腭扁桃体是B淋巴细胞和T淋巴细胞的丰富来源。本文提供了一种简便、高效且快速的从人腭扁桃体中分离B淋巴细胞和T淋巴细胞的实验方案。该方法已特别优化，适用于研究已知为扁桃体炎的扁桃体炎症的病毒病因学。
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摘要
摘要
扁桃体是免疫系统的一部分，可为抵御吸入性病原体提供第一道防线。通常，“扁桃体”一词指的是位于咽部口咽部侧壁的腭扁桃体。手术切除的腭扁桃体为研究外来病原体与宿主免疫系统之间的相互作用，提供了方便且易获取的B淋巴细胞和T淋巴细胞来源。本视频方案描述了手术切除的人腭扁桃体的解剖与处理过程，随后从同一组织样本中分离出独立的B细胞和T细胞群体。我们介绍一种利用抗体依赖性亲和法高效分离扁桃体B细胞和T淋巴细胞的方法。此外，我们应用该方法证明人腺病毒特异性感染扁桃体T细胞组分。所建立的方案可广泛适用于高效、快速地分离扁桃体B细胞和T细胞群体，以研究不同类型病原体在扁桃体免疫应答中的作用。
引言
扁桃体是一团团未完全包裹的淋巴组织，位于上呼吸道和消化道的上皮下方并与之接触。通常，“扁桃体”一词指的是位于咽部口腔部分侧壁的成对腭扁桃体。成对的腭扁桃体、咽鼓管扁桃体、舌扁桃体以及鼻咽扁桃体（腺样体）共同构成所谓的“瓦尔代耶环”（Waldeyer's ring）。该结构负责吸入或摄入的病原体与呼吸消化道淋巴组织之间的初始接触1,2。事实上，大量研究报告表明，可在腭扁桃体组织样本中检测到细菌性和病毒性抗原2-6。
腭扁桃体由致密的淋巴组织构成，表面覆盖着复层鳞状非角化上皮。扁桃体具有大量隐窝，即上皮内陷结构，深入实质以增加表面积。组织学上，腭扁桃体含有大量带有生发中心的淋巴滤泡，是B细胞成熟与分化的场所（B细胞区）。同时，腭扁桃体也包含T细胞，主要分布于滤泡外区域（T细胞区）。除B细胞和T细胞外，还可于腭扁桃体中检测到多种滤泡树突状细胞1,2。
由于解剖位置的关系，腭扁桃体易于通过外科手术进行干预。例如，被称为扁桃体切除术的扁桃体外科切除术在全球范围内常规开展7。对于患有扁桃体增生的儿童，有时采用扁桃体部分切除术（扁桃体切开术），以减少术后疼痛。鉴于扁桃体内可积聚多种病原体，手术切除的扁桃体为研究病毒和细菌因子对扁桃体淋巴细胞功能的影响提供了独特的机会2,8。此外，还可研究某些病原体是否倾向于定植于特定的细胞亚群中9。另外，由于扁桃体富含B淋巴细胞，分离得到的扁桃体B淋巴细胞可被高效用于研究不同B细胞亚群的活性10。然而，由于腭扁桃体含有多种细胞类型的混合物，因此需要一种有效的方法来分离不同的细胞亚群。
本文介绍一种利用磁性激活细胞分离技术从人腭扁桃体中高效快速分离B细胞和T细胞群体的简单方法（图1）。该方法适用于希望评估不同病原体在人淋巴器官（如腭扁桃体）中作用的科研人员。
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方案
本方案描述了从人类患者样本中分离淋巴细胞的过程，因此需要获得伦理批准。本研究开展的工作已获得乌普萨拉伦理审查委员会的许可（批准号：2013/387）。
1. 从人腭扁桃体中分离单个核细胞（MNCs）
警告：所有未经筛查的人源性材料，如血液、组织或体液，均应被视为可能具有感染性的物质。因此，应遵循推荐的生物安全操作规程来处理人体组织。
注意：为避免污染， 所有溶液和细胞培养设备必须保持无菌。所有缓冲液和溶液应预先冷却并置于冰上保存。扁桃体组织及分离的细胞应始终在冰上保存和操作。
- 从接受扁桃体切除术或扁桃体部分切除术的患者处获取新鲜扁桃体组织 (图2)。将组织块立即浸入装有冰上预冷的无菌Hanks平衡盐溶液（HBSS）的50 ml离心管中，HBSS中需添加5%胎牛血清（FBS）、10 mM谷氨酰胺、0.05 mg/ml庆大霉素及1%抗生素-抗真菌素混合液（青霉素、链霉素和两性霉素B）。
- 始终将含有浸没扁桃体组织样本的离心管置于冰上。应尽快处理扁桃体组织，最迟不得超过手术切除后3小时。
- 将扁桃体置于冰上的60 mm塑料细胞培养皿中，并用HBSS保持组织湿润。使用洁净的镊子清除扁桃体表面可见的血凝块、脂肪组织和结缔组织。
- 准备一个新的含5 ml HBSS的60 mm细胞培养皿。使用无菌剪刀和/或手术刀将扁桃体组织块切成3–10 mm大小的碎片。
- 准备另一个含10 ml HBSS的60 mm细胞培养皿，并将一个100 µm塑料细胞筛网放入HBSS溶液中。
