细菌附着于宿主细胞是宿主定植和感染过程中的关键步骤。本方案描述了制备聚合物偶联的重组黏附素作为仿生材料的方法，该材料可独立于其他细菌因子，用于分析单个黏附素在这些过程中所起的作用。
本文内容
摘要
摘要
细菌与宿主细胞的黏附是细菌定植宿主组织过程中最早发生的事件之一，因此也是感染过程中的关键步骤。由于其他细菌因子（如细胞壁成分或分泌分子）的存在会干扰分析，介导这些初始细菌-宿主相互作用的黏附素的生化与功能表征常常受到限制。本方案描述了仿生材料的制备与使用方法，该材料由纯化的重组黏附素通过化学方法偶联至市售的功能化聚苯乙烯微球而构成，已被成功用于解析单个细菌黏附素与宿主细胞受体之间的生化及功能相互作用。本文还讨论了不同的偶联化学方法，这些方法可实现重组黏附素在聚合物支架上的定向固定，以及评估所得“类菌性”材料偶联效率的实验方案。我们进一步阐述了此类材料作为工具抑制病原体介导的细胞毒性的应用，并探讨了该方法在研究细菌-宿主相互作用中的适用范围、局限性及进一步的应用前景。
引言
在宿主-病原体界面，解析细菌黏附素与宿主细胞表面受体之间的相互作用，是理解驱动细菌黏附的潜在分子机制的关键步骤。最终，这将有助于我们识别在感染过程中干扰这些过程的策略。在开展此类研究时，我们常常面临一个两难困境：对黏附素结合分子机制进行生化和生物物理分析，需要将其从其他细胞壁组分中分离出来，而这些组分可能干扰黏附事件。另一方面，使用重组可溶性蛋白会过度简化黏附过程，因为它忽略了黏附素在细菌细胞壁中的锚定作用以及通过细菌表面展示实现的多价结合效应。同样，从宿主细胞的角度来看，接触并结合单个黏附素分子并不总是对质膜结构、膜流动性以及受体聚集1产生相同的影响，这最终使得评估黏附作用对宿主细胞信号转导以及细菌-宿主相互作用结局的影响变得困难。
最近开发了一种方法，可将重组纯化的黏附素或黏附素片段定向且共价地偶联至大小与细菌相似的聚合物微粒上，从而模拟细菌表面展示。该方法已应用于多种不同的黏附素，包括革兰氏阴性菌的多价黏附分子（MAMs）2, 3，包括革兰氏阳性菌黏附素 金黄色葡萄球菌 纤连蛋白结合蛋白（FnBPA）4, 5 和 Streptococcus pyogenes F1 6, 7该方法可解析对宿主细胞结合至关重要的黏附素片段，鉴定宿主细胞表面受体，并在综合考虑结合亲和力与结合强度的基础上，确定其在宿主细胞表面的行为特征 1, 8此外，该方法已被用于研究固定化的黏附素及其衍生物作为宿主-病原体相互作用抑制剂的有效性。 8, 9已证明，表面偶联的衍生物 副溶血性弧菌 多价黏附分子（MAM）7可用于减轻多种细菌感染 体外，包括由多重耐药病原体（如 鲍曼不动杆菌 和耐甲氧西林的 S. aureus 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA） 7, 9.
