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通过RNAi控制花生中的黄曲霉毒素：分析花生中霉菌毒素产生及转基因表达的方法曲霉属 病理系统

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DOI：

10.3791/53398

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2015年12月21日

 ,  , 
1National Peanut Research Laboratory, United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service

本文内容

摘要

我们展示了一种用于分析花生种子中黄曲霉毒素及转基因表达的方法，这些花生种子含有针对真菌Aspergillus flavus中黄曲霉毒素合成基因的RNA干扰信号。此前尚未见有关通过RNAi在植物中控制霉菌毒素的报道。

摘要

联合国粮食及农业组织估计，全球有25%的粮食作物受到黄曲霉毒素的污染，这意味着每年有1亿吨食物被销毁或转为非人类消费用途。黄曲霉毒素是一类强致癌物，通常由真菌Aspergillus flavus和A. parasiticus在谷物、坚果、块根类作物及其他农产品中积累产生。本研究利用RNA干扰（RNAi）技术在花生植株中沉默五个黄曲霉毒素合成基因，以控制接种A. flavus后黄曲霉毒素的积累。此前，尚无有效方法可用于评估单个转基因花生事件中RNAi的效果，因为这些事件通常产生的种子数量极少，而传统的大田试验方法需在利于黄曲霉毒素生成的条件下进行，难以实施。在田间条件下，自然污染种子的检出概率通常仅为1/100至1/1,000，且黄曲霉毒素的分布并不均匀。本方法仅需每个转基因事件少量种子，取小块组织用于实时PCR（RT-PCR）或小RNA测序分析，同时采用超高效液相色谱法（UPLC）检测黄曲霉毒素的积累水平。表达RNAi的花生品系288-72和288-74在接种产毒型A. flavus后，与对照组相比，黄曲霉毒素B1和B2的含量最高降低了100%（p≤0.01），而对照组中黄曲霉毒素B1的积累量高达14,000 ng.g-1。作为参考，美国规定人类食品中黄曲霉毒素总量的最高允许限量为20 ng.g-1。本实验方案描述了在转基因花生种子中应用RNAi技术控制黄曲霉毒素的方法及其评估手段。我们认为，该方法在花生及其他作物育种中的应用将推动这一重要科学、医学与人类营养领域的快速发展，并将显著促进国际上对主要粮食作物中黄曲霉毒素及其他霉菌毒素的防控工作。

引言

全球约有45亿人长期暴露于黄曲霉毒素1，这是目前已知自然界中最强的致癌物2。这些真菌毒素污染了全球25%的农作物3，包括玉米、木薯、水稻、坚果、谷物和香料4。黄曲霉毒素可导致儿童生长发育迟缓5，损害免疫系统6，在人类肝细胞癌活检样本中检出率达58%7,8，并在周期性暴发的黄曲霉中毒疫情中导致数百人死亡9,10。黄曲霉毒素是一类聚酮衍生的真菌毒素，通常由Aspergillus flavus和A. parasiticus产生；其中A. flavus产生黄曲霉毒素B1和B2，而A. parasiticus还可产生G1和G2。这些化合物的化学结构以及通过超高效液相色谱（UPLC）分离的色谱图见图1。

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图 1. 黄曲霉毒素与RNAi插入片段。上图：四种最常见的聚酮衍生黄曲霉毒素（B1、B2、G1 和 G2）的化学结构（左）及色谱图示例（右），其中 Aspergillus parasiticus 可产生全部四种，而 A. flavus 仅产生 B1 和 B2。下图：用于花生转化的RNAi载体p5XCAPD中基因片段的示意图，箭头下方数字为基因片段在 Aspergillus flavus 基因组中的登录号；PIV2：马铃薯内含子；bp：碱基对；RT_5X_1 和 RT_5X_2：实时PCR引物位点。请点击此处查看该图的放大版本。

仅以欧盟规定的人类食用花生中黄曲霉毒素限量4 ng.g-1计算，因黄曲霉毒素导致的出口经济损失就已超过4.5亿美元11。黄曲霉毒素已被发现60年12；然而，尽管已发展出多种农业措施以减轻其影响，包括施用其他真菌菌株13,14，但至今仍缺乏稳定有效的防控方法，且尚无抗性植物品种可供使用。对植物种质资源进行抗黄曲霉毒素能力的检测尤为困难，因为即使在利于病原菌侵染的条件下，毒素的积累仍具有不可预测性，且不符合正态分布。因此，实验通常需要大面积种植、数百粒种子以及多个100–1,700 g的样品，以降低数据的变异性15,16。

