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通过液滴融合测量磷脂单分子层二维扩散的荧光恢复实验

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DOI：

10.3791/53376

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2015年10月15日

 ,  ,  , 
1Department of Bio and Brain Engineering, KAIST, 2Information and Electrical Research Institute, KAIST

本文内容

摘要

我们提出一种新技术，通过将液滴单层与平面单层合并，来测量表面活性物质在流体-流体界面的侧向扩散。

摘要

我们介绍一种测量流体-流体界面表面活性剂单分子层侧向扩散系数的新方法，称为合并后荧光恢复法（fluorescence recovery after merging, FRAM）。FRAM 采用了与光漂白后荧光恢复技术（fluorescence recovery after photobleaching, FRAP）相同的基本原理，特别是通过测量特定区域漂白后的荧光恢复情况来实现，但 FRAM 利用液滴聚并而非光漂白染料分子来诱导染料分子的化学势梯度。我们的技术相较于 FRAP 具有多个优势：仅需一台荧光显微镜，而无需配备高功率激光器的共聚焦显微镜；几乎不受荧光染料选择的限制；并且在定义测量扩散区域方面具有更大的灵活性。此外，当液滴表面的单分子层与平面气/水界面的单分子层分别由不同种类的表面活性剂独立制备时，FRAM 还有望用于研究两种不同表面活性剂之间的混合或相互扩散过程。

引言

磷脂是细胞膜和细胞器膜的主要成分，这些膜层的流动性常通过改变膜蛋白的活性来影响细胞功能1–3例如，膜 脂质 稳态 通过调节膜流动性实现，膜流动性由膜蛋白检测，流动性异常可导致严重疾病，如肝脂肪变性和胆汁淤积4此外，肺泡气-液界面处磷脂单分子层的流动性对其功能具有重要意义。肺表面活性物质磷脂单分子层的高流动性有利于吸气过程中单层膜的铺展，而低流动性则有助于呼气时该层保留在肺泡内。5,6因此，估算磷脂层的流动性对于理解其功能至关重要。

流体性的直接度量是黏度，已有研究利用微米级胶体7、磁性针8,9和磁性微按钮6,10,11测量磷脂层的黏度。然而，这些技术仅限于相对刚性的薄膜，无法测量黏度较低的薄膜。对于此类情况，扩散系数可作为量化磷脂层流体性的替代指标。几十年来，已发展出多种测量磷脂层扩散特性的技术，例如荧光猝灭法12、脉冲场梯度核磁共振13和荧光相关光谱（FCS）14。其中最具代表性的方法之一是光漂白后荧光恢复（FRAP）15,16。由于其测量过程及相关理论较为简便，已有大量研究采用FRAP技术研究磷脂层的扩散特性17–19。然而，FRAP通常需要配备高功率激光器的昂贵共聚焦显微镜系统。

本文介绍一种测量磷脂单分子层侧向扩散的新技术，称为合并后荧光恢复法（fluorescence recovery after merging, FRAM）。FRAM 与荧光漂白恢复法（FRAP）的关键区别在于，用液滴融合取代了光漂白步骤。将一个覆盖有非荧光单分子层的液滴与一个荧光标记的平面单分子层合并，会在明亮的平面单分子层上留下一个圆形暗斑，从而实现与光漂白步骤相同的初始状态。随后，我们观察暗斑内荧光随时间的恢复情况，以测定侧向扩散系数。这种通过液滴融合实现的新“漂白”步骤相较于 FRAP 具有显著优势：FRAM 仅需使用荧光显微镜，而无需 FRAP 所必需的昂贵共聚焦显微镜和高功率激光器。此外，由于不涉及光漂白过程，FRAM 可选择的荧光染料范围更广。最后，液滴单分子层和平面单分子层可独立制备，从而能够测量两种单分子层之间的互扩散；而 FRAP 仅能测量单分子层的自扩散。

FRAM 可对从高黏性材料到几乎无黏性材料的广泛范围进行扩散测量。理论上，当扩散在液滴聚并过程的时间内（约 10 毫秒）跨越 100 µm × 100 µm 的区域时，FRAM 可测量的最大扩散系数可达 106 µm2/sec，与现有技术相当。此外，只要单分子层未形成固体状态，缓慢的扩散过程也可被轻松测量。只要有合适的荧光标记分子，FRAM 即可用于各种表面活性物质。

