使用 Flywalk 范式对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的嗅觉引导行为进行高分辨率定量分析

摘要

自动化追踪系统Flywalk用于对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的嗅觉引导行为进行高分辨率定量分析。

摘要

在自然环境中，果蝇（Drosophila melanogaster）等昆虫会接触到大量化学性质各异的气味分子。更为复杂的是，昆虫神经系统所感知的气味通常并非单一化合物，而是成分和浓度比例不断变化的混合物。这导致神经系统必须评估近乎无限种类的不同嗅觉刺激。

因此，为了了解气味刺激的哪些方面决定了果蝇对其的评估，有必要高效地检测果蝇对多种单一气味物及气味混合物的趋味行为。为了将行为与神经元活动直接关联起来，行为的量化应在与神经生理学实验相同的时间尺度和完全一致的刺激条件下进行。然而，目前常用的许多嗅觉生物测定方法在 黑腹果蝇 神经行为学在效率或分辨率方面往往较为专业化。

Flywalk 是一种自动化的气味递送与追踪系统，弥合了效率与分辨率之间的差距。该系统能够精确确定气味包刺激自由行走果蝇的时间，并分析动物动态的行为反应。

引言

神经行为学研究的总体目标是建立单个神经元或神经回路活动状态与生物体行为之间的因果关系。为实现这一目标，应在相同的刺激条件下同时监测神经活动和行为，且这些刺激条件最好接近被研究的神经系统在进化过程中所适应的自然环境。特别是在行为生物测定实验中，这些要求在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）嗅觉神经行为学研究中历来具有较高挑战性。

一旦从源头释放，气味羽流会迅速分裂成细丝状结构，空气流动引起的湍流扩散是决定气味分布的主要因素。¹因此，昆虫在向气味源移动时，会经历由气味团块与不同间隔的洁净空气交替出现所导致的间歇性刺激。无论是行走还是飞行的昆虫——包括 果蝇- 已被证明可利用这种间歇性刺激模式进行导航：在遇到气味羽流时向上风方向冲刺，而在无气味时主要进行横风向移动^2-5在生理学实验中，刺激程序在很大程度上通过提供单次气味脉冲并间以长时间的洁净空气，或采用动态刺激序列，来模拟昆虫在自然环境中可能经历的刺激方式。^6-11，许多用于行为生物学研究的生物测定方法 果蝇 神经行为学实验，如陷阱检测、开放旷场装置或T型迷宫，均依赖于气味梯度^12-15然而，由于气味梯度在定义上随距离气味源的远近而具有浓度变化，因此在这些范式中无法将特定行为归因于精确的气味浓度。此外，气味梯度的斜率在很大程度上取决于气味分子的理化性质。高挥发性化合物形成的梯度比低挥发性化合物形成的梯度更平缓，因此对于依赖空间浓度差异作为唯一导航手段的生物体而言，追踪前者也更为困难。^16-20这可能导致对嗅觉偏好的误判，尤其是在选择性实验中。当研究对象为气味混合物时，这种效应尤为不利，因为它会导致空间中各位置的混合成分比例不同，从而再次阻碍生理反应与行为之间的明确关联。

尽管醋蝇倾向于聚集在发酵的果实上，它们在向食物源和产卵位点移动时却是单独行动的。然而，许多行为研究范式并非测试单个个体，而是采用群体测试的方式。 果蝇 神经行为学通过检测果蝇群体对气味引导行为的反应来研究其行为特征，其中吸引力以选择气味刺激而非对照刺激的果蝇比例进行评分。这类群体实验极大地促进了对果蝇神经行为学的理解，许多通过群体实验获得的观察结果已在单只果蝇实验中得到验证。然而，已有研究发现果蝇之间可相互影响其决策行为。²¹ 在极端情况下，根据种群密度的不同，生物对某种气味的评价可能从无动于衷转变为回避²²此外，这类实验的结果通常只能提供一系列行为决策的最终结果，而无法观察果蝇在执行行为时的实时活动情况，而后者在尝试将行为与神经元活动相关联时是十分必要的。与这些分辨率较低的群体实验形成对比的是高分辨率的单只果蝇研究方法，例如固定飞行装置和跑步平台，这些方法可在刺激呈现的同时直接观察个体的行为反应。^20,23,24然而，队列实验仍然广受欢迎，因为其效率很高，即使在相对较小的样本量下也能提供可靠的结果，原因是在较长时间内对群体进行观测时，个体间和试验间的变异性在一定程度上被平均化。尽管固定飞行和跑步机实验在刺激呈现和时间分辨率方面可能代表了金标准，但所使用的实验装置专为单个动物设计，因此获取统计分析所需样本量的过程耗时较长。近年来已发展出多种新方法，能够高效地获取高分辨率的行为数据，并结合明确定义的刺激模式。这些方法包括在风洞中对多只醋蝇进行无监督的三维追踪，同时结合精确的气味羽流三维模型。⁵在两侧提供气流的选择室中对多只果蝇进行个体追踪²⁵ 以及Flywalk范式²⁶.