RNA干扰于1998年被发现17；目前，“沉默”技术的优势正在多个新应用中得到探索，e.g.，用于治疗转移性乳腺癌18、肝癌19、髓系白血病20的人类疗法，以及用于植物抵抗昆虫21和线虫22的保护。在植物中，RNA干扰信号可在细胞间传播，其中小干扰RNA（siRNA）和高分子量RNA负责系统性的转录后基因沉默23,24，甚至可在与植物寄主密切接触的真菌病原体内部发挥作用25。RNAi介导的植物对真菌病原基因沉默的有效性已在少数植物病害系统中得到描述；在这些系统中，通过肉眼观察植物地上部分（叶片）的症状可实现病害的定量评估，i.e.，莴苣中的卵菌Bremia26、小麦中的Puccinia27以及香蕉中的Fusarium28。然而，评估RNAi在控制植物中真菌毒素（尤其是花生中的黄曲霉毒素）方面的有效性则困难得多，因为叶片不表现出感染症状，受侵染器官（种子）位于土壤数英寸之下，感染发生具有不可预测性，且只有通过化学分析才能确定黄曲霉毒素的存在。此外，每例花生转基因事件通常仅产生少量种子（每株4–6粒）；因此，采用数百粒种子、在大田地块中进行整个生长季的传统测试，以鉴定无黄曲霉毒素积累性状，在实践中不可行。本文描述了一种方法，仅需少量种子，即可在不到一周的时间内分析RNAi花生种子中是否存在转基因以及是否具备无黄曲霉毒素积累性状。

方案

1. 分子构建与花生转化

  1. 将五种A. flavus基因的DNA片段组合在一起，这些基因分别为AFL2G_07223（aflS或aflJ）、AFL2G_07224（aflR）、AFL2G_07228（aflC/pksA/pksL1）、AFL2G_07731（pes1）和AFL2G_05027（黄曲霉毒素外排泵，aflep）。为此，使用以下引物和超长寡核苷酸：DIR-1、Short-Dir1-R、DIR-2-inverted、Short-Dir2-R、DirAll-Nco-Rv和DirAll-BamEco-Fw，见表1。
    1. 使用DNA聚合酶按照制造商说明，通过5个PCR循环（25 μl反应体系；95 °C预变性2 min，随后进行5个循环：94 °C 45 sec、55 °C 30 sec、68 °C 15 sec），以引物Short-Dir1-R扩增获得DIR-1双链，使其带有3'突出端CCCGT；重复上述步骤，使用引物Short-Dir2-R制备DIR-2-inverted双链，使其带有与DIR-1互补的3'突出端ACGGG。
    2. 按照制造商说明，使用T4 DNA连接酶将两个199 bp的片段连接，然后以引物DirAll-cacc-Fw和DirAll-Nco-Rv（表1）对所得393 bp片段进行PCR扩增，并通过标准技术将其克隆至pENTR1A载体中，构建质粒p2+4ENTR。
    3. 按照制造商说明，使用LR clonase II酶混合物将p2+4ENTR重组至pCAPD29（NCBI登录号：KC176455.1）中，构建质粒p5XCAPD，随后通过标准方法转化至Escherichia coli DH5α中，并进行部分测序验证。注：完整的RNAi插入序列见表1。
  2. 将质粒p5XCAPD转化至Agrobacterium菌株C58C130中，方法如先前报道30，然后利用所得农杆菌转化花生植株，步骤如下：
    1. 在30 °C下培养携带p5XCAPD的Agrobacterium，使用含500 μg ml-1链霉素、25 μg ml-1庆大霉素和10 μg ml-1卡那霉素的50 ml LB培养基，以250 rpm振荡培养至OD260达到1。
    2. 通过离心（6,000 × g）10分钟收集Agrobacterium菌体，重悬于含100 μM乙酰丁香酮的50 ml AB最小培养基31中，孵育1小时；随后将Exp27-1516（匍匐型花生育种系）10–14天龄幼苗的外植体浸入该菌液中。30分钟后，用3MM滤纸吸干外植体表面菌液，将其转移至无抗生素的芽诱导培养基（SIM）[MS盐32、3%蔗糖、20 μM苄氨基嘌呤（BAP）、10 μM噻二唑脲（TDZ），pH 5.8，0.3%结冷胶]中，暗培养3天。
    3. 按先前报道的方法进行组织筛选与再生33。将组织转移至含500 μM头孢噻肟和100 μM卡那霉素的SIM培养基中以诱导芽形成，每两周继代一次，持续2个月；随后将伸长的芽转移至芽伸长培养基（SEM）[5 μM BAP、1 μM赤霉酸（GA3）]中，每两周继代一次，持续数月。
    4. 将长约2 cm的单个芽转移至生根诱导培养基（RIM）[1/2 MS、1.5%蔗糖、5 μM α-萘乙酸（NAA）、2.5 μM吲哚丁酸（IBA）]中诱导生根，随后对幼苗进行驯化，并移栽至温室中。

