。在该领域中，基于固相支撑膜的系统已成为最有前景的工具8-10，其中包括固相支撑脂双层、拴系脂双层11,12、微孔黑色脂膜13,14以及天然囊泡阵列15,16 等。其中一些系统甚至已有商业化装置可供使用17,18。已有若干....
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方案
1. 大型单层囊泡（LUVs）的制备
- 用氮气清洗一个圆底烧瓶（10 ml 体积），以去除任何灰尘颗粒。再用乙醇冲洗该圆底烧瓶。
注意：残留的乙醇可以耐受，不会干扰后续步骤。 - 用氯仿清洗一支 1 ml 玻璃注射器 4 次，以去除任何污染物。向圆底烧瓶中加入 4 ml SoyPC20（溶于氯仿，浓度为 25 mg/ml），并向脂质溶液中掺入额外的 DOPEATTO390，使其最终浓度为 0.1 mol%。
注意：可根据可用的激发光源，选用其他荧光标记脂质或亲脂性染料替代 DOPEATTO390。 - 将圆底烧瓶连接至旋转蒸发仪。在 300 mbar、30 °C 水浴温度及最大转速条件下干燥 40 分钟，使脂质在烧瓶玻璃壁上形成均匀的脂膜。
- 将烧瓶转移至高真空泵中，在室温下继续干燥脂膜 30 分钟。
- 向烧瓶中加入 5 ml 缓冲液（20 mM Tris，150 mM NaCl，pH 8.0；经无菌过滤）和 8 颗玻璃珠（直径 2.7 mm，经乙醇清洗并干燥）。将烧瓶连接至旋转蒸发仪，在 50 °C 下以最大转速无真空旋转。
注意：玻璃珠通过机械作用将脂膜从玻璃壁上剥离，从而形成（多层）囊泡。旋转 45 分钟后，溶液呈乳白色，烧瓶壁上应无可见的残留脂膜。除玻璃珠外，也可采用其他方法，如将烧瓶置于水浴超声仪中进行超....
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结果
可以通过自组装方式在纳米结构芯片表面轻松形成跨越孔隙的膜。然而，该过程仍然较为复杂，并受到多种参数的影响，例如脂质体大小、脂质体群体的单分散性、膜层数、脂质浓度、盐浓度以及化学表面特性。上述方案中已对大多数参数进行了仔细表征并标准化。但其他一些参数在每次新制备过程中仍需检查，以确保实验成功。这些参数包括脂质体尺寸分布及群体分散性（图 2A）。为实现最佳的跨孔膜形成并避免脂质体侵入孔腔空间，脂质体尺寸必须明显大于孔径。此外，研究表明，单分散的脂质体制备物在膜铺展与融合过程中效果最佳。另一个每次制备时都必须验证的关键步骤是蛋白在重组后的活性。通过使用荧光去猝灭检测法，可对重组了MscLG22C的脂质体进行通道开放监测，从而通过荧光光谱法测定含有活性MscLG22C蛋白的脂质体比例（图 2B）。
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讨论
本文介绍的技术可实现膜蛋白转运的高通量平行分析。重建的膜蛋白系统可直接应用于生物芯片，理论上使得所有膜转运蛋白或通道的适配成为可能。转运分析的限制仅在于荧光检测系统的建立，该系统可通过直接荧光变化（荧光分子或荧光标记底物的跨膜转运）或间接荧光变化（pH敏感性染料、次级酶促反应）实现。然而，后者尚未建立。
该技术主要关注在单个蛋白质水平上对膜通道或转运蛋白进行功能表征。结合自动化显微镜，还可建立针对蛋白质效应物的筛选应用。该检测体系支持最多8个芯片的平行记录，每个芯片上可设置多个检测位点。由于各芯片之间完全独立，因此实现了真正的并行检测，一旦实验条件确定，单次实验运行即可完成包括对照在内的多个实验重复。
实验设置中的关键步骤包括制备真正单层脂质体、目标蛋白的主动重组、蛋白脂质体在芯片表面的铺展效率，以及悬浮脂质双层对实验中所用底物的保留能力。
尽管制备单层囊泡对于本实验至关重要，以避免在悬浮脂双层形成过程中于芯片表面产生多层膜片，但通过在脂质体制备过程中进行超声处理，可相当.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
我们感谢 Barbara Windschiegl 在制定标准操作程序方面的帮助；感谢 Dennis Remme 对 NanoCalcFX 软件的开发工作；感谢 Alina Kollmannsperger、Markus Braner 和 Milan Gerovac 对稿件提出的有益建议。德国研究基金会（DFG）和德国联邦教育与研究部向 R.T. 提供的德国-以色列项目合作（DIP）资助，以及德国联邦经济与技术部（ZIM R&D 项目）资助了 R.T.，Nanospot GmbH 支持了本工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| [2-(三甲铵基)乙基] 甲烷硫代磺酸盐 | Toronto Research Chemicals Inc. | T792900 | MTSET；遇水水解。于-80 °C 保存干燥粉末分装样品。溶于缓冲液后立即使用（30分钟内）。 |
| 1 ml 气密式注射器 | Hamilton | #1001 | |
| 10 ml 圆底烧瓶 | Schott Duran | ||
| 2.7 mm 玻璃珠 | Roth | N032.1 | |
| 2-丙醇 | Roth | 9866.5 | |
| 30 cm 鲁尔锁延长管 | Sarstedt | 744304 | |
| 丙酮 | Roth | 5025.5 | |