方案

注意：使用具有致癌性的丙酮和氯仿前，请参阅材料安全数据表（MSDS）。

1. 平面气-水界面磷脂单分子层的制备

  1. 形成磷脂单分子层
    1. 磷脂溶液的制备
      1. 使用丙酮、乙醇和去离子水至少清洗一次带聚四氟乙烯涂层盖子的 4 ml 小瓶三次，并向小瓶中充分吹入氮气以去除水分。
      2. 将 1 mg 磷脂（例如，二油酰基磷脂酰胆碱，DOPC）溶解于小瓶中的 1 ml 氯仿中，得到浓度为 1 mg/ml 的溶液。此操作应在通风橱中进行以确保安全。根据需要可使用更低或更高的磷脂溶液浓度。
      3. 加入摩尔分数低于 1% 的荧光标记磷脂（例如，罗丹明二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，Rhodamine DPPE），以便通过荧光显微镜观察磷脂单分子层。此操作应在通风橱中进行以确保安全。
      4. 用聚四氟乙烯胶带包裹小瓶以防止溶剂挥发，并将样品在 -20 °C 冰箱中保存。
    2. 将磷脂沉积到气-水界面
      1. 用乙醇和去离子水至少清洗一次直径为 55 mm、高度为 12 mm 的培养皿三次。
      2. 向培养皿中加入 10 ml 去离子水，以形成气-水界面。
      3. 使用微量注射器将数微升磷脂溶液滴加到洁净的气-水界面上，以达到所需的表面压力，并在实验开始前至少等待 30 分钟，使溶剂完全挥发。
        注意：若需精确控制表面压力，可使用朗缪尔槽代替培养皿。
  2. 表面压力测量
    1. 使用威尔赫尔米板张力计测量磷脂单分子层的表面压力。若使用滤纸作为威尔赫尔米板，需至少等待 30 分钟，使滤纸充分润湿。详细方案可参见 Kuhn 等20。
    2. 通过调节磷脂的沉积量来精确控制表面压力。若需要约 5 mN/m 的表面压力，可在面积为 30.25 cm2 的界面上滴加 4 µl 的 DOPC 溶液（1 mg/ml）。
      注意：若滤纸未完全润湿，实验开始后的前 30 分钟内，由于滤纸重量变化，表面压力会发生剧烈波动。
  3. 最小化单分子层的对流流动
    1. 使用一个锥形装置，该装置包含一个 3 mm 的储液池和两条细通道，连接至培养皿的大面积区域，以抑制可能干扰形貌成像和表面压力测量的单分子层对流流动。
    2. 在将磷脂沉积到气-水界面之前，务必确保锥形装置内外的水位一致，以保证磷脂分子在整个区域自由移动。