2. 鉴定携带RNAi以沉默黄曲霉毒素合成基因的花生植株

  1. 根据制造商说明，在机器人工作站中使用植物迷你试剂盒，以 200 μl 洗脱体积提取经过转化处理（如前所述）的花生植株幼叶中的 DNA，所用 RNAi 载体为 p5XCAPD（图 1），其骨架质粒为用于基因沉默的 pCAPD 29。
  2. 采用单管巢式 PCR（STN-PCR）对 DNA 样本进行筛选，方法如前所述 34，以检测筛选标记 NPTII 及来自 p5XCAPD 的 RNAi 插入片段。对 STN-PCR 阳性植株取茎段（3–4 个节位）进行无性繁殖，以获得足够种子用于第一代测试。
    1. 所有 STN-PCR 反应中使用四种两倍梯度稀释的 DNA（稀释前浓度为 50–100 ng μl-1）。针对 NPTII 基因，使用外引物 PCAPD 5714F：5'-AGGCTATTCGGCTATGACTG-3' 和 PCAPD 6446R：5'-CGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3'，以及内引物 PCAPD 5730F：5'-ACTGGGCACAACAGACAATC-3' 和 PCAPD 6249R：5'-ATATTCGGCAAGCAGGCATC-3'。
    2. 在 STN-PCR 反应中检测 RNAi 插入片段时，使用外引物 35S-PDSFw：5'-CCTAACAGAACTCGCCGTAA-3' 和 DirAll-Nco-Rv：5'-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3'，以及内引物 Probe_5027_Fw：5'-gtatttgtgaccatgtttctg-3' 和 Probe_7228_Rv：5'-GGACGGATAGTAAACTGCGG-3'。
  3. 收获 STN-PCR 阳性植株及在相同条件下种植的对照植株的花生荚果。关键步骤：确保对照植株与 RNAi 植株在相同环境条件及同一生长季节中栽培。使用低压清洗机对荚果进行水喷处理或手工刮除外果皮，将荚果置于成熟度分级板上观察中果皮颜色，并据此将荚果分为不同组别（黄色、橙色、棕色和黑色）35（图 2）。

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图2. 用于分析的花生荚果制备。  左图：收获时常见的不同大小的花生，因为花生属于无限生长型植物；中图：将花生放入金属篮中，通过水压去除外果皮；右图：根据花生剖面板上中果皮的颜色划分的成熟度等级（黄色、橙色、棕色和黑色）。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 实验设置

  1. 去除种皮，分别处理黄色和棕色种子。根据表2计算实验所需的种子数量。注意，每个花生品系和每个取样时间点至少需要三个种子样本（1个样本=半个子叶），以进行统计分析并减少标准误差。
名称序列 
DIR-15'-
GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT
CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCGTATTTG
TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC
ATTCCCCAGATCACGGACGAATCCCCTGCATCTACGCGCACGCATC
ACTTGGGGTACCCGT-3'
Short-Dir1-R5'-Phos-TACCCCAAGTGATGCGTGCGCG-3'
DIR-2-inverted5'- GGTTATTGGGTGCAGAATGGTAAACCACCCAACAGTACGCGAAATG
TCAATTCCAGAGTCCCAAACCTCCCTACCGTGGCCTGGACGGATAG
TAAACTGCGGAGCTTGGGAACAAAATCCGCTGTCTGATCGCCGAAG
AGAAAGAGTTGCCTTGATTGAGCCGCATCGAGGACAGGTTGTGTTG
CTGTTGATAGACGGG-3'
Short-Dir2-R5'-Phos-CTATCAACAGCAACACAACC-3'
DirAll-cacc-Fw5'-CACCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3'
DirAll-Nco-Rv5'-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3'
DirAll-BamEco-Fw5'-ATGGGATCCGAATTCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3'
完整 RNAi 插入片段5’- GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT
CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTC/GTATTTG
TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC
ATTCCCCAGATCACGGACGAAT/CCCCTGCATCTACGCGCACGCAT
CACTTGGGGTACCCGTCTATCAACAGCAACACAACCTGTCCTCGAT
GCG/GCTCAATCAAGGCAACTCTTTCTCTTCGGCGATCAGACAGCG
GATTTTGTTCCCAAGCTCCGCAGTTTACTATCCGTCCA/GGCCACGG
TAGGGAGGTTTGGGACTCTGGAATTGACATTTCGCGTACTGTTGGG
TGGTTTACCATTCTGCACCCAATAACC-3’

表1. 用于构建RNAi载体p5XCAPD的寡核苷酸和超长核苷酸序列。 Phos：5’端磷酸化；“/”分隔所用的五个基因片段；完整RNAi插入片段：用作两个反向重复序列以构建p5XCAPD的序列。

  1. 将完整的花生种子单层放置，使其覆盖无菌烧杯的底部。  加入75%乙醇/水（v/v）溶液至完全浸没种子，然后加入等体积的相同溶液。  在室温下孵育30秒，随后用无菌去离子水（SDW）冲洗。
  2. 向已用乙醇处理的种子烧杯中加入2%次氯酸盐溶液：加入足量2%次氯酸盐溶液以浸没种子，再加入等体积的相同溶液，孵育5分钟。关键步骤：用相当于所用次氯酸盐溶液体积5倍的无菌去离子水（SDW）彻底冲洗三次（图3）。

