从人类腭扁桃体B和T淋巴细胞有效隔离协议

摘要

腭扁桃体是 B 和 T 淋巴细胞的丰富来源。在这里，我们提供了一种简单、高效和快速的方案来从人腭扁桃体中分离 B 和 T 淋巴细胞。所描述的方法已特别适用于扁桃体炎症病毒病因的研究，称为扁桃体炎。

摘要

扁桃体是免疫系统的一部分，是抵御吸入病原体的第一道防线。通常术语"扁桃体"是指位于咽部口腔外侧壁的腭扁桃体。手术切除的腭扁桃体为 B 和 T 淋巴细胞提供了一种方便、可访问的来源，用于研究外来病原体与宿主免疫系统之间的相互作用。该视频方案描述了手术切除的人腭扁桃体的解剖和处理，然后从同一组织样本中分离单个 B 细胞和 T 细胞群。我们提出了一种方法，该方法使用抗体依赖性亲和方案有效分离扁桃体 B 和 T 淋巴细胞。此外，我们使用该方法证明人腺病毒特异性感染扁桃体 T 细胞部分。已建立的方案通常适用于高效、快速地分离扁桃体 B 细胞和 T 细胞群，以研究不同类型病原体在扁桃体免疫反应中的作用。

引言

扁桃体是位于上呼吸消化道上皮下方并与上皮接触的未完全包膜淋巴组织的集合。通常术语"扁桃体"是指位于咽部口腔外侧壁的腭扁桃体。成对的腭扁桃体与鼻咽扁桃体（腺样体）、成对的输卵管扁桃体和舌扁桃体一起构成了所谓的"Waldeyer 环"。后者负责吸入或摄入的病原体与呼吸消化道淋巴组织之间的初始接触^1,2。事实上，大量报告表明，在腭扁桃体组织样本中可以检测到细菌和病毒抗原^2-6。

腭扁桃体由致密的淋巴组织组成，覆盖着复层鳞状非角化上皮。扁桃体有许多隐窝，上皮内陷，它们穿透实质增加了表面积。在组织学上，腭扁桃体包含许多具有生发中心的淋巴滤泡，这些滤泡是 B 细胞成熟和分化的部位（B 细胞区域）。同样，腭扁桃体包含 T 细胞，这些细胞主要位于滤泡外区域（T 细胞区域）。除了 B 细胞和 T 细胞外，还可以在腭扁桃体中检测到各种滤泡树突状细胞^1,2。

由于腭扁桃体的解剖位置，腭扁桃体很容易通过手术手术进入。例如，手术切除扁桃体，称为扁桃体切除术，在世界范围内常规进行⁷。在扁桃体增生的儿童中，有时会使用部分手术切除扁桃体（扁桃体切开术），以减轻患者的术后疼痛。考虑到各种病原体在扁桃体中的积累，手术切除扁桃体为研究病毒和细菌制剂对扁桃体淋巴细胞功能的影响提供了独特的机会^2,8。此外，还可以研究某些病原体是否喜欢居住在特定的细胞亚群^{中 9}。此外，由于扁桃体是 B 淋巴细胞的丰富来源，因此分离的扁桃体 B 淋巴细胞可以有效地用于研究不同 B 细胞亚群的活性¹⁰。然而，由于腭扁桃体包含多种细胞类型的混合物，因此需要一种有效的方法来分离不同的细胞亚群。

在这里，我们描述了一种使用磁激活细胞分离技术从人腭扁桃体中高效快速分离扁桃体 B 和 T 细胞群的简单方法（图 1）。此处描述的方法对于想要评估不同感染因子在人类淋巴器官（如腭扁桃体）中的作用的科学家很有用。