在 Flywalk 中, 15只果蝇被分别置于小型玻璃管中，在红光条件下由上方摄像头持续监测。气味被加入流速为20 cm/sec的持续气流中，并以恒定速度通过玻璃管。气流在进入气味递送系统前，会经过装有250 ml蒸馏水（加湿瓶）的容器进行加湿。在气味呈现前后，果蝇的位置被记录在一个方形感兴趣区域（ROI）内，该区域覆盖了气味管的大部分长度，但排除了管子外侧边缘（每侧约5 mm）的区域，因为在这些位置果蝇无法进一步向上游或下游移动。图1A, B）。在整个实验过程中，追踪系统根据果蝇的Y轴位置保持其身份标识不变即 其玻璃管限制）。气味刺激通过多组分刺激装置实现，该装置可呈现多达8种单一气味及其所有可能的混合物^26,29 (图1B）。实验过程由一台计算机控制，该计算机调节气味输送系统并采集温度和湿度信息（计算机1， 图1C）。该计算机还控制第二台计算机上的数据记录仪（启动/停止记录），后者以每秒20帧的速率持续追踪果蝇的位置（计算机2）。果蝇位置、气味阀门状态（即 阀门开启时间点、气味编号、气味刺激循环期间周围的温度和湿度等信息均记录在计算机2中。通过这种方式，气味信息与果蝇位置信息实现同步，并导出为.csv文件，可使用自定义编写的分析程序进行后续处理与分析。由于整个系统由计算机控制，实验过程中无需人工干预。

方案

Flywalk 的构建和技术细节已在其他地方描述过²⁶（如果在建立该系统时遇到任何问题，可向 MK 获取更多信息）。本文重点介绍该实验范式的详细操作步骤，以帮助获得可靠的结果。

1. 果蝇操作

1. 在23-25 °C、70%相对湿度、12小时光照:12小时黑暗循环条件下，将果蝇饲养于低至中等密度的培养基²⁷中。具体操作：将20-30只新羽化的成年果蝇放入一个大培养瓶中繁殖1周，随后移除成年果蝇，等待后代羽化。
2. 收集30-40只新羽化（年龄<24小时）的成年果蝇，并将其转移至含有培养基²⁷的新培养瓶中，饲养3-5天。
3. 行为实验开始前24小时：使用吸虫器将此前收集的30-40只3-5日龄果蝇（见步骤2.2）全部转移至一个新的培养瓶中，瓶内放置湿润的橡胶泡沫塞或湿润的纸巾。
   注意：切勿使用CO₂麻醉果蝇。