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图3. 实验装置。顶部：花生种子在次氯酸盐处理前后的表面灭菌，去除种皮（种皮层）；中部：去除胚并近距离观察胚，然后将子叶切成两半；底部：将半片子叶置于无菌蒸馏水中，用无菌吸水纸吸干，水琼脂平板上打凹槽，将半片子叶（切面朝上）放置于琼脂表面。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 让表面灭菌的种子在SDW中浸润2小时。将种子置于无菌培养皿中，用镊子去除种皮，分离子叶，并用解剖刀取出胚。注意：胚可弃去或用于再生新植株。
  2. 使用解剖刀将每片子叶切成两半。为避免脱水，将切好的种子片段置于无菌水中，直至所有种子处理完毕。
  3. 已准备含有无菌水琼脂（1.5% 琼脂/水，w/v）的培养皿，每三个种子片段使用一个培养皿。用镊子在琼脂表面轻轻压出小凹痕，将种子片段在无菌滤纸上短暂吸去多余水分后，将其切面朝上放置于水/琼脂培养皿中。
  4. 从产黄曲霉毒素菌株的新鲜培养物中 曲霉属 flavus NRRL 3357 在 25℃ 下于察氏琼脂培养基中培养 °C 下培养 10 天，制备每毫升含有 50,000 个孢子的悬浮液 μl SDW，使用血细胞计数板计数。
  5. 放置 2 μ将孢子悬浮液均匀涂布于每半个子叶切面上，避免液体沿侧面流下，以确保孢子与含有RNAi的种子组织充分接触图4).

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图4. 黄曲霉毒素分析的接种与培养。上图：半片子叶、接种孢子悬浮液，以及接种24小时后半片子叶上Aspergillus flavus的菌丝生长情况。  下图：  左：在1.5%琼脂培养基上培养48小时；中：在1.5%琼脂培养基上培养72小时；右：实验设置不正确的示例，在0.5%琼脂培养基上培养72小时。  请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将接种和未接种的半子叶培养皿置于黑暗条件下，于 30 °C 培养至取样时。

4. 黄曲霉毒素分析与基因表达的取样

  1. 在培养24、48和72小时（可选96小时）时，分别采集用于RT-PCR和黄曲霉毒素分析的样品，每份重复样品为一片（半个子叶），每次取样从不同培养皿中随机选取。使用纸巾轻轻擦去琼脂和多余的真菌孢子，然后将种子样品放入小瓶或试管中。
  2. 用于黄曲霉毒素分析的样品，将每份重复（一片）放入4 ml玻璃螺口小瓶中，并于-80 °C保存。注意：由于黄曲霉毒素具有良好的化学稳定性，样品在此条件下可保存数月（本实验中通常为1-2个月）。
  3. 用于RT-PCR的样品，将每份重复（一片）放入预先准备好的2 ml研磨管中，管内含有两颗不锈钢珠（直径2.5 mm）和三颗氧化锆珠（直径2 mm）。
  4. 立即冷冻所有样品（最好使用液氮），并在处理前一直保存于-80 °C。

5. 单个子叶半片的黄曲霉毒素分析

  1. 使用 A. flavus 用于此分析的接种样品。将样品置于室温下约30分钟，加入四倍体积（通常为2–3 ml；w/v）甲醇（记录体积以供后续计算），盖紧瓶盖，在避光条件下静置过夜（约16小时），不进行振荡。
  2. 将一个烧结滤片放入匹配的1.5 ml聚丙烯微型柱中，加入200 mg碱性Al2O3 并用另一个烧结片盖住，具体方法如前所述 36；然后，将超高效液相色谱（UPLC）自动进样瓶置于柱子下方，位置应足够接近以避免洗脱液可能的挥发。
  3. 在一次性玻璃试管（勿用塑料制品）中，加入 0.5 ml 第 4.1 步获得的甲醇提取液，再加入 0.5 ml 乙腈，用移液器混匀，取 0.5 ml 混合液加入第 4.2 步制备好的色谱柱中。通过重力作用使溶液流入自动进样瓶（勿施加压力）。洗脱通常需要 2–4 分钟，立即使用带隔垫的 UPLC 兼容瓶盖密封进样瓶。将样品瓶置于室温保存，并于当日完成 UPLC 分析。
  4. 为分离黄曲霉毒素，将含有样品洗脱液的自动进样瓶和含有黄曲霉毒素标准品（B1 和 B2 使用时 A. flavus) 在配备匹配的UPLC四元溶剂管理器、UPLC自动进样器、UPLC荧光检测器和C18 2.1 mm × 50 mm，1.7 µm 列
    1. 使用由水/甲醇/CH组成的等度流动相3CN（64:23:13，v/v/v）混合液以0.30 ml/min的流速-1. 根据制造商说明书，获取色谱图以确保基线分离稳定，从而准确计算黄曲霉毒素浓度 37.
    2. 通过获取黄曲霉毒素的质谱数据并与已发表的数据进行比对，确认其身份 38使用离子阱质谱仪，配备电喷雾电离（ESI）接口，并根据制造商说明使用相应的软件。
  5. 通过注入不同量的黄曲霉毒素B系列商业标准品获得的校准曲线，参照确定黄曲霉毒素的浓度1，B2，G1 和 G2 如超高效液相色谱仪（UPLC）制造商所建议，并由软件确定 37.
  6. 将已用甲醇提取的种子样品分别置于玻璃小瓶中，进行过夜（约16小时）冷冻干燥以测定其干重。随后，计算黄曲霉毒素浓度（单位为ng）.g-1 种子块干重的
  7. 数据分析时，将黄曲霉毒素检测结果转换为对数（ng）.g-1 +1），随后进行Tukey检验以比较均值。