方案

该协议描述了从人类患者材料淋巴细胞的分离，因此，需要一个伦理批准。在本研究中所做的工作给予的乌普萨拉伦理审查委员会（DNR。三百八十七分之二千〇一十三）。

1.分离单个核人力腭扁桃体细胞（MNCs）的

警告:人类起源如血液，组织或体液的所有非屏蔽材料应被视为可能受感染的材料。因此，处理的人体组织推荐的生物安全的做法应该得到遵守。

注意:为了避免污染，所有的解决方案和细胞培养设备必须是无菌的。所有缓冲液和溶液应预先冷却并保持在冰上。扁桃体组织分离出的细胞应保持在冰上处理。

1. 获得从接受扁桃体切除术或扁桃体部分切除术（图2）的患者新鲜扁桃体。急跌组织clum的ps到装有冰冷无菌的Hanks平衡盐溶液（HBSS）在50毫升离心管中补充有5％胎牛血清（FBS），10mM的谷氨酰胺，0.05毫克/毫升庆大霉素和1％抗菌 - 抗霉菌混合物（青霉素，链霉素和两性霉素B）。
2. 保持与淹没扁桃体组织样品管在任何时候都在冰上。尝试尽快处理的扁桃体，并最迟手术切除后3小时。
3. 广场上冰60毫米的塑料细胞培养板的扁桃体和保持蘸有HBSS组织。删除可见血栓，脂肪和结缔组织从扁桃体表面干净的镊子。
4. 使用含有5ml HBSS中一个新的60毫米细胞培养板。切割扁桃体组织丛成使用无菌​​剪刀和/或手术刀的3-10毫米的碎片。
5. 制备装有10ml HBSS的新60毫米的细胞培养板，并放置一个100μm的塑料的细胞过滤的HBSS溶液。
6. 转移迪斯ected扁桃体碎片进入细胞过滤用无菌镊子。使用塑料注射器的柱塞端，顺利地通过细胞过滤器挤压组织碎片。确保扁桃体片段完全沉浸在HBSS中。
7. 丢弃细胞过滤与组织遗体和从60毫米细胞培养板转移得到的细胞悬液至50ml塑料离心管中。留在冰上的管继续进行步骤1.8和1.9，而。
8. 在大扁桃体的情况下，大于2厘米大小（图2），挤压扁桃体片段在两个细胞滤网，以避免在过滤器网眼堵塞。
9. 获得35毫升细胞悬浮液的最终体积。
   注意 :在这一步，可以制备细胞悬浮液为低温保存（参见部分2）。
10. 加入10毫升如Ficoll密度梯度溶液例如到一个新的50ml离心管中。轻轻地覆盖在细胞suspens离子上的密度梯度溶液的顶部（步骤1.9）。避免了细胞悬浮液和密度梯度溶液的混合。
    注意 :密度梯度溶液必须被升温至室温。
11. 离心细胞悬浮液在水平转子在700×g离心20分钟，在室温。不要激活离心机快制动可能会破坏梯度的制动功能。此外，使用可在离心机的最低加速功能。
    注意 :在此之后的离心步骤，观察跨国公司，为蓬松的白色层在界面处，和红血细胞（红细胞），成纤维细胞和细胞碎片的沉淀物在管的底部。
12. 小心地用10毫升移液管收集跨国公司层。将细胞悬浮液到一个新的50ml离心管中。
13. 加25毫升冰冷PBS，以细胞悬浮液和旋管中，在300×g离心5分钟以水平转子在4℃下。
14. 用25毫升移液管除去上清液并重复细胞沉淀洗涤步骤两次以上。最后重悬细胞沉淀在15ml PBS中。
    注意 :最后的洗涤步骤之后，就可以冷冻保存的细胞悬浮液（参见2）。
15. 申请10微升细胞悬液到血球细胞计数室和计数在显微镜下的细胞数。分配细胞的适量（例如^，2-3×10 7个）的15ml离心管中用于随后磁珠分离。保持这个等分在冰上，直到步骤3.2。

2.冷冻扁桃体细胞

1. 制备冷冻介质（90％FBS和10％DMSO）中，并保持它在冰上。对于长期储存保持冷冻介质在-20℃。
2. 确定使用血球细胞计数室（步骤1.15）细胞的总数。根据所需的冷冻的细胞密度计算所需冷冻介质的量（例如，10 ⁷细胞个冰冻培养基/毫升）。
3. 离心细胞悬浮液在300×g离心5分钟。滗析出上清液，而不干扰细胞沉淀重悬在冰冷的冷冻介质（来自步骤2.1）将细胞沉淀。
4. 分配1ml等分细胞悬浮液成设计用于长期储存在液氮中无菌小瓶。冻结小瓶中的异丙醇室，并将其存储在-80°CO / N。对于长期保存的小瓶转移到含有贮槽或-140℃的细胞冷冻液氮。
5. 解冻小瓶冷冻细胞，迅速温暖他们在37℃水浴。解冻时立即，分散细胞悬浮到10ml预温热的HBSS（用补充剂，步骤1.1）在15ml离心管中。旋管中于300×g离心5分钟，除去HBSS和重悬细胞沉淀在于HBSS所需的细胞密度（与补充剂，步骤1.1）。
   注:跨国公司房颤的可行性之三解冻是很重要的，因为死细胞的存在将降低纯化的B和T淋巴细胞的最终产率。
   注意 :根据我们的经验细胞存活率小于80％会降低细胞分离效率。