2. 果蝇行为分析装置的准备 

1. 使用250 ml的瓶子作为加湿器，每个加湿器中加入100 ml蒸馏水。
2. 准备气味小瓶。
   1. 制备 500 µl 10^-3 乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯和2,3-丁二酮的纯气味物质在矿物油溶剂中的稀释液。
   2. 每个气味小瓶连接两个球型单向阀。注意单向阀仅允许气流单向通过，因此应将单向阀连接成一侧进气、另一侧出气的方式。
   3. 取下200 µl PCR反应管的管盖。用移液器将每种气味稀释液各100 µl分别加入不同的反应管中，并将这些反应管放入不同的气味样品瓶中。另准备一个仅含有溶剂矿物油的气味样品瓶。
   4. 使用不锈钢塞和橡胶垫圈密封气味样品瓶，确保 tightly 密封。
   5. 将5个气味小瓶（4个装有气味物质，1个装有矿物油）连接至气味递送系统。务必按照正确的气流方向连接。连接错误不仅会影响实验的正常进行，还可能导致递送系统被污染。 
3. 通过密封刺激装置混合室的出口来检查是否存在泄漏。确保刺激装置前的所有气流逐渐降至零。如果未能降至零，请检查是否存在泄漏，此时可通过系统漏气时产生的嘶嘶声来定位泄漏点。
4. 使用吸虫器将15只果蝇分别转移至15根独立的玻璃管中，并用相应的接头将玻璃管两端封闭。 
   注意：由于系统必须保持完全密封才能成功进行实验，请确保接头与玻璃管紧密贴合，并注意玻璃管在此步骤中可能破裂。操作时应佩戴防护手套和护目镜，以避免受伤。
5. 将玻璃管连接至Flywalk装置，此后至少等待15分钟再开始实验，以使果蝇适应新环境。
6. 连接玻璃管后：在计算机1上检查下游数字流量计的读数，确认玻璃管后的16路气流总和是否等于进入系统的气流。同时在计算机1上检查湿度是否在60%至80%之间。
7. 设计刺激方案，以控制呈现给果蝇的气味刺激的顺序和时间。为了获得 例如 所述数据中，每种气味及对照（矿物油）单独呈现，同时呈现所有可能的三元及四元气味混合物，每种组合各重复40次。设定脉冲持续时间为500毫秒，刺激间间隔为90秒，并对刺激序列进行随机化。
8. 打开光源（LED 集群；λ = 630）。确保提供足够的光照以实现高效追踪，同时避免玻璃管内温度升高。
9. 通过拖动框架覆盖待监测区域，设置追踪系统的兴趣区域，确保包含全部15根玻璃管，并排除每根管边缘约5 mm的范围。
10. 在追踪系统中，通过在相应脚本中调整 Y 轴位置，设置 14 条平行的分隔线，分别对应各个独立的玻璃管，以确保实验全程能够区分每只果蝇。分隔线的设置应保证任意两条分隔线之间始终间隔一根玻璃管，因为每对分隔线之间仅追踪一只果蝇。
11. 确保相机参数设置合理，以便在整个玻璃管区域内稳定追踪果蝇。如果在兴趣区域边缘丢失果蝇图像，可适当提高追踪软件的亮度或增益。避免追踪系统受到机械振动。根据制造商的操作说明，使用商业软件进行追踪。
12. 开始实验时启动刺激程序，以20帧/秒的速率记录果蝇的XY坐标，并将坐标数据与气味阀状态一并记录于文本文件中。

3. 数据分析

注意：数据分析中的以下步骤使用 R 编程语言编写的自定义程序实现自动化。尽管如此，由于这些步骤对于获得有意义的结果至关重要，分析过程仍将逐步呈现。分析所用的原始数据为 .csv 文件，其中包含在一个气味刺激周期内按统一时间轴记录的气味阀门状态、实验中的脉冲序号以及 15 只果蝇的 x 坐标位置（单位：cm）。数据分析所用的自定义代码可根据要求提供。

1. 打开 .csv 文件，找到表示阀门状态的列中发生改变的时间点，该时间点标志着阀门开启。
2. 计算气味位置的线性函数，形式为
   f(t) = s*t + i
   其中 t 为刺激周期中的时间，s 为风速（此处为 20 cm/sec），截距 i 可通过气味进入位置为 0 的管道的时间点（阀门开启时间加上延迟时间）计算得到。
3. 对每只果蝇，找出气味位置与其 x 坐标相交的时间点，并将该时间点设为 0。注意：通过此方法可将每只果蝇的位置与其个体接触气味的时刻对齐。
4. 排除位于感兴趣区域边缘的果蝇。
5. 通过将 x 轴方向上的位移除以时间间隔（100 毫秒）来计算速度，并对每个刺激周期重复此过程。
6. 为获得如 图 2E 所示的速度随时间变化曲线，先计算每只果蝇在每种气味下的平均速度时间曲线，再基于这些曲线计算特定气味下的平均时间曲线。
7. 为获得如 图 3C 所示的净位移，计算每次追踪事件中气味脉冲后 4 秒内的净位移，然后计算每只果蝇在每种气味下的平均净位移。