6. 基因表达，样本的RT-PCR处理

  1. 从 -80 °C 冰箱中取出含有样品的 2 ml 研磨管，立即（无需解冻）在珠磨均质器中以 3,100 rpm 研磨 40 秒，随后按照制造商说明使用 Trizol 进行 RNA 提取。
  2. 使用 1 μg RNA 及等量的寡聚 dT 和随机六聚体引物为每个样品制备 cDNA，将 cDNA 进行 1:8 稀释后，每反应使用 2 μl 进行 RT-PCR（方法如前所述39）。
    1. 检测 RNAi 插入片段表达时，使用引物：RT_5X_1_105F: 5'GGTGGCATTGGACCGTCTTG-3'，RT_5X_1_232R: 5'-CGCATCGAGGACAGGTTGTG-3'；以及 RT_5X_2_95F: 5'-CCATGTTTCTGGTGGCATTG-3'，RT_5X_2_229R: 5'-ATCGAGGACAGGTTGTGTTG-3'。
    2. 检测筛选标记基因 NPTII 表达时，使用引物：RT_NPTII_1_6871F: 5'-CTCGCTCGATGCGATGTTTC-3'，RT_NPTII_1_7004R: 5'-GCAGGATCTCCTGTCATCTC-3'。以看家基因 Actin 作为标准化对照，引物为：Actin-Fw: CACATGCCATCCTTCGATTG；Actin-Rv: CCAAGGCAACATATGCAAGCT40。
  3. 采用 ΔΔCT 法分析结果41，以 Actin 表达量进行标准化，结果以相对于对照组的倍数变化表示。

结果

质粒 p5XCAPD 是由 pCAPD29 衍生而来，并用于花生植株的遗传转化；该载体携带五个小片段的反向重复序列，每个片段长 70–80 bp，来源于A. flavus的黄曲霉毒素合成基因，各片段之间由一个内含子隔开（图 1）。构建中所用的片段分别来自 AFL2G_07224（aflR）、AFL2G_07223（aflS 或 aflJ）、AFL2G_05027（黄曲霉毒素外排泵基因，aflep）、AFL2G_07228（aflC/pksA/pksL1）和 AFL2G_07731（pes1）；图 1 中的编号对应于马萨诸塞州剑桥市 BROAD 研究所的A. flavus基因组注释及文献42。经过遗传转化过程共再生出 99 个花生株系，其中 50 个株系通过 STN-PCR 检测出 NPTII 基因呈 PCR 阳性，33 个株系 PCR 阳性并结出种子。仅有七个 PCR 阳性株系被克隆扩繁，并采用本方法检测其黄曲霉毒素积累量，这七个株系的黄曲霉毒素积累量均比对照减少 60% 至 100%。本文展示了其中两个株系的结果。由于单个转基因事件通常产生的种子数量较少，因此我们建立了一种方法，可在使用最少种子数量的前提下仍能进行参数化统计分析。图 5 和 表 1 展示了样品制备与实验设计的流程图。尽管第一代转基因种子通常为半合子状态，但通过 RNA 干扰产生的小干扰 RNA（siRNA）可在细胞间及系统范围内移动，从而在整个植株中实现黄曲霉毒素合成基因的沉默。

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图5. 分析RNAi在花生种子中沉默Aspergillus 黄曲霉毒素合成基因效果的方法示意图。处理花生样品进行基因表达或黄曲霉毒素分析时的工作流程图示。 请点击此处查看此图的放大版本。

通过STN-PCR检测，RNAi花生株系288-72和288-74显示出存在NPTII选择标记，凝胶电泳结果如图6（上图）所示，原始图片可向作者索取。未使用质粒pCAPD作为转化对照，因为它编码两个基因Cmr（氯霉素抗性）和CcdB（毒素）的反向重复序列，其对植物的影响未知。PCR检测呈阴性的花生株系288-9及其他经历相同再生过程并在与RNAi株系相同条件下生长的株系，被用作阴性对照。