3.积极选择T淋巴细胞人口从扁桃体跨国公司

注 1:该协议是基于正选择从使用耦合到CD3抗体磁珠扁桃体跨国公司人CD3 ^{+ T淋巴细胞}的。有可能从新鲜（第1）或冷冻（第2节）跨国公司开始本节。

注2:开始用3×10 ⁷跨国公司。不要超过这个手机号码，因为分离柱可能阻塞，这将降低隔离效率。使用大柱，如果更多的细胞将被处理。在这个协议中使用的量已经为我们的细胞的数量被实验优化海关在我们的实验装置。

1. 制备分离缓冲液[PBS（pH为7.2），0.5％牛血清白蛋白（BSA）和2mM EDTA〕。通过0.45微米的过滤器，并储存在4℃下过滤分离缓冲液。
2. 旋转跨国公司悬架（步骤1.14），在300 XG 5分钟，在4℃。重悬的冰冷分离液在240微升所得细胞沉淀（每¹⁰ 7个细胞80微升）。细胞悬液转移到无菌的2毫升管。
3. 加入20微升的CD3磁性抗体与细胞溶液。孵育管1小时，在4℃下用连续轻柔混合，以保持细胞在悬浮液中。
4. 传输所有的细胞悬液入15ml试管含有5ml冰冷分离缓冲液洗涤细胞。
5. 离心管中，在300×g离心10分钟，在4℃下，在水平转子。
6. 同时成立了磁选柱。附加磁性分离到支架和放置列在组合通道员。通过应用500微升冰冷的分离缓冲液洗柱。丢弃通过流。
7. 放置柱下方的新款15 ml收集管。保持在冰上收集管。
8. 用移液管弃去上清液（步骤3.5）和轻轻悬浮于500μl分离缓冲液的细胞沉淀。应用细胞悬液的预洗塔的顶部，并让它运行通过。
   注:细胞团块会堵塞柱，从而降低流速。为了防止出现这种问题，将在塔的顶部的40微米的塑料细胞过滤。通过这个网格传递细胞将大大提高了该方法的效率。
9. 用1.5ml的分离缓冲液（500微升，10 ^7个细胞 ）洗涤塔4倍。等待列储到是空的（没有液体应在塔中观察到的）施加下一洗涤步骤之前进行。
   注意:获取CD3未标记细胞，视为乙淋巴细胞部分，因为它们是洗脱到收集管。
10. 拆下分离器和地点列到新款15 ml收集管。移液管2毫升分离缓冲液上柱。使用与列提供的柱塞洗脱阳性选择T淋巴细胞，这被认为是T淋巴细胞组分。
11. 确定纯化的细胞（步骤1.15），如果必要的数目。细胞悬液现在已经准备好为下游实验。

孤立4.流式细胞仪分析扁桃体B和T淋巴细胞

注意:多聚甲醛溶液有刺激性，并可能致癌。穿戴合适的防护服，手套和防护眼镜/面罩。

注1:该协议描述通过荧光活化细胞的方法中的分离的B和T细胞的直接染色分选（FACS）分析。这个步骤的主要目的是评估所述分离的细胞群自动对焦的纯度之三CD3磁性抗体分离。为此建立B和T细胞标记物，荧光团共轭的单克隆抗体CD20-FITC和CD2-APC，被使用。还列入同种型对照抗体的强烈建议区分非特异性"背景"的CD2和CD20抗体（见步骤4.8）的结合。