在此，我们描述了可用于将黏附素固定在市售的功能化聚苯乙烯颗粒上的不同化学方法。由于可获得的表面功能基团、标记物和颗粒尺寸种类繁多，这类颗粒可作为制备模拟细菌材料的有用支架，用于研究黏附素与宿主之间的相互作用。我们进一步介绍了偶联反应的初步表征方法，以及所得材料重要性质的计算方法。最后，介绍了将珠粒偶联的黏附素用作竞争性抑制剂的应用 体外 以细菌感染为例，讨论了该技术的应用，以及该方法的未来前景与局限性。
方案
1. 蛋白质与聚合物微珠的化学偶联
- 巯基-胺定向偶联
注意：本方案适用于使用磺基琥珀酰亚胺-4-（p-马来酰亚胺基苯基）丁酸酯（Sulfo-SMPB）作为交联剂，将含半胱氨酸的蛋白质定向偶联至胺基功能化聚合物微球（图1）。
图1. 用于蛋白质与聚合物微球定向巯基-胺偶联的交联策略。 胺基修饰的聚苯乙烯微球通过Sulfo-SMPB活化，马来酰亚胺基团与游离半胱氨酸反应，实现蛋白质的定向偶联。 请点击此处查看该图的放大版本。- 试剂准备：
- 配制PBS（100 mM磷酸钠，150 mM NaCl，pH 7.0），并进行高压灭菌。
- 在使用前立即配制TCEP（三(2-羧乙基)膦）的100倍储备液（0.5 M或287 mg/ml，溶于PBS）。
- 在使用前立即配制Sulfo-SMPB的5倍储备液（10 mM或4.58 mg/ml，溶于dH2O）。
- 在使用前立即配制半胱氨酸的10倍储备液（500 mM或88 mg/ml，溶于PBS，pH 7.0）。
- 微球活化：
- 轻轻颠倒混匀微球悬液，并将所需体积的微球悬液（例如，12 ml）转移至含有1 ml无菌PBS（pH 7.0）的无菌1.5 ml离心管中。
- 轻柔吹打混匀以洗涤微球，随后在微量离心机中离心（2 min，16,000 × g）收集微球沉淀。
- 用移液器小心吸除上清液并弃去。将微球沉淀重悬于1 ml新鲜无菌PBS中，重复洗涤一次。最后将微球沉淀重悬于0.8 ml PBS中。
- 加入200 µl新配制的10 mM Sulfo-SMPB溶液，使终浓度为2 mM。
- 将微球悬液置于旋转摇床上，在25 °C孵育1小时。
- 蛋白质还原：
- 在微球活化孵育期间，准备下一步偶联所需的蛋白质，以便可立即加入活化的微球中。
注意：尽管谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白并非总是需要此还原步骤，但建议进行以确保较高的偶联效率。- 检测蛋白质浓度，并将其调整至偶联反应所需的终浓度。注意：通常使用6 mM的蛋白质浓度（溶于PBS），体积为1 ml。
- 加入TCEP储备液，使终浓度为5 mM，在室温下孵育30分钟。
注意：该反应混合物可直接用于后续的偶联反应。 - 保留少量（几微升）蛋白质溶液，用于测定蛋白质浓度及计算偶联效率（见第2节）。
- 在微球活化孵育期间，准备下一步偶联所需的蛋白质，以便可立即加入活化的微球中。
- 蛋白质偶联步骤：
- 将活化的微球通过离心（2 min，16,000 × g，微量离心机）收集沉淀，并用1 ml新鲜无菌PBS洗涤一次。
- 将沉淀重悬于已准备好的蛋白质溶液（例如，1 ml）中，以达到所需的蛋白质浓度。
注意：偶联步骤中的蛋白质浓度取决于平均偶联效率（见第2节测定方法）和目标偶联密度（如1.1.4.3节计算所示）。通常偶联效率约为85%，目标终浓度为10倍微球悬液中的5 mM，因此偶联步骤中蛋白质浓度应约为6 mM。 - 使用以下公式计算偶联密度：
其中
ρc 偶联密度 [蛋白质分子数/nm2]，
protein conc 蛋白质浓度 [mg/ml]，
protein Mw 蛋白质分子量 [Da]，
bead conc 微球浓度 [微球数/L]，
d 微球直径 [nm2]，
阿伏伽德罗常数 - 利用偶联密度计算平均配体间距：
- 将蛋白质-微球悬液置于旋转摇床上，在25 °C孵育2小时。