- 用无菌镊子将切好的扁桃体碎片转移至细胞筛网上。使用塑料注射器的推杆末端轻柔地将组织碎片压过筛网。确保扁桃体碎片完全浸没在HBSS中。
- 弃去带有残留组织的细胞筛网，将所得的细胞悬液从60 mm细胞培养皿转移至一个50 ml塑料离心管中。在进行步骤1.8和1.9时，将离心管保持在冰上。
- 对于体积较大的扁桃体（尺寸大于2 cm，图2），应使用两个细胞筛网分别挤压组织碎片，以避免筛网孔径堵塞。
- 获得终体积为35 ml的细胞悬液。
注意：在此步骤可将细胞悬液制备用于冷冻保存（见第2节）。 - 在新的50 ml离心管中加入10 ml密度梯度溶液（如Ficoll）。将细胞悬液（步骤1.9）轻柔地叠加在密度梯度溶液上方，避免细胞悬液与密度梯度溶液混合。
注意：密度梯度溶液需提前升温至室温（RT）。 - 在摆动转子离心机中，于室温下以700 × g离心20分钟。离心过程中不得启用离心机的刹车功能，因为快速制动可能破坏密度梯度。同时，使用离心机上可设置的最低加速度模式。
注意：离心后，可在界面处观察到单个核细胞（MNCs）形成一层蓬松的白色层，而红细胞（RBCs）、成纤维细胞及细胞碎片则沉淀于管底。 - 使用10 ml移液器小心收集MNC层，并将细胞悬液转移至新的50 ml离心管中。
- 向细胞悬液中加入25 ml冰上预冷的PBS，于4 °C下在摆动转子离心机中以300 × g离心5分钟。
- 使用25 ml移液器吸除上清液，并重复洗涤细胞沉淀两次。最后将细胞沉淀重悬于15 ml PBS中。
注意：最终洗涤步骤完成后，可对细胞悬液进行冷冻保存（见第2节）。 - 取10 µl细胞悬液加入血细胞计数板的计数室中，在显微镜下计数细胞数量。将适量细胞（例如，2–3 × 107）分装至15 ml离心管中，用于后续磁珠分选。此分装样品在进行步骤3.2前需始终保持在冰上。
2. 扁桃体细胞的冷冻保存
- 准备冻存液（90% FBS 和 10% DMSO），并置于冰上。长期保存时，将冻存液置于 -20 °C。
- 使用血细胞计数板（步骤1.15）确定细胞总数。根据目标冻存细胞密度计算所需冻存培养基的用量（例如， 107 细胞/毫升冻存液
- 以300 × g离心细胞悬液5分钟。倾去上清液，注意不要扰动细胞沉淀，然后将细胞沉淀重悬于冰上预冷的冻存液（来自步骤2.1）中。
- 将1 ml细胞悬液分装至专用于液氮长期保存的无菌冻存管中。 将冻存管置于异丙醇冻存盒中，于 –80 °C 过夜冷冻，随后转移至液氮储存罐或 –140 °C 超低温细胞冻存冰箱中进行长期保存。
- 将冻存细胞的冻存管在37 °C水浴中快速解冻。解冻后立即把细胞悬液转移至含有10 ml预热的HBSS（含补充物，步骤1.1）的15 ml离心管中。在300 × g下离心5分钟，弃去HBSS，然后用HBSS（含补充物，步骤1.1）将细胞沉淀重悬至所需细胞密度。
注意: 解冻后单个核细胞的活力至关重要，因为死细胞的存在会降低纯化B淋巴细胞和T淋巴细胞的最终得率。
注意: 根据我们的经验，细胞活力低于80%会降低细胞分离效率。
3. 从扁桃体单个核细胞中阳性筛选T淋巴细胞群体
注意 1：本方案基于使用与 CD3 抗体偶联的磁珠从扁桃体单个核细胞（MNCs）中进行人 CD3+ T 淋巴细胞的阳性筛选。 可从新鲜（第 1 部分）或冻存（第 2 部分）的 MNCs 开始本部分操作。
注意 2：起始细胞数量为 3 × 107 个单个核细胞（MNCs）。请勿超过此细胞数量，否则分离柱可能发生堵塞，从而降低分离效率。若需处理更多细胞，请使用更大的分离柱。本方案中所用体积已针对我们实验设置中的细胞数量进行过实验优化。
- 配制分离缓冲液 [PBS (pH 7.2)，0.5% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 2 mM EDTA]。将分离缓冲液通过 0.45 µm 滤器过滤，并于 4 °C 保存。
- 将单个核细胞（MNCs）悬液（步骤 1.14）在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。将所得细胞沉淀重悬于 240 µl（每 107 个细胞 80 µl）预冷的分离缓冲液中。将细胞悬液转移至无菌的 2 ml 离心管中。
- 向细胞悬液中加入 20 µl CD3 磁性抗体。在 4 °C 下孵育 1 小时，期间持续轻柔混匀以保持细胞悬浮状态。
- 将全部细胞悬液转移至含有 5 ml 预冷分离缓冲液的 15 ml 离心管中，以洗涤细胞。