2. 在液滴曲面制备磷脂单分子层

  1. 使用微电极拉制仪对玻璃毛细管进行拉尖处理
    1. 将一根玻璃毛细管（外径 1 mm，内径 0.78 mm，长度 100 mm）放置于微电极拉制仪的毛细管夹持器上。
    2. 设计一个拉制程序，设置合适的参数值（加热：斜坡，拉力：60，速度：70，延迟：70，压力：200），并根据制造商的操作说明使用该程序拉制毛细管。
      注意：为了通过施加约 10 kPa 的压力形成直径为 100 µm 的液滴，毛细管末端的直径需为几微米。若毛细管尖端过小，则需要更高的压力（> 600 kPa）才能形成液滴；而若尖端过大，则难以控制液滴的尺寸。
  2. 磷脂在液滴表面的吸附
    注意：为了在液滴的弯曲界面上形成磷脂单分子层，此处使用不含荧光标记磷脂的磷脂溶液，以便与通过步骤 1 制备的平面单分子层进行荧光强度对比。此外，以下两种方法（2.2.1 和 2.2.2）均可采用。若需精确控制液滴表面的表面压，强烈推荐使用步骤 2.2.2；否则，可采用操作更简便的步骤 2.2.1。
    1. 在毛细管尖端进行磷脂涂层处理
      1. 使用丙酮、乙醇和去离子水至少各清洗载玻片三次。
      2. 将拉尖后的毛细管置于已清洗的载玻片上，并倾斜毛细管，使其尖端能够接触载玻片表面。
      3. 使用玻璃注射器将数滴磷脂溶液（1 mg/ml）滴加至粘附在载玻片上的毛细管尖端，并静置至少 30 分钟，使溶剂完全挥发。
        注意：在步骤 2.2.1.3 中，强烈建议将毛细管尖端粘附于载玻片上，因为仅靠毛细作用力难以在过小的尖端周长上稳定维持磷脂液滴。
    2. 制备囊泡溶液
      1. 清洗一个样品瓶，并按照步骤 1.1.1.1 的方法去除其中的水分。
      2. 用氮气轻轻吹干 2 ml 磷脂溶液（1 mg/ml），然后在室温下干燥样品瓶 1 小时，以彻底去除残留溶剂。此操作应在通风橱中进行以确保安全。
      3. 向含有干燥脂质的样品瓶中加入 2 ml 去离子水，并将样品瓶置于 60 °C 的烘箱中孵育 1 小时。
      4. 多次振荡样品瓶，并进行超声处理（高频：最高 40 kHz，功率：370 W）30 分钟，以形成囊泡。
      5. 通过挤出法和冻融循环处理获得单分散的单层囊泡。囊泡制备的详细方案见 Mayer et al.21。
        注意：通过调节含有单分散单层囊泡的液滴形成后的静置时间，可精确控制液滴界面的表面压。在开展实验前，需采用悬滴法22测量表面压随时间的变化。
  3. 在具有弯曲表面的液滴中形成含磷脂单分子层的液滴
    1. 从步骤 2.2.1 中取 10 µl 去离子水注入拉尖后的毛细管中；或者，使用步骤 2.2.2 中制备的 10 µl 囊泡溶液。
    2. 将毛细管连接至自动微注射仪，以提供形成液滴所需的压力。
    3. 将连接微注射仪的毛细管安装至显微操作器上，以便精确控制其位置。
    4. 准备一台明场显微镜（显微镜 1，物镜：10X NA 0.3），配合 CCD 相机用于观察毛细管的侧视图像。显微镜 1 可用于精确判断液滴沿 z 轴的位置，并估算液滴的尺寸。
    5. 使用显微操作器将毛细管尖端移动至显微镜 1 可清晰观察其侧视图像的位置，施加可变压力（约 100 hPa），直至形成适当大小（直径约 100 µm）的液滴。
      注意：若需对液滴尺寸和位置进行精细调控，建议使用自动微注射仪和显微操作器；手动设备亦可使用。

3. 液滴融合后荧光恢复成像

注意：本实验方案的基本原理与FRAP技术相同，仅在液滴融合过程上存在差异。FRAP的详细实验方案及相关理论可参见A. Lopez et al.15 和 D. Axelrod et al.16。

  1. 监测并控制液滴的位置
    1. 准备一台倒置显微镜系统（显微镜2，物镜：10X NA 0.3，管镜：焦距17 cm），该系统需配备适用于罗丹明标记的DPPE（Rhodamine-DPPEs）的荧光滤光片组（激发波长560 nm，发射波长583 nm），并同时支持荧光显微镜和明场显微镜模式。使用CCD相机，通过荧光显微模式和明场显微模式观察液滴的俯视图像。
    2. 利用显微操作器，将包被有磷脂的液滴沿z轴方向移动至平坦的气-水界面处，但暂不使其融合。使用显微镜1观察液滴的侧视图像。
    3. 利用显微操作器，将液滴定位在平坦单层膜俯视图像的中心位置。使用显微镜2的明场显微模式观察平坦单层膜的俯视图像。
  2. 将液滴融合至平坦气-水界面
    1. 继续利用显微操作器将液滴向平坦界面推进，直至液滴与界面融合。若融合成功，则可通过显微镜2的荧光模式观察到一个呈圆形的暗区，周围被亮白色背景包围。
    2. 在液滴融合后，使用显微镜2的荧光模式按时间序列记录荧光图像。此处应采用比单层膜扩散时间尺度更快的帧率。在DOPC单层膜中，完全扩散至200 µm的暗区需要数分钟时间。

