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方法文章

测量生理反应 果蝇 利用活体钙成像技术研究感觉神经元对脂质信息素的响应

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DOI：

10.3791/53392

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2016年4月29日

 ,  , 
1Temasek Life Sciences Laboratory, 2Department of Biological Science, National University of Singapore, 3Bioimaging and Biocomputing Facility, Temasek Life Sciences Laboratory, 4Histology and Light Microscopy Core, Gladstone Institutes, 5Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa

本文内容

摘要

Drosophila的前足和喙部含有丰富的味觉感觉神经元。本文介绍一种利用钙成像技术检测活体果蝇前足和喙部感觉神经元在施加外源性味觉信息素后生理反应的方法。

摘要

与哺乳动物不同，昆虫如 果蝇 具有多个味觉器官。位于腿部、喙、翅膀和产卵器上的化学感受神经元 果蝇 表达味觉受体1,2离子通道3-6和离子型受体7 参与挥发性和非挥发性感觉线索检测的神经元。这些神经元直接接触味觉物质，如食物、有害物质和信息素，从而影响多种复杂行为，例如摄食、产卵和交配。电极记录和钙成像技术已广泛应用于昆虫中，以量化这些味觉物质引发的神经元反应。然而，电生理学技术需要专用设备，且由于细胞类型、大小和位置的不同，从单个味觉感受器获取测量数据在技术上具有挑战性。此外，单神经元分辨率在 果蝇 由于味觉感受器中含有不止一种类型的化学感受神经元，因此实现这一目标可能较为困难。本文所述的活体钙成像方法可用于测量活体果蝇中单个味觉神经元的反应。该方法特别适用于对脂类信息素及其他在水基溶剂中溶解度较低的配体类型的神经元反应进行成像。

引言

动物依赖嗅觉和味觉信息来做出对生存和繁殖至关重要的决策。要理解化学感觉信号如何被神经系统检测和处理，就需要鉴定出相应的感受器及其配体分子。Drosophila能够感知种类繁多的挥发性和非挥发性化合物，是研究化学感受生理机制的优良模型。嗅觉器官负责感知挥发性分子，而味觉器官则特化用于检测低挥发性化合物。本文介绍一种直接测量黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）味觉器官对低挥发性、亲脂性配体产生神经元反应的方法。

果蝇的味觉器官包括前足、喙和翅膀。在味觉器官表面分布着被称为感器的毛发状结构，这些感器可对糖类、苦味物质、盐类、水和信息素产生反应8。根据形态学特征，感器被分为味觉刚毛和味觉钉状突起两类9。唇瓣上约有31个味觉刚毛，根据形态可分为长型（l型）、短型（s型）和中间型（i型）。‘l’型和‘s’型感器内含有4个感觉神经元，分别对糖类（S细胞）、低浓度盐（L1细胞）、高浓度盐和苦味化合物（L2细胞）以及水（W细胞）产生生理反应10,11。‘i’型感器内含有2个感觉神经元，其中一个对低浓度盐和糖类均有反应，另一个则对高浓度盐产生反应12。雄性果蝇每条前足上约有41个味觉感器，雌性则有26个。无论雌雄，每条中足上有21个感器，后足上约有22个感器13。腿部味觉感器所包裹的味觉神经元同样被分为L1、L2、W和S四种类型。

一种记录单个神经元电活动的标准方法是使用细胞外或细胞内电极来测量离子流动。电极记录技术使得非模式生物中的神经元功能研究成为可能，例如 果蝇 物种、蛾类和蜜蜂，这些生物缺乏用于神经标记的完善遗传工具。然而，尽管电生理学方法已常规用于记录神经活动 果蝇 味觉感受器4,13,14，采用这一方法会面临多项技术挑战。首先，需要根据形态学特征和空间位置来识别味觉刚毛。在识别之后，由于感受器体积微小、所处位置难以接近，以及难以向味觉刚毛施加可控体积的化学刺激物，电生理学测量可能受到阻碍。此外，对感受器的刺激可能引发来自多种神经元类型的信号15其次，电信号的检测可能受到机械振动以及电子设备噪声所引起的背景干扰的影响。第三，若使用不当，尖锐电极可能会损坏果蝇样本。14最后，组装一套电生理记录系统需要用于刺激传递、信号记录和数据分析的专用电子元件，成本较高。