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图6. 转基因植株的检测及RNAi插入片段的实时表达分析。 上图：单管巢式PCR检测转基因花生品系RNAi-288-72和RNAi-288-74（阳性植株）。对照：W（水）、PP（阳性植株）、MM（主混合液）、p（质粒p5XCAPD）；DNA的1/2  1/4 1/8 1/16为两倍梯度稀释。 下图：实时PCR检测RNAi插入片段的表达（引物组合：RT_5X_1、RT_5X_2，参见图1），在24和48小时培养条件下对转基因品系未成熟（黄色）和成熟（棕色）子叶进行检测；灰色线：CT = 1。柱状图表示三个生物学重复样本（每个含三个技术重复）的平均值及标准误差条（T）。RNAi插入片段的相对定量以持家基因Actin作为内参进行归一化处理，转基因的相对表达倍数按5.2.2和5.3节所述方法计算。 请点击此处查看该图的放大版本。

为了检验植物宿主RNAi介导的黄曲霉毒素积累潜在控制方法的有效性，将新收获的Aspergillus flavus NRRL 3357分生孢子接种于已去除胚和种皮的半子叶切面上（图3、图4）。用于实验的A. flavus NRRL 3357菌株基因组已被测序，是设计p5XCAPD载体的基础，由美国农业部农业研究局南部研究中心（USDA-ARS-NPRL）的Horn博士惠赠。在30 °C下培养24、48和72小时后，半子叶被真菌侵染的情况如图4所示。在培养24、48、72和96小时后，分别采集接种后的半子叶样品，采用UPLC检测主要四种黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的含量，并通过LC-MS确认，结果见图6。黄曲霉毒素浓度的测定采用已发表的方法并加以改进36。在培养96小时后，由于真菌感染，子叶开始解体。在未成熟子叶的所有取样时间点以及成熟子叶的大多数取样时间点，RNAi株系288-72的黄曲霉毒素水平均显著低于对照组；RNAi株系288-74在大多数取样时间点也表现出显著较低的黄曲霉毒素水平。Tukey检验的显著性水平在图7的图示中以星号标示。

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图7. 黄曲霉毒素B1 和 B2 在半片花生子叶中经孵育（24、48、72 和 96 小时）后 曲霉属 flavus. 对照：288-9 非转基因株系的种子；RNAi：RNAi-288-72 和 RNAi-288-74 转基因株系的种子，携带 p5XCAPD RNAi 载体以沉默五个黄曲霉毒素合成基因。A黄曲霉毒素 B1 在成熟种子中（棕色）；（B黄曲霉毒素B2 成熟种子；(C黄曲霉毒素B1 在未成熟种子（黄色）和（D) 黄曲霉毒素B2 在未成熟种子中。数据表示两个生物学重复样本的平均值及相应标准误（T）。经Tukey检验，统计学显著性差异：*：p ≤ 0.05，**：p ≤ 0.01，***：p ≤ 0.001。 请点击此处以查看此图的放大版本。

总体而言，与对照组相比，RNAi-288-72 在整个实验过程（24 至 96 小时孵育）中，黄曲霉毒素 B2 减少了 94%–100%，黄曲霉毒素 B1 减少了 90%–100%。RNAi-288-74 使黄曲霉毒素 B2 减少了 63%–100%，黄曲霉毒素 B1 减少了 60%–100%，图 7。

用于实时PCR检测RNAi插入片段表达的引物如图1所示。花生种子子叶在去除胚后进行分析，以排除其天然防御系统的干扰，从而能够检测RNAi对最易受真菌侵染部位——子叶——的潜在影响。在24小时孵育条件下，通过引物组RT_5X_1在288-74品系的未成熟子叶（黄色）中检测到的RNAi插入片段表达量达到阴性对照CT=1阈值的4倍，而使用引物组RT_5X_2检测的表达量则为阈值的19倍。在花生转化所用的五个连续基因片段中，至少有三个片段（分别为5027、7223和7228，对应基因aflep、aflS/aflJ和aflC/pksA）通过RT-PCR被成功检测到（图1，6）。在24小时孵育的成熟子叶中，或在48小时孵育的成熟及未成熟子叶中，均未检测到RNAi插入片段的表达（图6，底部）。

花生品系采样时间用于RT-PCR的样品用于黄曲霉毒素分析的样品（接种）种子数量
（未接种）
重复1重复2重复3重复1重复2重复3
RNAi（黄色）24小时1111114.5
48小时111111
72小时111111
对照24小时1111114.5
（黄色）48小时111111
72小时111111

表2. RNAi 花生种子中基因表达与黄曲霉毒素积累分析的小样本实验设置示例 一个成熟组的表达及黄曲霉毒素的完整分析即.，黄色），三个采样时间点（24、48 和 72 小时），每个处理设三个重复，共需要 4.5 粒种子，表中每个数字代表半个子叶。