- 在 4 °C 下使用水平转子以 300 × g 离心 10 分钟。
- 同时准备磁力分选装置和分选柱。将磁力分选器固定在支架上，并将分选柱插入分选器中。用 500 µl 预冷的分离缓冲液冲洗分选柱，弃去穿流液。
- 在分选柱下方放置一个新的 15 ml 收集管。将收集管置于冰上保存。
- 用移液器吸弃上清液（步骤 3.5），并轻轻将细胞沉淀重悬于 500 μl 分离缓冲液中。将细胞悬液加至预冲洗的分选柱顶部，使其自然流过。
注意：细胞团块可能堵塞分选柱，从而降低流速。为避免此问题，可在分选柱顶部放置一个 40 µm 的塑料细胞筛网。细胞通过该筛网可显著提高本方法的分选效率。 - 用 1.5 ml 分离缓冲液（每 107 个细胞 500 µl）洗涤分选柱 4 次。每次加样前需等待柱内储液完全流尽（柱内无可见液体）后再进行下一次洗涤。
注意：CD3 未标记的细胞即为 B 淋巴细胞组分，随穿流液进入收集管中，可在此步骤收集。 - 将分选柱从磁力分选器上取下，放入一个新的 15 ml 收集管中。用移液器向柱中加入 2 ml 分离缓冲液。使用随柱附带的推杆将正向选择的 T 淋巴细胞洗脱下来，此部分即为 T 淋巴细胞组分。
- 如有需要，测定纯化后细胞的数量（步骤 1.15）。此时细胞悬液已准备好用于后续实验。
4. 分离的扁桃体B淋巴细胞和T淋巴细胞的流式细胞术分析
警告：多聚甲醛溶液具有刺激性，且可能具有致癌性。操作时应穿戴适当的防护服、手套及眼睛/面部防护装备。
注1：本方案描述了通过荧光激活细胞分选（FACS）分析对分离的B细胞和T细胞进行直接染色的方法。此步骤的主要目的是在CD3磁性抗体分离后，评估所获得细胞群体的纯度。为此，使用已确立的B细胞和T细胞标志物，即荧光素偶联的单克隆抗体CD20-FITC和CD2-APC。同时强烈建议使用同型对照抗体，以区分CD2和CD20抗体的非特异性“背景”结合（见步骤4.8）。
注意 2：可在 4 °C 避光条件下，将纯化的细胞组分保存于 1% 多聚甲醛（PFA）溶液中，直至染色时使用（例如，第二天）。如果染色与流式细胞术分析之间存在时间间隔，也可采用相同的步骤。请注意，无论哪种情况，在染色或流式细胞术分析前，细胞均需用 PBSA 缓冲液（含 0.2% BSA 的 PBS）充分洗涤。
- 取出 6 x 106 来自步骤1.15的单个核细胞（MNCs）细胞（上柱前）、步骤3.9的B淋巴细胞组分以及步骤3.10的T淋巴细胞组分。
- 使用摆动转子在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟。
- 用移液器吸除上清液，并用 1 ml 冰冷的 PBSA 洗涤细胞沉淀一次。将细胞悬液在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。用移液器吸除上清液，重悬细胞沉淀 600 µl 冰冷的 PBSA 缓冲液中的细胞
- 向流式管底部加入100 µl细胞悬液。
- 向每根试管中加入含有10%热灭活人血清的100 µl PBS，充分混匀，室温孵育约1分钟，或冰上孵育20分钟。
注意: B 淋巴细胞表达 Fc 受体。为阻断 Fc 受体，将纯化的细胞组分与 10% 经热灭活的人血清孵育。人血清通过在 56 °C 孵育 1 小时进行热灭活。将热灭活后的血清分装为小份，于 -20 °C 冷冻保存。 - 在4 °C条件下，使用水平转子以300 × g离心5分钟。
- 用移液器吸除上清液，并用 1 ml PBSA 洗涤细胞沉淀。再次离心（300 × g，4 °C，5 分钟）。
- 向每支冰上的试管中加入 100 µl PBSA。根据制造商的建议，加入适量的荧光素标记单克隆抗体（例如， 在100 µl PBSA中加入20 µl抗CD20抗体和/或5 µl抗CD2抗体。注意：务必为FACS分析预留足够数量的对照管。本方案中应包括以下对照：1）分别单独使用抗CD2抗体和抗CD20抗体染色的细胞；2）分别单独使用抗CD2同型对照抗体和抗CD20同型对照抗体染色的细胞；3）未添加任何抗体的细胞。
- 短暂涡旋混匀试管，并在4 °C避光孵育30分钟。
- 用 PBSA 洗涤 2 次。向样品中加入 2 ml 1% PFA 溶液。将细胞置于 4 °C 避光保存，直至进行 FACS 分析。
- 在使用流式细胞仪上机检测样品前，用 PBSA 将细胞洗涤 2 次（4 °C 下 300 × g 离心 5 分钟）。将样品重悬于 1 ml PBS 中，置于 4 °C（或冰上）避光保存，待流式细胞仪分选前使用。