注2:有可能保持在1％多聚甲醛的纯化的细胞级分在黑暗中（PFA）溶液，在4℃，直至染色的时间 （例如，第二天。）。也同样地进行适用，如果有染色和FACS分析之间的时间间隔。请记住，在这两种情况下的细胞应该正确地与（含0.2％BSA的PBS）缓冲液，对染色或FACS分析之前PBSA洗涤。

1. 取出从步骤1.15跨国公司^6×10 6个细胞（前施加到列）从步骤3.10从步骤3.9和T淋巴细胞部分，B淋巴细胞部分。
2. 旋转细胞使用水平转子悬浮在300 XG 5分钟，在4℃。
3. 用移液管除去上清液并用1ml冰冷的PBSA洗细胞沉淀一次。旋转细胞悬浮液在300×g离心5分钟，在4℃。用吸管去除上清，重悬 细胞在600微升冰冷PBSA缓冲液中。
4. 加入100微升细胞悬浮液，以在FACS管的底部。
5. 加入100微升含10％热灭活人血清，每管的PBS，拌匀孵育在室温〜1分钟或20分钟冰。
   注:B淋巴细胞携带Fc受体。为了阻断Fc受体的纯化的细胞级分一起温育10％热灭活的人血清。的人血清是热在56℃下失活温育1小时。划分热灭活血清分成小等分试样并储存在-20℃。
6. 离心细胞悬浮液在300×g离心5分钟，在4℃下，在SW荷兰国际集团出转子。
7. 用移液管除去上清液并用1ml PBSA洗涤细胞沉淀。重复离心（300×g离心5分钟，4℃）。
8. 加入100微升PBSA到冰上每管。添加荧光团共轭单克隆抗体的合适量，根据制造商的建议（例如，20微升抗CD20和/或5微升抗CD2抗体在100μlPBSA的）。注意:不要忘记分配足够的对照管的流式细胞仪分析。在这个协议中的下列控制应包括:1）染色单独的抗-CD2和抗CD20抗体的细胞，2）染色的细胞与单独的抗-CD2和抗CD20同种型对照抗体和，3）细胞不加的抗体。
9. 短暂涡旋振荡试管并在黑暗中温育30分钟，在4℃。
10. 与PBSA洗2次。加入2毫升1％PFA溶液的样品。让细胞保留在煤灰溶液在476下在黑暗直到FACS分析的时间。
11. 立即运行样本在FACS仪器之前，（在4℃下300×g离心5分钟）用PBSA洗细胞2次。在1ml PBS中重悬样品保持在4℃（或在冰上），避光，之前在流式细胞仪的分离。
12. 做下面的流式细胞仪制造商提供的流量协议的FACS分类。

在隔离扁桃体B和T淋巴细胞5 PCR检测腺病毒的DNA

注1:腺病毒六邻体基因的引物是AdRJC1（5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3'）和^{AdRJC2（5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3'）11。}这些引物产生的139 bp的扩增。主机18S rRNA基因可以与引物tp206（5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3'）和TP207（5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'）进行检测。预期的扩增子大小为300基点。

注2:每个PCR运行包括阴性对照（蒸馏水_H 2 O）和从人B细胞系（BJAB）得到的阳性DNA对照感染人类腺病毒5型^12。

1. 提取的DNA（来自至少^1×10 6个细胞，步骤3.11），使用氧化硅膜基于柱纯化方法。采用苯酚和异硫氰酸胍^溶液 13中提取RNA。
2. 添加从B和T淋巴细胞100 ng的DNA至含有1x HF缓冲液，0.2mM的的三磷酸脱氧核苷酸的混合物（dNTP），0.25μM的每种引物和高保真DNA聚合酶在20微升的总体积1 U的反应混合物。
3. 以下循环条件下进行PCR扩增:30秒变性，在98℃下，然后是98℃30个循环持续10秒，67℃（六邻体）或58℃（18S rRNA）的30秒和72℃ 30秒。 PCR反应结束时的7分钟，在72℃最终延伸步骤。
4. 分离得到的PCR amplif上于1×TBE 1.5％琼脂糖凝胶ication产品缓冲液和通过用核酸染料染色可视化的预期条带。

结果

的扁桃体跨国公司结果在B和T淋巴细胞的高度纯化的亚群有效分离。这是通过FACS分析使用抗CD20和抗-CD2抗体，以检测B和T淋巴细胞群，分别（图3A）证实。与此相反，跨国公司导致细胞级分是从两个B和T细胞亚群（图3B）细胞的混合物低效的分离。

