从大鼠睾丸中分离支持细胞和管周细胞

摘要

研究睾丸免疫特权、炎症或感染过程中的信号转导以及利用其免疫保护特性需要使用原代支持细胞。本文介绍一种基于酶消化的方法，用于从大鼠睾丸中分离高纯度的原代支持细胞和管周细胞。

摘要

睾丸，尤其是雄性配子，以一种独特的方式挑战免疫系统，因为分化的精子在青春期才首次出现，这比全身性免疫耐受的建立晚了十多年。生精细胞表达多种可能被免疫系统识别为“非己”的蛋白质。因此，睾丸必须一方面能够对这些新抗原建立免疫耐受，另一方面仍需具备抵御感染和肿瘤发生的能力。因此，睾丸是体内少数几个免疫豁免部位之一，能够在不引发有害炎症免疫反应的情况下耐受外来抗原。支持细胞（Sertoli细胞）在维持睾丸免疫豁免微环境中起关键作用，并可延长共移植细胞在异体环境中的存活时间。因此，原代Sertoli细胞是研究睾丸免疫豁免特性的重要工具，这种作用难以被已建立的细胞系或其他细胞模型轻易替代。本文提供了一种详细且全面的实验方案，可在一天内从大鼠睾丸中分离获得Sertoli细胞——如需要，也可同时分离管周细胞。

引言

睾丸产生雄性配子和性激素， 即， 雄激素。该器官由两个区室组成。间质区室约占睾丸总体积的10-12%¹，类固醇生成发生在Leydig细胞内。管状 compartment 约占睾丸体积的60-80%¹ 并包含生殖细胞以及两种体细胞——管周细胞和塞尔托利细胞。睾丸由结缔组织隔膜分割为250至300个小叶，每个小叶含有1至3条高度盘曲的生精小管。这些小管由基底膜、一层胶原蛋白以及环状排列的管周细胞包裹。图1A).

生精上皮位于基膜的管腔侧。支持细胞是贯穿整个生精上皮、从基膜延伸至管腔的大型长形细胞。它们与基膜紧密连接，并通过侧基底部位有序排列的紧密连接形成连续的细胞层，将生精上皮与间质隔离开来，构成血睾屏障。支持细胞具有显著的细胞质突起和分支结构，使其能够与特定物种特异但数量恒定的生精细胞建立紧密的形态和功能联系。二倍体的生精干细胞增殖并分化为精原细胞。

在减数分裂Ⅰ期间，会生成短暂存在的四倍体精母细胞，这些细胞在减数分裂Ⅱ中进一步发育为四个单倍体精子细胞。所有生殖细胞均通过细胞质桥相互连接，从而形成一个细胞网络。精子细胞成熟过程中的主要事件是大量细胞质被排出，形成残余体，这一过程称为精子形成（spermiogenesis）。残余体会被支持细胞（Sertoli cells）吞噬。随后，晚期精子细胞被释放到曲细精管腔内，并被运送至附睾....

方案

1. 动物伦理声明

此处描述的实验均按照德国吉森地方政府当局——吉森行政区政府（Regierungspräsidium Giessen）的指导原则进行，并符合德国实验动物饲养与使用的操作规范（许可编号：GI 20/23 Nr. A 31/2012）。

2. 培养基、酶溶液和动物的准备

1. 通过将1 g碘溶解于100 ml乙醇中，制备1%碘酒精溶液。
2. 制备2份500 ml不含Ca²⁺和Mg²⁺的Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS），每份分别添加7.5 ml D-葡萄糖（100 g/L）和5 ml 100倍浓缩的青霉素/链霉素储备液（终浓度为15 mg/ml D-葡萄糖、50 U/ml青霉素和50 µg/ml链霉素）。
3. 向1份500 ml Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基中加入5 ml 100倍浓缩的青霉素/链霉素储备液（终浓度为50 U/ml青霉素和50 µg/ml链霉素）。
4. 通过将25 mg胰蛋白酶和0.1 ml DNase I（1 mg/ml DNase I）加入9.9 ml PBS中，配制胰蛋白酶-DNase I溶液（终浓度为2.5 mg/ml胰蛋白酶和10 µg/ml DNase I）。
5. 将50 mg胰蛋白酶抑制剂溶解于5 ml PBS中，制备胰蛋白酶抑制剂A溶....