| Bio-Beads SM-2 吸附剂 | Bio-Rad | 152-3920 | 首次使用前需活化 |
| CaCl2 二水合物 | Roth | HN04.3 | |
| 钙黄绿素 | Sigma | C0875 | 避光保存于 -20 °C |
| 氯仿，试剂级 | VWR Chemicals | 22711324 | |
| DOPEATTO390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | 避光保存于 -20 °C |
| 无水乙醇 | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Injekt 一次性注射器 | Braun | 460 60 51V | |
| Injekt-F 一次性注射器 | Braun | 91 66 017V | |
| Keck 夹 | Schott | KC29 | |
| L-α-磷脂酰胆碱，20%（大豆） | Avanti Polar Lipids | 5416016 | 在惰性气体保护下于 -20 °C 保存 |
| NaCl 99.5% p.a. | Roth | 3957.2 | |
| Nanopore E100 晶圆/芯片 | Micromotive (Mainz/Germany) | 可应要求提供 | |
| Nucleopore 径迹蚀刻膜，0.4 µm | Whatman | 800282 | |
| Oregon Green Dextran 488 (70 kDa) | life Technologies | D-7173 | 避光保存于 -20 °C |
| Oy647 | Luminartis (Münster/Germany) | OY-647-T-1mg | 避光保存于 -20 °C |
| Rotilabo 注射式过滤器，非无菌，孔径 0.22 µm | Roth | P 818.1 | |
| Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | G5080 | 尺寸排阻色谱柱填料 |
| Silastic MDX4-4210 | Dow Corning | 用于芯片固定在盖玻片上的固化剂 | |
| sticky-Slide 8孔板 | ibidi | 80828 | 用于安装在玻片上的多孔腔室（芯片支架） |
| 三通旋塞阀（蓝色） | Sarstedt | 744410001 | |
| Tris 缓冲液，99.9% 超纯级 | Roth | 5429.2 | |
| Triton-X 100 | Roth | 6683.1 | |
| Whatman 0.2 µm 硝酸纤维素膜滤器 | Roth | NH69.1 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 设备 | |||
| Büchi 461 水浴锅 | Büchi | ||
| Büchi Rotavapor RE 111 | Büchi | ||
| Cary Eclipse 荧光分光光度计 | Varian | ||
| LiposoFast Mini 挤出仪 | Avestin | ||
| 膜泵 | Vaccubrand | 15430 | |
| Nanosight 纳米颗粒追踪显微镜 | Malvern / Nanosight | LM 14C | |
| NyONE 显微镜 | Synentec | 可应要求提供 | |
| 泵控制器 | Vaccubrand | CVC 2II | |
| 超声波清洗仪 Sonorex RK100H | Brandelin electronic | 31200001107477 | |
| 真空泵 RC5 | Vaccubrand | 1805400204 | |
| 水浴锅 W13 | Haake | 002-9910 | |
| 等离子清洗仪 PDC-37G | Harrick Plasma | PDC-37G | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 软件 | |||
| ImageJ | 开源软件 | http://imagej.nih.gov/ij/ | 科学图像处理软件 |
| NanoCalcFX | 免费软件 | http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ | 用于大规模传输动力学数据集的数据分析/评估软件 |
| NTA 2.3 分析软件 | Nanosight | 纳米颗粒追踪显微镜的数据采集与分析软件 | |
| NTA 2.3 温度控制软件 | Nanosight | 纳米颗粒追踪显微镜的温度控制软件 |
参考文献
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. Drug-target network. Nat Biotechnol. 25, 1119(2007).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free me....
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