在D. melanogaster中，可遗传编码工具的可用性促进了成像技术的发展，使得能够研究少量神经元群体的反应。其中一种方法是使用CaLexA报告系统16。该方法将编码LexA-VP16转录因子和钙敏感蛋白NFAT的基因序列融合在一起。钙激活蛋白磷酸酶calcineurin，催化NFAT去磷酸化，进而促进其转入细胞核。在细胞核内，LexA结构域结合LexAop-DNA结合基序，驱动绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的表达，从而实现对功能激活神经元的持续识别。该方法已成功用于测量活体果蝇暴露于气味物质后，触角叶中特定嗅觉小球的反应16。最近，研究人员利用CaLexA测量了活体果蝇中IR52c味觉受体神经元的生理反应7。然而，在该研究中，需要将果蝇饲养长达6周以增强GFP的转录。尽管可通过抗GFP抗体进行免疫染色以增强CaLexA信号，但该方法需要组织固定，因而无法实现活细胞成像。

基因编码的钙离子指示蛋白 GCaMP 已被广泛用于研究多种物种中的神经元反应17。在神经元未受刺激时，GCaMP 蛋白的荧光强度较低。施加刺激后，神经元产生动作电位，导致 Ca2+ 内流。GCaMP 与 Ca2+ 结合后发生构象变化，从而增强荧光强度（图 1）。最近开发的一种单神经元钙成像方法被用于鉴定葡萄糖为前足特异性 Gr61a 味觉神经元的配体18。在该研究中，将表达 GCaMP 的转基因 Drosophila 的前足解剖后，在成像前覆盖一层琼脂糖。然而，使用解剖组织可能导致 GCaMP 表达逐渐减弱，从而限制测量时间和检测灵敏度。此外，琼脂糖可能因其较高的荧光背景和光散射特性而降低检测灵敏度。

为解决其中一些局限性，我们描述了使用GCaMP介导的钙成像技术记录完整动物前足和喙器味觉神经元生理反应的方法。我们展示了表达基因编码钙探针GCaMP5G的Gr68a和ppk23神经元的生理反应19 到一个 黑腹果蝇 脂质信息素，(3R, 11Z, 19Z)-3-乙酰氧基-11,19-二十八碳二烯-1-醇（CH503）20,21通过量化信息素刺激期间GCaMP5G信号荧光强度的增加来测量神经元反应。在本方案中，神经元成像总时长为120秒，足以区分单个细胞的神经元激活模式。

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方案

1. 样品制备

  1. 将 Gal43,22 驱动品系与 UAS-GCaMP5G19 果蝇（w1118;P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40）进行杂交。将杂交后代在 25 °C 条件下培养。
    注意：使果蝇携带多个 Gal4 或 UAS-GCaMP 转基因拷贝有助于增强荧光信号强度。早期版本的 UAS-GCaMP 转基因（UAS-GCaMP3）在 Gr68a-Gal4 驱动子控制下表达时，荧光强度非常弱。
    1. 收集羽化后的新成虫，并按性别分离，在 25 °C 条件下继续培养。
      注意：GCaMP5G 荧光的基础水平在 14 至 28 天龄的果蝇中最为理想。按性别分离果蝇可避免社会互动对神经反应的潜在影响。
  2. 用轻微气流的 CO2 对果蝇进行麻醉。
  3. 将盖玻片（厚度 0.17 mm）中心滴一滴指甲油，然后轻轻将果蝇侧放在指甲油液滴上，确保整个液滴被果蝇覆盖，从而将果蝇固定在玻璃盖玻片上。
  4. 在解剖体视显微镜下执行步骤 1.5 和 1.6，放大倍数设为 8X。
  5. 使用湿润的画笔将果蝇的一条前足展开，并用两条细胶带分别固定第一和第五跗节段（图 2A），以暴露用于成像的第二至第四跗节段（T2-T4）（图 2B）。
  6. 若需对喙部神经元进行成像，可在喙部上方贴一条细胶带，以暴露唇瓣（图 2C, D）。
  7. 使用 PAP 笔在果蝇周围画出疏水屏障，防止溶液在盖玻片表面流动。样品固定后需在 30 分钟内完成成像测量。