讨论

已证明植物宿主可通过RNAi介导沉默真菌病原体中的基因27,43，但目前尚无文献报道RNAi介导的植物中霉菌毒素积累控制的可行性。在花生研究中，一个限制因素是缺乏评估单株植物无黄曲霉毒素积累表型的方法，因为地下荚果感染真菌后叶片并不表现出症状。此外，黄曲霉毒素积累呈非正态分布，且化学分析需要大量样品15,16，这阻碍了对单株植物中潜在RNAi效应的定量分析。本文所述方法包括使用五粒种子进行72小时实验，每24小时取样一次，共三次，每个处理设三个重复（表1，图7）。与通常需要不少于100克种子的黄曲霉毒素分析方法相比，本方法特别适用于最初仅产生两到三个荚果的单个转基因花生植株。

通过遗传转化已证明RNA介导的黄曲霉毒素合成沉默 Aspergillus flavus 和 A. parasiticus。由于 aflR 是黄曲霉毒素生成的主要调控因子 A. flavus 和 A. parasiticus44,45，它成为植物中RNA介导沉默的一个有趣靶点。然而，基因序列中的变异在 aflR 已在……中得到证实 曲霉属 物种 46，如果这些遗传变异与植物宿主产生的RNAi信号之间不存在完全的序列匹配，则可能逃避免疫沉默。因此， aflR 是p5XCAPD载体中沉默的靶标之一，但并非唯一靶标。该载体包含反向重复序列的 aflR 基因导入 A. flavus 和 A. parasiticus 通过转化导致黄曲霉毒素的沉默以及极少量或完全不产生黄曲霉毒素 47（麦克唐纳 等，2005b）。此外，沉默 aflD 基因使黄曲霉毒素的产生减少了高达98% A. flavus 和 A. parasiticus 直接转化 48为了提高本系统中转化的成功率，利用黄曲霉毒素合成相关五个基因的反向重复片段对花生进行了转化。 A. flavus使用靶向黄曲霉毒素合成途径中多个基因以进行沉默的p5XCAPD，可使黄曲霉毒素B的水平降低90%-100%1 和 B2 在接种半片子叶的情况下，288-72株系中的积累量达到对照水平，而288-74株系中的积累量比对照低60-100% A. flavus, 图4、图7最重要的是，该方法检测到288-72和288-74品系在黄曲霉毒素积累上的统计学显著差异 与 通过应用参数统计方法，在整个实验过程中进行对照。 图7由于样本量较小，必须强调使用高灵敏度方法检测黄曲霉毒素的重要性，因此本实验采用超高效液相色谱法（UPLC）进行分析，该方法相较于高效液相色谱法（HPLC）具有更高的分辨率、五倍的性能提升以及三倍的灵敏度。 49.

在24小时培养后，仅在288-74品系的未成熟子叶（黄色）中检测到RNAi插入片段的表达。在24小时的成熟子叶或任何成熟组别的48小时样本中，均未通过RT-PCR检测到RNAi插入片段，图6。在其他RNAi转基因花生品系中也观察到相同现象（Arias, R.S., 2015，未发表），通常仅在24小时的未成熟子叶中检测到RNAi转录本。RNA样本在cDNA合成前经DNA酶处理，数据已根据肌动蛋白（Actin）表达水平进行标准化，且未观察到DNA污染的证据。如果样本中存在DNA，则在48小时样本中也应被检测到，但结果始终未发现此类情况。由35S启动子驱动的表达并不总是均一的；其表达可能受环境条件50、组织类型和发育阶段51,52的影响。同时，在RNA干扰通路中，mRNA降解速率与siRNA降解速率可能存在显著差异53。有可能是RNA干扰机制导致mRNA快速降解，从而在48小时培养时无法检测到mRNA。在48小时未检测到表达的原因究竟是35S启动子驱动的转录水平较低，还是Dicer对双链RNA的快速切割所致，仍有待进一步研究。因此，通过高通量测序检测小RNA将有助于更深入理解本实验中RNA干扰过程的具体机制54 。然而，由于RNA沉默具有系统性传播特性，主要通过韧皮部从光合产物源向蔗糖汇（在本研究中为花生种子）传递55，因此即使在没有局部表达RNAi插入片段的种子中，仍可能发生黄曲霉毒素合成的沉默效应。目前仍需大量研究以确定防止种子中黄曲霉毒素积累所需的小干扰RNA（siRNAs）的阈值水平。需要特别强调的是，RNAi构建体的mRNA表达（图6）以及黄曲霉毒素B1和B2的积累情况（图7）在未成熟（黄色）与成熟（棕色）子叶之间表现出明显差异。vs。花生植株具有无限生长习性，因此收获时荚果处于不同的成熟阶段，图2。此外，在相同田间条件下，不同成熟组别的种子其化学成分也存在差异，e.g.，未成熟种子中蔗糖含量为2.4%，而成熟种子中为1.9%56,57。因此，为了准确评估RNA介导的黄曲霉毒素积累控制效率，有必要对不同成熟组别分别进行分析。