4. 通过图像分析测定扩散系数

注意：为了从一系列图像中确定扩散系数，需按照下文所述构建用于图像分析的自定义程序。该程序的详细源代码可在 JoVE 网站获取。

  1. 检测圆形感兴趣区域
    1. 检测感兴趣区域的中心
      1. 获取在恢复过程中记录的一系列荧光图像，该系列图像包含一个圆形暗区和白色背景，并将该系列的第一幅图像设为参考图像。此处，RD 是参考图像中暗区的半径。
      2. 将参考图像与一个强度在整个区域内均匀的白色圆形进行卷积。使用自定义程序第124行源代码中所示的名为“conv2”的内置函数进行卷积运算。此处，白色圆形的半径略小于RD.
      3. 找到卷积计算中指示最小值的位置，并将该位置设为参考图像中感兴趣区域的中心。
    2. 确定感兴趣区域的半径
      1. 用一个白色圆形对参考图像进行卷积，该圆形包含由步骤4.1确定的中心位置，且在整个区域内具有均匀强度。此处，RS 是白色圆圈的半径。使用“for”或“while”等循环结构，结合圆的方程，在自定义程序的源代码第102至109行中实现如图所示的白色圆圈。
      2. 将参考图像与另一个半径略大（5%–10%）的白色圆形进行卷积运算，记为 RL，高于 RS. 采用与步骤 4.1.2.1 相同的方法，按照自定义程序第 113 至 120 行的源代码所示绘制圆形。
      3. 获取 4.1.2.1 和 4.1.2.2 中两次卷积计算的数值差值。
      4. 重复上述 R 以后的步骤S = RD/2 到 RS = 2RD，通过同时提高 RS 和 RL 以像素级别进行操作。创建一个迭代过程，包含从步骤 4.1.2.1 到 4.1.2.3 的全部源代码，并重复执行。
      5. 找到 R 的半径S 表示两次卷积计算之间的最大差值。使用名为“max”的内置函数，找出对应最大差值的半径，如自定义程序第148至149行源代码所示。该RS 因此表示参考图像中暗区的半径。
  2. 分数强度的计算
    1. 将由步骤4.1确定的包含中心位置和半径的圆形区域设为感兴趣区域。
    2. 根据时间序列计算一系列荧光图像中感兴趣区域的平均强度。将每一帧图像与感兴趣区域进行卷积，再除以感兴趣区域的面积，以计算平均强度。相关细节详见 JoVE 网站上提供的自定义程序的源代码。
    3. 计算一个分数强度，定义如下式所示，其中 F(t) 是随时间变化的兴趣区域（圆形）内的平均强度，Fi 是圆圈内的初始强度，而 Fo 是白色背景的强度。
      f(t) = (F(t) – Fi)/(Fo – Fi)      （公式 1）
  3. 将荧光恢复比例拟合到FRAP理论
    1. 使用以下公式对分数强度进行拟合，其中 τ 为特征扩散时间，I0，I1 是经修正的贝塞尔函数，通过使用拟合程序，获得τ
      Exponential decay equation, f(t)=Ce^(-2πt/τ), with Bessel functions I₀ and I₁.      （公式 2）
    2. 根据以下关系式获得扩散系数， τ = a2/4D，其中 D 为扩散系数，a 为暗区半径。
      注意：在拟合过程中，如果在记录图像之前恢复过程已经开始，可以沿时间轴移动分数强度曲线。

结果

将带有DOPC单层膜的液滴与平坦的DOPC单层膜融合后，在恢复过程中随时间获得了一系列荧光图像，如图1所示。位于平坦气-水界面的DOPC单层膜中掺入了少量罗丹明-DPPE，从而可使背景呈现亮色，而新加入平坦界面的区域则表现为暗区。实验在23 mN/m的恒定表面压力下观察到了恢复过程。图2展示了将公式1拟合至随时间变化的相对荧光强度变化的结果。该拟合的R2值为0.999，即使在较低或较高的表面压力下，该拟合仍表现良好。根据此拟合得到的DOPC单层膜在23 mN/m表面压力下的扩散系数为27.54 µm2/sec。