分离的扁桃体B和T淋巴细胞（图3A）是足够的质量为下游分析样核酸隔离。在当前的协议，DNA和RNA提取从B和T淋巴细胞被用于检测腺病毒的DNA和细胞的RNA。结果表明腺病毒DNA的扁桃体T淋巴细胞特异检测（图4）。从扁桃体B和T淋巴细胞也分离的RNA具有足够的质量和数量为downstrea米的应用程序（ 图5）。

讨论

一个影响该协议的结果的最重要因素是使用新鲜扁桃体材料作为原料。因此，扁桃体样品应在3个小时的手术后处理。扁桃体可以从成人和儿童中获得。从孩子扁桃体材料通常是较小的由于局部手术切除扁桃体（扁桃体部分切除术）的。因此，从扁桃体部分切除术的样品^（1×10 7 ^-1×10 8）中得到跨国公司的数目较少相比扁桃体样品^（1×10 8 -2×10 ^9）。然而，细胞分离过程将无论手术的类型是相同的。

最大化从磁激活细胞分选方法获得的细胞亚群的纯度需要一些优化。的量和孵育时间用CD3磁性抗体和上柱跨国公司的数目是应该选择的主要因素imized。运用过多的细胞会导致色谱柱的堵塞和细胞亚群的低效富集。在本协议的优化，我们发现，在分离柱施加大于^3×10 7跨国公司将导致塔和随后的不纯细胞级分（图3B）的堵塞。因此，从^3×10 7跨国公司给出很好富集淋巴细胞的级分具有足够的质量和数量的DNA和RNA提取（图4和...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Hanks 平衡盐溶液 （HBSS）	Gibco	14175-053	含有 5% 胎牛血清 （FBS）、10 mM 谷氨酰胺、 0.05 mg/ml 庆大霉素和 1% 抗生素 - 抗真菌混合物
冷冻培养基			90% FBS 和 10% DMSO
MACS 缓冲液			PBS （pH 7.2），0.5% BSA 和 2 mM EDTA
PBSA			含 0.2% BSA
的 PBS：			含有 1% 多聚甲醛 （PFA） 的 PBS。制作新鲜。PFA 是疑似致癌物。戴手套和护目镜。
抗生素-抗真菌剂混合物	Gibco	15240-062
60 毫米 Petridish	Nunc	150326
解剖前头	Fisher Scientific	1381241
直虹膜剪刀	Fisher Scientific	12912055
一次性手术刀	Swann-Morton	REF 0501
100 μm 塑料细胞过滤器	Corning Life Sciences	352360
40 μM 塑料细胞过滤器	康宁生命科学	352340
2 ml 塑料注射器	BD Biosciences
15 ml 锥形离心管	SARSTEDT	62554502
50 ml 锥形离心管	SARSTEDT	62547254
带固定角或摆动吊篮转子的低速离心机	Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque	Sigma-Aldrich	F5415-50ML	Ficoll 溶液
牛血清	生物工业	040071A
二甲基亚砜 （DMSO）	SIGMA	D2650-5X5ML
MACS MS 色谱柱	Miltenyi Biotec	130-042-201
MACS 人 CD3 微珠	Miltenyi Biotec	130-092-881
MACS 分离器 （Octo MACS）	Miltenyi Biotec	130-042-109
牛血清白蛋白 （BSA）	Merck Millipore	1120180100
EDTA	AnalaR NORMAPUR	20302.293
CD2 与别藻蓝蛋白偶联 （CD2-APC）	BD生物科学公司
CD20 偶联异硫氰酸荧光素 （CD20-FITC）	BD生物科学公司
人血清	Rockland Immunochemicals	D119-0100
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	Thermo Scientific	F-530L
FACS 管	BD Falcon	352003
冻存管	SARSTEDT	72379
BD LSRII 流式细胞仪	BD Biosciences
BD FACSDiva 4.1 软件	BD Biosciences
核蛋白血	Macherey-Nagel	740951.50	DNA 分离试剂盒
TRIzol  试剂	Life technologies	15596	RNA 分离试剂
血细胞计数器	The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	0610030	细胞计数仪
GelRed	Biotium	41003	核酸凝胶染色剂