花生种子的一种天然防御机制是产生植物抗毒素，其产生的化合物种类及相对含量因种子成熟度和环境条件而异58-61，且在胚中的含量显著高于子叶62。胚中的核酸浓度（包括DNA和RNA）也明显高于子叶（Arias R.S.，未发表）。随着花生种子的成熟，其生理特性和化学成分会发生变化63。花生种皮中的酚类抗氧化物质可形成具有抑菌活性的缩合单宁64；这一点也体现在中果皮颜色上，其颜色随成熟度增加由黄色变为黑色35，同时单宁和酚类化合物的含量也随之升高65。因此，由于种皮或胚具有抗菌特性，若在实验中保留它们，可能会抑制真菌生长，从而高估RNAi沉默的效果，故将其去除。此外，去除种皮和胚也有助于减少分析过程中的变异来源，因为带有胚的半片子叶含有更多的植物抗毒素和更高的RNA含量。

除了按成熟度分组进行分析以及在这些实验中去除种皮和胚以外，还需指出以下几点观察结果：a）尽管结果显示了长达96小时的孵育结果，但建议孵育时间不超过72小时，以获得一致的结果，因为种子在96小时时已开始降解；b）尽管来自同一颗种子的半片子叶在取样时是随机选取的，不能完全视为独立样本，但在不同转基因事件中，RT-PCR和黄曲霉毒素积累在种子间的变异极小。此外，准确的真菌孢子计数、接种体积为2 μl，以及将孢子接种于子叶切面并避免滴到侧面，对于确保萌发的孢子与植物组织充分接触至关重要。培养皿中的水/琼脂浓度应为1.5%（w/v），较软的琼脂会导致孢子流失，如图4（底部）最后一帧所示。若某一特定转基因事件的种子数量有限，可进行重复两次的取样而非三次，仍可获得类似结果（即，图7）；然而，三次重复取样有助于减小标准误差。该方法唯一的局限性在于需要使用高灵敏度系统（UPLC）进行黄曲霉毒素的检测与定量，但与此同时，这也降低了在使用灵敏度较低方法未能检出黄曲霉毒素时高估RNAi效应的可能性。

总之，该方法首次提供了一种可靠的研究RNAi在黄曲霉毒素控制中作用的途径。该方法将实验时间从整个种植季缩短至不到一周，将极大地加速针对RNAi-花生/Aspergillus 病害系统的研究，以实现对黄曲霉毒素的减缓和/或消除。

披露

作者无任何披露事项或利益冲突。

致谢

本工作获得了美国农业部农业研究局（USDA-ARS）CRIS 项目 6604-21000-004-00D、CRIS 项目 6604-42000-008-00D 以及美国国际开发署“养活未来”计划（USAID Feed-the-Future）协议编号 58-0210-3-012 的资金支持。我们感谢 Valerie Orner、LaTanya Johnson、Joseph Powell 和 Kathy Gray 提供的技术协助。本文中提及的贸易名称或商业产品仅用于提供具体信息，并不意味着美国农业部对其推荐或认可。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
引物，寡核苷酸DNA Technologies, Coralville, IA, USAn/a
Dneasy 植物小量提取试剂盒Qiagen, Valencia, CA69106
Czapek Dox 琼脂培养基Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MACM0095
琼脂Thermo Fisher Scientific, Waltham, MABP 1423
–80 °C 冰箱n/an/a
氧化铝，Al2O3Fisher ScientificA941
1.5 ml 固相萃取（SPE）储液管Grace Davison Discovery Scientific210011
1.5 ml SPE 储液管用筛板Grace Davison Discovery Scientific211401
自动进样瓶Waters Corporation, Milford, MA186005221
Waters Acquity 超高效液相色谱仪（UPLC）；UPLC-H-Class 四元溶剂管理器；UPLC 样品管理器；UPLC 荧光检测器（FLR）；UPLC BEH C18 2.1 mm × 50 mm，1.7 μm 色谱柱Waters Corporation, Milford, MA
Finnigan LCQ Advantage MAX 离子阱质谱仪，配备 Xcalibur 1.4 版软件Thermo Electron Corp., San Jose, CA
黄曲霉毒素标准品，B1、B2、G1 和 G2Sigma-Aldrich, St. Louis, MOA6636; A9887; A0138; A0263
Systat 软件 12.2 版SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA
Trizol 试剂Invitrogen, CA15596-018
SuperScript III 第一链合成预混液Invitrogen, CA11752-050
ABI 7500 实时荧光定量 PCR 仪Lifetechnologies, Grand Island, NY4406984
LB 培养基（Miller 型）Fisher ScientificR453642
pENTR1AInvitrogen, CAA10462
LR Clonase II 酶混合液Invitrogen, CA11791-020
T4 DNA 连接酶NEB BiolabsM0202L
GelriteSigma-Aldrich, St. Louis, MOG1919
乙酰丁香酮Sigma-Aldrich, St. Louis, MOD134406
QIAcube 核酸自动提取工作站Qiagen, Valencia, CA9001292
抗生素：卡那霉素、头孢噻肟、庆大霉素、链霉素Goldbio, St. Louis, MOcef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50
Platinum 高保真 Taq DNA 聚合酶Invitrogen, CA11304-029

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RNAi B1 PCR RNA

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