为进一步验证FRAM，根据表面压力测定了DOPC和二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）单分子层的扩散系数。如图所示 图3FRAM 捕获了 DPPC 单层膜在约 9 mN/m 表面压力下扩散系数的快速下降，该处发生 LC（液晶凝聚相）– LE（液相扩张相）相变10，且扩散系数的数值也与Peters先前的测量结果高度一致 等19此外，在DOPC单分子层中观察到扩散系数随表面压力呈指数衰减，这一趋势与Caruso测得的结果几乎一致 等.12.

脂单层实验；荧光标记过程；示意图，时间推移显微镜结果。
图1. (A) FRAM（合并后荧光恢复）技术的示意图。当包被脂单层的液滴与平坦的气-水界面合并时，未标记荧光的脂单层插入到平坦的荧光标记脂单层中。（B）在23 mN/m表面压力下DOPC单层恢复过程中随时间变化的荧光显微镜图像（比例尺 = 100 µm）。DOPC单层的暗区在数分钟内通过扩散过程完全恢复。请点击此处查看该图的放大版本。

分数强度图；随时间变化的数据曲线，显示80秒内的融合过程结果。
图 2. 分数强度随时间变化。黑色圆点和灰色虚线分别表示通过图像分析（步骤 4.1 和 4.2）获得的分数强度值，以及将方程 1 拟合到分数强度随时间变化的结果（见步骤 4.3）。 请点击此处查看该图的放大版本。

扩散系数与表面压强关系图；DPPC、DOPC分析；科学数据可视化。
图3. DOPC（三角形）和DPPC（空心方块）单分子层的扩散系数随表面压强的变化关系。亮灰色和深灰色的线条分别表示Peters et al. 和Caruso et al. 早前报道的扩散系数数值。本图改编自Jeong et al.23。经美国化学会许可转载自Jeong et al. Langmuir. 30(48), 14369-14374。版权所有 2014年。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

FRAM 与 FRAP 在许多基本原理上相似，尤其是通过漂白特定区域后测量荧光恢复情况，但 FRAM 采用将液滴融合到平界面以形成漂白区域的方法，而非使用高强度光照。因此，融合过程是 FRAM 中最关键的步骤，特别是液滴融合后在平坦单层膜上形成的暗斑形状，直接影响扩散系数测量的准确性。具体而言，根据现有方法，我们仅将半径为 R 的圆形区域设为感兴趣区域，用于计算暗斑的平均强度（见步骤 4）。如果暗斑形状偏离圆形过多，则会干扰扩散系数的精确测量。因此，获得圆形暗区十分必要，但有时会因多种原因形成非圆形形状。首先，若培养皿中存在对流流动，暗区会沿流动方向被拉长。如步骤 1.3 所述，锥形装置有助于抑制对流，从而最大限度减少这种拉长现象。其次，若毛细管尖端在融合过程中接触到了平面界面，毛细管末端会干扰融合过程，导致暗区呈现多种不规则形状。通过使液滴仅悬挂在毛细管最末端，可避免此类干扰。特别是对毛细管进行疏水处理，有助于液滴稳定地位于毛细管末端。因此，上述故障排查与改进措施能够帮助我们更精确地测量扩散特性。

因此，这一经过充分排查问题的流程使FRAM相较于FRAP具有多个显著优势。首先，与FRAP相比，FRAM所需的设备更为简单。对于FRAM，仅需使用一台普通的荧光显微镜即可，而无需使用昂贵的共聚焦显微镜以及波长必须与染料吸收光谱匹配的高功率激光器。此外，在FRAP中需要额外装置来调节漂白区域的大小，而FRAM则可通过调节液滴尺寸或液滴表面的表面压力，轻松控制区域大小。其次，FRAM可以使用多种类型的染料。FRAP仅能使用漂白过程远快于扩散过程的染料分子；若在漂白过程中发生染料扩散，则难以准确估算其扩散特性。然而，FRAM无需染料漂白过程，因此可在荧光成像中使用多种类型的染料。此外，更换FRAP中的染料种类需要额外的高功率激光器和滤光片组，而在FRAM中仅需更换滤光片组即可。最后，由于液滴表面和扁平界面的单分子层可独立形成，因此可通过将A型单分子层与B型单分子层合并，研究两种不同脂质单分子层之间的相互扩散或混合过程，而FRAP仅能测量单分子层的自扩散。