结果

该方法可从10个大鼠睾丸中分离得到约12 × 10⁷个支持细胞。在6孔板中每孔接种3 × 10⁶个细胞，因此在第7天可获得6至7块6孔板用于实验。胰蛋白酶-脱氧核糖核酸酶I消化是支持细胞分离过程中最关键的步骤。若此步消化过度，生精细胞与支持细胞的比例将显著升高并持续至实验结束。在培养的第3至6天，必须仔细洗去尽可能多的非贴壁或松散附着的生精细胞。作为连续4天频繁洗涤的替代方法，可在第3天采用低渗处理去除生精细胞²⁷。该方法的优点在于支持细胞的培养时间最短，从而可能比长期培养更好地保留支持细胞的特异性功能。

尽管透明质酸酶处理可去除大部分残留的管周细胞，但仍会有少量细胞存活。分离得到的支持细胞纯度为 >通过波形蛋白免疫标记可证明其达到95% （图5B）由于管周细胞具有较强的增殖潜能，因此必须在无血清条件下进行支持细胞培养。在含有10%血清的培养条件下.......

讨论

生精小管由管腔侧的一圈管周细胞层和基膜所包绕。支持细胞位于基膜上，通过相邻细胞间形成闭锁连接构建血睾屏障，并为生精上皮的结构排列提供支架。在生殖细胞发育的整个过程中，支持细胞与邻近的生精细胞保持着密切的接触，实现物理连接和细胞间通讯。因此，当采用本文所述方法分离支持细胞时，它们将失去与邻近管周细胞及生精细胞的密切接触。然而，这些细胞似乎仍保留了其许多典型特征。 体内 如激素反应性和标志基因表达，尽管存在时间依赖性且水平较低。

支持细胞在培养六天后会形成较大的中性脂滴。支持细胞的重要功能之一是吞噬退化的、凋亡的生殖细胞以及生殖细胞物质，例如所谓的残余体²⁹。已知残余体和来自伸长精子细胞的胞质体可黏附于分离的支持细胞并被其吞噬³⁰。由于在分离过程中无法完全去除所有生殖细胞，因此我们推测污染的生殖细胞在接种后也可能黏附于支持细胞并被吞噬。由于残余体含有小脂滴，因此可以合理推测，支持细胞在大量吞噬黏附和受损的生殖细胞后会获得较大的脂滴。此外，有证据表明，吞噬清除凋亡细胞可主动下调炎症和免疫反应³¹，这可能.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
肌动蛋白（平滑肌）抗体克隆 1A4	Dako	M0851	单克隆小鼠抗人抗体。 免疫荧光使用 1:100 稀释度。
牛血清白蛋白第五组分 标准级，冻干粉	Serva	11930.04	用于免疫荧光的滤膜（0.45 µm）过滤BSA溶液。
Corning 细胞筛 70 µm	Corning	431751	白色
来自 Clostridium histolyticum 的胶原酶A	Roche	10103586001
DAPI封片剂 ProLong Gold 抗荧光淬灭剂	Life technologies	P-36931
D-葡萄糖	Sigma	G8644	100 g/L
不含Ca´2+/Mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲液	Gibco	14190-094
脱氧核糖核酸酶I（DNase I）	Roche	10104159001
电子显微镜	Zeiss	EM 109S
荧光显微镜	Zeiss	Axioplan 2
来自牛睾丸的透明质酸酶	Sigma	H3506
倒置光学显微镜	Olympus	CKX41	常规细胞培养显微镜
小鼠IgG/IgM（H+L）多克隆 二抗	Life technologies	A-10684	Alexa Fluor 488偶联物
油红O	Sigma	O0625	因颜色更鲜艳，已取代苏丹III和苏丹IV。
多聚甲醛	Sigma	P6148
青霉素（5,000 U/ml）/ 链霉素（5,000 µg/ml）	Gibco	15070-063	100倍浓缩液
RPMI-1640	Gibco	21875-034	含300 mg/L L-谷氨酰胺
来自猪胰腺的胰蛋白酶	Sigma	T5266
台盼蓝染液（0.4%）	Gibco	15250-061
大豆胰蛋白酶抑制剂	Sigma	T6522	Sigma产品比之前使用的 Roche产BPTI（抑肽酶）便宜得多。
波形蛋白抗体（V9）	Sigma	V6630	单克隆小鼠抗猪波形蛋白抗体。  免疫荧光使用1:100稀释度。
Wistar WU大鼠	Charles River		实验当天应为19日龄。