2. 刺激溶液的制备

  1. 将亲脂性配体（如本研究中使用的 CH503）稀释于 PBST 溶液中：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4、0.1% Triton X-100 (v/v)；pH 7.4。
    1. 使用 PBST 配制 1 mg/ml 的配体储备液。后续所有稀释均使用 PBST 对储备液进行。
      注意：根据目标配体的溶解度，可能需要使用不同的溶剂来溶解配体。CH503 在不同溶剂中的溶解度见表 1。与其他溶剂不同，PBST 不会引起荧光增强。

3. 味觉神经元的刺激与图像采集

  1. 使用10 µl移液器，将10 µl PBST滴加到跗节段上。
    注意：此步骤可湿润腿部，防止跗节段发生漂移。
  2. 使用配备具有足够速度和灵敏度相机的光学系统，以在高时间分辨率下获得良好的荧光信号。
    注意：本研究中使用了转盘共聚焦显微镜和sCMOS相机（见材料清单）。
  3. 选择需要成像的特定跗节段及神经元。采集三组刺激前共聚焦Z轴层扫图像。
    1. 理想情况下，应使用足够快的采集参数，以在尽可能高的时间分辨率下仍能完整捕获整个细胞体积。示例采集参数如下：曝光时间200毫秒，2 × 2 binning，6层0.5 µm2光学切片，每2秒采集一次。
      注意：固定后的腿部在30秒间隔下连续成像长达10分钟，未观察到GCaMP信号明显漂白。对于更长时间的记录，需确保腿部在盖玻片上被牢固固定。
    2. 优化激光功率，在整个成像过程中实现最小光漂白前提下的最高信噪比。本实验中，对腿部和喙部的Gr68a和ppk23味觉神经元成像时，使用491 nm二极管激光器（100 mW），透射率设置为30%。采用2 × 2 binning，可在保持足够空间分辨率的同时缩短曝光时间。
      注意：激光功率设置已优化，可检测到荧光信号增加1.2至4.5倍的变化。
  4. 用移液器将10 µl刺激溶液滴加到跗节段上。对照实验中，加入另外10 µl PBST。立即采集117张刺激后图像。
    注意：刺激后图像采集数量基于荧光信号达到最大变化所需的时间（约2分钟）确定。
    1. 关键步骤：向样品滴加溶液时，切勿用移液器吸头触碰果蝇，否则会导致前腿移位。
      注意：也可使用显微操作器，将装有刺激物的玻璃毛细管精确地定位至待成像的跗节段附近。根据制造商说明，使用细胞内微注射分配器递送可控体积的刺激物。

4. 图像处理与分析：反应的定量

  1. 使用 Fiji 打开一系列共聚焦 Z 层扫描图像http://fiji.sc/Fiji)23 或 ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/)24 图像分析与处理软件
  2. 对每个时间点的全部六个Z层图像进行信号强度求和投影。
    1. 在“Image”下选择“Stack”选项。进一步选择“Z projection”选项，并将起始切片设为“1”，终止切片设为“4”。在投影类型中，从下拉菜单中选择“sum slices”，并选择“All time frames”。
  3. 使用套索选择工具在细胞体或神经元突起周围绘制边界，以定义感兴趣区域（ROI）。单击“Analyze”标签，然后在“Tools”下选择“ROI manager”选项。
  4. 通过选择“分析”菜单下的“设置测量”选项，并勾选积分密度、面积、平均灰度值、最大灰度值和标签，来量化感兴趣区域的荧光强度。然后，在ROI管理器菜单中选择“更多”选项，并进一步选择“多重复测量”选项。
    注意：这将生成一个弹出窗口，显示所选参数的各个数值。
  5. 检查最大灰度值，确保没有任何像素达到饱和状态（例如，对于16位相机为65,535。
    注意：在本论文所示实验中，根据 ΔF/F 最大增加的位置，反应信号的测量来自细胞体或神经元投射。
  6. 计算荧光最大相对变化量（ΔF/F时间点 t 如下所示：
    ΔF/F formula for fluorescence intensity change, used in cell imaging and analysis.
    1. 从每个样本中减去背景荧光 F（细胞）值。为量化背景荧光，从前肢（或喙）无可见神经元的区域中选取一个大小和形状相同的感兴趣区域（ROI），测量其整合密度。
    2. 为了定量刺激后的荧光强度， F（细胞）t，测量刺激后时间点“t”处细胞体或突起的ROI的积分密度。
    3. 为了定量分析刺激前的荧光强度， F（细胞）t=0，以与刺激后信号相同的方式分析细胞体或突起的刺激前图像。采用3张图像的平均总密度来确定 F（细胞）t=0.