4. 清洁程序

1. 清洁玻璃管
   1. 将果蝇和接头从玻璃管中取出，将玻璃管浸泡于洗涤剂中。
   2. 用蒸馏水冲洗玻璃管，然后用加压空气干燥。
   3. 将玻璃试管在200 °C下加热8小时。
2. 清洁气味递送系统
   1. 从中央混合室中移除所有气味小瓶和管路。
   2. 从混合室上拆下管路接头。
   3. 用实验室清洗液和溶剂冲洗混合室以进行清洁（例如 乙醇、丙酮）。在实验室通风橱中进行这些步骤。
   4. 使用加压空气干燥混合室，并在200 °C下加热8小时。
3. 清洁气味小瓶和单向阀
   1. 从气味小瓶中取出钢制塞子（丢弃橡胶垫圈）和止回阀，并将所有部件浸泡在实验室清洗液中。
   2. 将组分置于超声波清洗机中进行超声处理，并用蒸馏水冲洗。
   3. 用乙醇和丙酮清洗所有部件，止回阀除外。在实验室通风橱内执行这些步骤。
   4. 使用加压空气干燥组分，并在 200 °C 下加热 8 小时。
   5. 使用注射器以乙醇和丙酮冲洗单向阀内部（注意流向），对单向阀进行清洁。操作时应在实验室通风橱内进行，并佩戴实验室护目镜。由于丙酮会腐蚀橡胶部件，冲洗后需立即用加压空气冲洗单向阀，使其迅速干燥。
   6. 通过在数天内以脉冲方式使空气经由单向阀流通，去除残留气味。此清洁步骤需使用60 °C的培养箱，并采用1秒通气/1秒断气的循环模式。

结果

由于果蝇在气味脉冲之间可在玻璃管内自由分布，且气味脉冲以恒定速度在玻璃管中传播，因此果蝇在刺激发生时所处的x位置不同，接触到气味的时间也不同。结果表明，在风速为20 cm/sec、玻璃管长度为20 cm的条件下，与靠近上风端的果蝇相比，位于玻璃管下风端的果蝇对持续500毫秒的10^-3稀释度乙酸乙酯（一种吸引性气味）刺激所引发的上风向运动轨迹的起始时间延迟约1秒（图2A）。根据每个果蝇在气味呈现时刻的x位置，校正其气味接触的时间差异后，可发现个体间对乙酸乙酯的反应延迟具有一致性（图2B）。

相应地，未对气味传播时间进行校正的平均逆风轨迹相比经过校正的平均轨迹延迟约0.5秒（图2C；需注意，两条轨迹均已校正气味进入玻璃管逆风端所需的时间）。此外，单次气味脉冲的校正后平均逆风轨迹比未校正轨迹具有更陡的斜率（即 更高的行走速度）（图2D）。与单次气味脉冲的观察结果类似，在包含两个实验阶段（即 30只...

讨论

尽管Flywalk系统乍看之下显得相当复杂，但一旦搭建完成并开始运行，其操作十分简便，且能产生非常稳健的实验结果。为了强调该生物测定方法所得结果的一致性，需要指出的是，本文展示的代表性结果是在约2年前获得的，当时使用的是经过改进的实验装置，包括新的追踪软件和光源，而这些结果与先前研究²⁹中展示的部分结果相比，在动力学特征上仍表现出高度相似性，尽管响应幅度略有升高。

为了使用Flywalk获得高质量的结果，有一些关键方面需要特别注意。重要的是，实验过程中湿度不应低于60%。一次典型的实验过程大约持续8小时。合理大小的野生型CS雌蝇在实验前饥饿处理24小时后，在湿度足够高的实验装置中通常可轻松存活至少12小时。为避免与湿度相关的问题，建议在一根空玻璃管中安装湿度传感器（图1B），并避免在加湿器与玻璃管之间的气流路径中安装流量调节器。系统必须完全密封，这对数据质量至关重要。从玻璃管后端离开系统的气流总量应等于进入系统的气流总量。大多数实验失败可归因于系统泄漏，因此在实验开始前必须格外仔细地确保系统气密性。最后，与任何用于嗅觉研究的装...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
果蝇行为分析系统装置	定制		详情可应要求提供
刺激装置	定制		详情可应要求提供
LED 光源阵列	定制		详情可应要求提供
HD Pro Webcam C920	Logitech, Lausanne, Switzerland
2 台计算机
Flywalk Reloaded v1.0 软件	Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net)
Labview 11.0 软件	National Instruments, Austin, TX
标准果蝇培养基	定制
标准果蝇培养管	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
标准果蝇培养管	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
吸虫器	定制
矿物油	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
气味物质	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
200 µl PCR 反应管	Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany