Drosophila的前足和喙部含有丰富的味觉感觉神经元。本文介绍一种利用钙成像技术检测活体果蝇前足和喙部感觉神经元在施加外源性味觉信息素后生理反应的方法。
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本文内容
摘要
摘要
与哺乳动物不同，昆虫如 果蝇 具有多个味觉器官。位于腿部、喙、翅膀和产卵器上的化学感受神经元 果蝇 表达味觉受体1,2离子通道3-6和离子型受体7 参与挥发性和非挥发性感觉线索检测的神经元。这些神经元直接接触味觉物质，如食物、有害物质和信息素，从而影响多种复杂行为，例如摄食、产卵和交配。电极记录和钙成像技术已广泛应用于昆虫中，以量化这些味觉物质引发的神经元反应。然而，电生理学技术需要专用设备，且由于细胞类型、大小和位置的不同，从单个味觉感受器获取测量数据在技术上具有挑战性。此外，单神经元分辨率在 果蝇 由于味觉感受器中含有不止一种类型的化学感受神经元，因此实现这一目标可能较为困难。本文所述的活体钙成像方法可用于测量活体果蝇中单个味觉神经元的反应。该方法特别适用于对脂类信息素及其他在水基溶剂中溶解度较低的配体类型的神经元反应进行成像。
引言
动物依赖嗅觉和味觉信息来做出对生存和繁殖至关重要的决策。要理解化学感觉信号如何被神经系统检测和处理，就需要鉴定出相应的感受器及其配体分子。Drosophila能够感知种类繁多的挥发性和非挥发性化合物，是研究化学感受生理机制的优良模型。嗅觉器官负责感知挥发性分子，而味觉器官则特化用于检测低挥发性化合物。本文介绍一种直接测量黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）味觉器官对低挥发性、亲脂性配体产生神经元反应的方法。
果蝇的味觉器官包括前足、喙和翅膀。在味觉器官表面分布着被称为感器的毛发状结构，这些感器可对糖类、苦味物质、盐类、水和信息素产生反应8。根据形态学特征，感器被分为味觉刚毛和味觉钉状突起两类9。唇瓣上约有31个味觉刚毛，根据形态可分为长型（l型）、短型（s型）和中间型（i型）。‘l’型和‘s’型感器内含有4个感觉神经元，分别对糖类（S细胞）、低浓度盐（L1细胞）、高浓度盐和苦味化合物（L2细胞）以及水（W细胞）产生生理反应10,11。‘i’型感器内含有2个感觉神经元，其中一个对低浓度盐和糖类均有反应，另一个则对高浓度盐产生反应12。雄性果蝇每条前足上约有41个味觉感器，雌性则有26个。无论雌雄，每条中足上有21个感器，后足上约有22个感器13。腿部味觉感器所包裹的味觉神经元同样被分为L1、L2、W和S四种类型。....
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方案
1. 样品制备
- 将 Gal43,22 驱动品系与 UAS-GCaMP5G19 果蝇（w1118;P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40）进行杂交。将杂交后代在 25 °C 条件下培养。
注意：使果蝇携带多个 Gal4 或 UAS-GCaMP 转基因拷贝有助于增强荧光信号强度。早期版本的 UAS-GCaMP 转基因（UAS-GCaMP3）在 Gr68a-Gal4 驱动子控制下表达时，荧光强度非常弱。- 收集羽化后的新成虫，并按性别分离，在 25 °C 条件下继续培养。
注意：GCaMP5G 荧光的基础水平在 14 至 28 天龄的果蝇中最为理想。按性别分离果蝇可避免社会互动对神经反应的潜在影响。
- 收集羽化后的新成虫，并按性别分离，在 25 °C 条件下继续培养。
- 用轻微气流的 CO2 对果蝇进行麻醉。
- 将盖玻片（厚度 0.17 mm）中心滴一滴指甲油，然后轻轻将果蝇侧放在指甲油液滴上，确保整个液滴被果蝇覆盖，从而将果蝇固定在玻璃盖玻片上。
- 在解剖体视显微镜下执行步骤 1.5 和 1.6，放大倍数设为 8X。
- 使用湿润的画笔将果蝇的一条前足展开，并用两条细胶带分别固定第一和第五跗节段（....
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结果
使用Gr68a-Gal4或ppk23-Gal4驱动子在遗传上表达了GCaMP钙指示剂。每种驱动子分别标记了前腿神经元和非神经支持细胞的不同细胞群（图3A-C）。在表达GCaMP的Gr68a-Gal4和ppk23-Gal4细胞中，观察到对亲脂性信息素CH503的配体特异性响应（图3D）。GCaMP5G信号的荧光强度相对变化（ΔF/F）随CH503浓度升高而增加（图3E）。有趣的是，5 ng剂量的CH503可能抑制神经响应。
Gr68a神经元和ppk23神经元表现出不同的反应模式。Gr68a神经元呈现持续性神经反应模式（图3F），而ppk23神经元则表现出时相性、振荡性反应（图3G）。利用该制备方法还测量了喙部ppk23神经元的反应，结果显示其反应为时相性和振荡性反应的组合（图3H）。
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讨论
本文介绍了一种对 Drosophila 两种不同感觉器官中的外周神经元进行活体钙成像的方法。信息素配体CH503诱导的Gr68a神经元中Ca2+引发的GCaMP荧光反应呈剂量依赖性和可定量性。此外，还可区分不同的神经反应模式，如时相性和紧张性反应。
表现出时相性反应的神经元被认为能够实现对持续刺激的快速适应。这种反应类型与气味检测25以及节律性运动活动模式的产生相关26。相比之下，已在多种感觉系统中描述的神经振荡被认为可将多个输入同步到单个突触后位点，并传递有关刺激的特定特征信息27。据我们所知，目前尚未有报道揭示与ppk23神经元相关的振荡反应的分子基础。在其他表现出振荡反应的可兴奋细胞中，振荡频率已被证明受到一种称为钙诱导钙释放的过程调控28。在此过程中，钙离子在第二信使三磷酸肌醇的调控下从细胞内储存库中释放，其释放频率依赖于外部刺激的强度。关于紧张性神经元反应的分子基础，已有研究通过对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的氧气感应受.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由新加坡国家研究基金会资助（项目编号 NRF-RF2010-06，授予 J.Y.Y.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Gr68a-Gal4 | 由美国德克萨斯州A&M健康科学中心H. Amrein和美国康涅狄格州耶鲁大学J. Carlson惠赠 | ||
| ppk23-Gal4 | 由美国加利福尼亚州伯克利加州大学K. Scott惠赠 | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | 布卢明顿果蝇 资源中心 | |
| 0.17 mm 盖玻片（Gold-Seal盖玻片） | 电子显微镜服务公司 | 63790-10 | |
| 指甲油，"Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP笔 | 西格玛-奥德里奇 | Z377821 | |
| 画笔 | 细头刷 | ||
| 胶带 | Scotch品牌 | ||
| 吐温X-100 | 西格玛-奥德里奇 | 13021 | |
| 乙醇，实验级 | 默克公司 | 10094 | |
| 正己烷，HPLC级 | 西格玛-奥德里奇 | H303SK-4 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | 西格玛-奥德里奇 | 472301 | |
| PBST | 见实验方案部分中的配方描述 | ||
| CH503 | Mori et al., 2010中所述合成方法 | ||
| sCMOS相机（ORCA Flash4.0） | 滨松光子学公司 | C11578-22U | |
| 显微镜（Ti-Eclipse） | 尼康公司 | Ni-E | |
| 转盘扫描头 | 横河电机公司 | CSU-X1-A1 | |
| 采集软件（MetaMorph Premier） | 分子器件公司 | 40002 | |
| Fiji软件 | 开源软件 | http://fiji.sc/Fiji |
参考文献
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol.
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重印与许可