- 按照流式细胞仪制造商提供的方案进行FACS分选。
5. 在分离的扁桃体B和T淋巴细胞中通过PCR检测腺病毒DNA
注1：腺病毒六邻体（hexon）基因引物为AdRJC1（5’-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3’）和AdRJC2（5’-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3’）11。这些引物可扩增出139 bp的产物。宿主18S rRNA基因可使用引物tp206（5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3’）和tp207（5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3’）进行检测，预期扩增产物大小为300 bp。
注意 2：每次 PCR 实验均需包含阴性对照（蒸馏水 H2O）和阳性 DNA 对照，阳性对照来自感染人 5 型腺病毒的人类 B 细胞系（BJAB）12。
- 使用基于硅胶膜柱纯化法提取DNA（来自至少1 x 106 个细胞，步骤3.11）。使用苯酚和异硫氰酸胍溶液提取RNA13。
- 将100 ng来自B淋巴细胞和T淋巴细胞的DNA加入反应体系中，反应体系总体积为20 µl，包含1x HF缓冲液、0.2 mM脱氧核苷三磷酸混合物（dNTP）、每种引物0.25 µM以及1 U高保真DNA聚合酶。
- 按以下循环条件进行PCR扩增：98 °C变性30秒，随后进行30个循环，每个循环包括98 °C 10秒、67 °C（六邻体基因）或58 °C（18S rRNA）退火30秒，以及72 °C延伸30秒。最后在72 °C延伸7分钟以完成PCR反应。
- 将PCR扩增产物在含1x TBE缓冲液的1.5%琼脂糖凝胶中电泳分离 ，并通过核酸染料染色观察预期的条带。
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结果
高效分离扁桃体单个核细胞（MNCs）可获得高度纯化的B淋巴细胞和T淋巴细胞亚群。该结果通过流式细胞术分析得到证实，分别使用抗CD20和抗CD2抗体检测B淋巴细胞和T淋巴细胞群体（图3A）。相比之下，低效的MNCs分离则导致细胞组分中混杂了B淋巴细胞和T淋巴细胞两个亚群的细胞（图3B）。
分离得到的扁桃体B细胞和T细胞（图3A）具有足够质量，可用于后续分析，如核酸提取。在本方案中，从B细胞和T细胞中提取的DNA和RNA分别用于检测腺病毒DNA和细胞RNA。结果显示，腺病毒DNA在扁桃体T细胞中被特异性检出（图4）。此外，从扁桃体B细胞和T细胞中分离的RNA在质量和数量上均满足后续实验应用的要求（图5）。
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讨论
影响本实验方案结果的最重要因素之一是使用新鲜的扁桃体组织作为起始材料。因此，扁桃体样本应在手术后3小时内进行处理。扁桃体组织可来自成人或儿童。由于儿童通常接受部分扁桃体切除术（扁桃体切开术），其扁桃体组织通常较小。因此，从扁桃体切开术样本中获得的单个核细胞（MNC）数量（1 × 107–1 × 108）少于扁桃体全切除术样本（1 × 108–2 × 109）。然而，无论手术类型如何，细胞分离过程均相同。
为获得磁性激活细胞分选法中高纯度的细胞亚群，需对实验条件进行优化。CD3磁性抗体的用量与孵育时间，以及上样至分选柱的单个核细胞（MNC）数量是需要优化的主要因素。上样细胞过多会导致分选柱堵塞，从而降低细胞亚群的富集效率。在本方案的优化过程中，我们发现当上样至分离柱的MNC数量超过3 × 107时，会导致柱子堵塞，并产生不纯的细胞组分（图3B）。因此，以3 × 107 MNC为起始细胞量，可获得质量与数量均足以用于DNA...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了瑞典癌症协会（11 0253，13 0469）、瑞典研究理事会（K2012-99X-21959-01-3）、马库斯·博尔格斯特伦基金会以及瑞典研究理事会通过资助乌普萨拉RNA研究中心（2006-5038-36531-16）提供的支持。我们非常感谢乌普萨拉大学BioVis核心设施在FACS分析方面给予的大力帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 汉克斯平衡盐溶液（HBSS） | Gibco | 14175-053 | 含5%胎牛血清（FBS）、10 mM 谷氨酰胺 、0.05 mg/ml 庆大霉素及1% 抗生素-抗真菌素混合液 |