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结果

使用Gr68a-Gal4或ppk23-Gal4驱动子在遗传上表达了GCaMP钙指示剂。每种驱动子分别标记了前腿神经元和非神经支持细胞的不同细胞群（图3A-C）。在表达GCaMP的Gr68a-Gal4和ppk23-Gal4细胞中，观察到对亲脂性信息素CH503的配体特异性响应（图3D）。GCaMP5G信号的荧光强度相对变化（ΔF/F）随CH503浓度升高而增加（图3E）。有趣的是，5 ng剂量的CH503可能抑制神经响应。

Gr68a神经元和ppk23神经元表现出不同的反应模式。Gr68a神经元呈现持续性神经反应模式（图3F），而ppk23神经元则表现出时相性、振荡性反应（图3G）。利用该制备方法还测量了喙部ppk23神经元的反应，结果显示其反应为时相性和振荡性反应的组合（图3H）。

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讨论

本文介绍了一种对 Drosophila 两种不同感觉器官中的外周神经元进行活体钙成像的方法。信息素配体CH503诱导的Gr68a神经元中Ca2+引发的GCaMP荧光反应呈剂量依赖性和可定量性。此外，还可区分不同的神经反应模式，如时相性和紧张性反应。

表现出时相性反应的神经元被认为能够实现对持续刺激的快速适应。这种反应类型与气味检测25以及节律性运动活动模式的产生相关26。相比之下，已在多种感觉系统中描述的神经振荡被认为可将多个输入同步到单个突触后位点，并传递有关刺激的特定特征信息27。据我们所知，目前尚未有报道揭示与ppk23神经元相关的振荡反应的分子基础。在其他表现出振荡反应的可兴奋细胞中，振荡频率已被证明受到一种称为钙诱导钙释放的过程调控28。在此过程中，钙离子在第二信使三磷酸肌醇的调控下从细胞内储存库中释放，其释放频率依赖于外部刺激的强度。关于紧张性神经元反应的分子基础，已有研究通过对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的氧气感应受...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由新加坡国家研究基金会资助（项目编号 NRF-RF2010-06，授予 J.Y.Y.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Gr68a-Gal4由美国德克萨斯州A&M健康科学中心H. Amrein和美国康涅狄格州耶鲁大学J. Carlson惠赠
ppk23-Gal4由美国加利福尼亚州伯克利加州大学K. Scott惠赠
UAS-GCaMP5 42037布卢明顿果蝇 资源中心
0.17 mm 盖玻片（Gold-Seal盖玻片）电子显微镜服务公司63790-10
指甲油，"Hard as Nails Clear" Sally Hansen
PAP笔西格玛-奥德里奇 Z377821
画笔细头刷
胶带 Scotch品牌
吐温X-100西格玛-奥德里奇 13021
乙醇，实验级默克公司10094
正己烷，HPLC级西格玛-奥德里奇 H303SK-4
二甲基亚砜（DMSO）西格玛-奥德里奇 472301
PBST见实验方案部分中的配方描述
CH503Mori et al., 2010中所述合成方法
sCMOS相机（ORCA Flash4.0）滨松光子学公司 C11578-22U
显微镜（Ti-Eclipse）尼康公司Ni-E
转盘扫描头 横河电机公司CSU-X1-A1
采集软件（MetaMorph Premier）分子器件公司40002
Fiji软件开源软件http://fiji.sc/Fiji

参考文献

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