尽管具有这些优势，但由于可能存在若干问题，液滴与平坦气-水界面的合并过程可能会限制该技术的应用，这些问题包括两个单分子层之间的表面压力不匹配、合并过程的时间尺度，以及液滴合并后平坦单分子层表面压力的升高。然而，由于以下原因，这些问题并不会显著影响扩散测量结果。首先，即使两个不同单分子层的表面压力存在较大差异，在恢复过程的早期阶段即可完成平衡。例如，若液滴表面单分子层的表面压力高于平坦气-水界面单分子层的表面压力，则暗区会扩展，直至表面压力达到平衡。由于该过程在10毫秒内即已完成，因此在显著影响扩散过程之前，表面压力早已平衡。其次，若合并过程的时间尺度足够快，则完全不会限制扩散测量。幸运的是，典型的合并过程同样在10毫秒内完成。最后，即使多次将液滴合并到平坦界面上，也不会导致表面压力升高，因为槽的表面积远大于液滴的表面积。根据本实验方案中所述的槽和液滴尺寸，合并一个液滴所导致的每个分子所占面积的增加不足0.015%。因此，由于每个分子所占面积变化引起的表面压力升高小于0.1%，这一变化可忽略不计，因其远小于使用威尔赫尔米（Wilhelmy）板张力计测量表面压力时的典型误差。

综上所述，我们介绍了一种通过将液滴单层合并到平界面来测量磷脂单层侧向扩散性质的新方法。该技术所需的设备相对简单，同时能够使用多种类型的染料。因此，FRAM 有望适用于在流体-流体界面上对任何表面活性剂（包括磷脂、嵌段共聚物、蛋白质甚至纳米颗粒）的扩散进行测量。此外，我们预计 FRAM 还将为研究两种不同表面活性剂之间的相互扩散或混合提供一种新途径。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作由2014年KAIST资助的K-Valley RED&B项目以及韩国国家研究基金会基础科学研究中心项目（NRF-2012R1A6A3A040395、NRF-2013R1A1A2057708、NRF-2012R1A1A1011023）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙酮OCI corporation丙酮 3.8L 超纯级纯度：≥ 99.5%，使用前请查阅材料安全数据表（MSDS）。
乙醇OCI corporation乙醇 3.8L 超纯级纯度：≥ 94%，使用前请查阅材料安全数据表（MSDS）。
二油酰基磷脂酰胆碱（DOPC）Avanti Polar Lipids850375C使用前请查阅材料安全数据表（MSDS）。氯仿具有致癌性。
氯仿LiChrosolv超纯氯仿（A3633）纯度：≥ 99.8%，使用前请查阅材料安全数据表（MSDS）。具有致癌性
罗丹明 DPPEAvanti Polar Lipids810158C, 810158P避免直接光照以防止光漂白
威尔赫尔米（Wilhelmy）板张力计R&K ultrathin organic film technologyWilhelmy 张力计http://www.rieglerkirstein.de/index.htm
微量移液器拉制仪Sutter instrumentP-1000
显微注射仪EppendorfFemtojet
显微操作器EppendorfMicromanipulator 5171
显微镜 1物镜：Olympus物镜：UPlanFl 10x物镜：10X NA 0.3
显微镜 2物镜：Olympus，管镜：Thorlabs物镜：UPlanFl 10x物镜：10X NA 0.3，管镜：焦距 17 cm
显微镜 1 用 CCDJaiCV 950 相机
显微镜 2 用 CCDAndoriXon3 EMCCD
滤光片组Chroma technology目录号 49004：ET545, T565, ET605根据染料分子选择合适的滤光片组
超声破碎仪DAIHAN ScientificWiseclean WUC-D06H

参考文献

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