| 冻存液 | 90% FBS 和 10% DMSO | ||
| MACS 缓冲液 | PBS（pH 7.2）、0.5% BSA 和 2 mM EDTA | ||
| PBSA | 含0.2% BSA 的 PBS | ||
| PFA | 含1% 多聚甲醛（PFA）的 PBS。现配现用。PFA 为疑似致癌物，操作时需佩戴手套和护目镜。 | ||
| 抗生素-抗真菌素混合液 | Gibco | 15240-062 | |
| 60 mm 培养皿 | Nunc | 150326 | |
| 解剖镊 | Fisher Scientific | 1381241 | |
| 直剪虹膜剪 | Fisher Scientific | 12912055 | |
| 一次性手术刀片 | Swann-Morton | REF 0501 | |
| 100 μm 塑料细胞滤网 | Corning Life Sciences | 352360 | |
| 40 μm 塑料细胞滤网 | Corning Life Sciences | 352340 | |
| 2 ml 塑料注射器 | BD Biosciences | 300185 | |
| 15 ml 锥形离心管 | SARSTEDT | 62554502 | |
| 50 ml 锥形离心管 | SARSTEDT | 62547254 | |
| 带固定角或摆动桶转子的低速离心机 | Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R | ||
| Ficoll–Hypaque | Sigma-Aldrich | F5415-50ML | Ficoll 溶液 |
| 胎牛血清 | Biological industries | 040071A | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | SIGMA | D2650-5X5ML | |
| MACS MS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MACS 人 CD3 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-092-881 | |
| MACS 分离器（Octo MACS） | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Merck Millipore | 1120180100 | |
| EDTA | AnalaR NORMAPUR | 20302.293 | |
| 与别藻蓝蛋白偶联的 CD2（CD2-APC） | BD Biosciences | 560642 | |
| 与异硫氰酸荧光素偶联的 CD20（CD20-FITC） | BD Biosciences | 556632 | |
| 人血清 | Rockland Immunochemicals | D119-0100 | |
| Phusion 高保真 DNA 聚合酶 | Thermo Scientific | F-530L | |
| FACS 管 | BD Falcon | 352003 | |
| 冻存管 | SARSTEDT | 72379 | |
| BD LSRII 流式细胞仪 | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 4.1 软件 | BD Biosciences | ||
| Nucleospin 血液 | Macherey-Nagel | 740951.50 | DNA 提取试剂盒 |
| TRIzol 试剂 | Life technologies | 15596 | RNA 提取试剂 |
| 血细胞计数板 | The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 0610030 | 细胞计数装置 |
| GelRed | Biotium | 41003 | 核酸凝胶染料 |
参考文献
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