注意：某些蛋白质在室温下可能不稳定。在此类情况下，反应可在4 °C过夜进行。 - 加入半胱氨酸储备液至终浓度50 mM，以封闭微球上剩余的活化基团，并在25 °C旋转摇床上孵育30分钟。通过离心（2 min，16,000 × g，微量离心机）收集微球沉淀。
- 保留上清液用于测定蛋白质浓度及计算偶联效率（见第2节）。
- 用1 ml PBS洗涤微球沉淀两次，并将沉淀重悬于1 ml新鲜PBS中，得到最终产物。
注意：上述方案通常可获得1 ml偶联蛋白产物，终蛋白质浓度为5 mM，可作为后续实验的10倍储备液使用（见第3节）。 - 若继续进行方案第3节，请使用100 µl/ml的微球储备液，或终蛋白质浓度为500 nM。注意：本操作的良好起始点为2×1012 微球/ml，对应平均偶联密度为3×10-4 蛋白质分子/nm2，或在直径为2 µm的微球表面平均间距为57 nm。
- 试剂准备：
- 巯基-羧基定向偶联
注意：本方案适用于将含半胱氨酸的蛋白质偶联至羧基功能化的聚苯乙烯微球。首先使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）/N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化羧基，随后进行胺基修饰，再通过Sulfo-SMPB进行交联（图2）。
图2. 用于蛋白质与聚合物微球定向巯基-羧基偶联的交联策略。 羧基化的聚苯乙烯微球首先通过EDC活化，并与NHS反应形成半稳定的NHS酯。随后通过乙二胺进行胺基偶联，产生游离胺基，该胺基可与Sulfo-SMPB反应。经马来酰亚胺活化的微球即可与游离半胱氨酸反应，实现蛋白质的定向偶联。 请点击此处查看该图的放大版本。- 试剂准备：
- 配制PBS（100 mM磷酸钠，150 mM NaCl，pH 7.0），并进行高压灭菌。
- 在使用前立即配制TCEP（三(2-羧乙基)膦）的100倍储备液（0.5 M或287 mg/ml，溶于PBS）。
- 在使用前立即配制EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺）的10倍储备液（20 mM或4 mg/ml，溶于PBS）。
- 在使用前立即配制NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）的10倍储备液（50 mM或6 mg/ml，溶于PBS）。
- 在使用前立即配制Sulfo-SMPB的5倍储备液（10 mM或4.58 mg/ml，溶于dH2O）。
- 在使用前立即配制半胱氨酸的10倍储备液（500 mM或88 mg/ml，溶于PBS，pH 7.0）。
- 微球活化：
- 轻轻颠倒混匀微球悬液，并将所需体积的微球悬液（例如，12 ml）转移至含有1 ml无菌PBS（pH 7.0）的无菌1.5 ml离心管中。
- 轻柔吹打混匀以洗涤微球，随后在微量离心机中离心（2 min，16,000 × g）收集微球沉淀。
- 用移液器小心吸除上清液并弃去。
- 将微球沉淀重悬于1 ml新鲜无菌PBS中，重复洗涤一次。
- 将微球沉淀重悬于0.8 ml PBS中。
- 向微球悬液中加入100 µl 10倍EDC储备液（终浓度2 mM），并立即加入100 µl 10倍NHS储备液（终浓度5 mM）。
- 将微球悬液置于旋转摇床上，在25 °C孵育30分钟。
- 用1 ml PBS洗涤微球一次，并将微球重悬于0.8 ml新鲜无菌PBS中。
- 加入200 µl乙二胺，将微球悬液置于旋转摇床上，在25 °C孵育1小时。
- 用1 ml PBS洗涤微球一次，并将微球重悬于0.8 ml新鲜PBS中。
- 按照第1.1.2节所述，从第1.1.2.4节（使用Sulfo-SMPB活化微球）开始继续操作，并遵循第1.1节（巯基-胺定向偶联）中描述的其余步骤。蛋白质准备和偶联步骤应与第1.1节所述完全相同。
注意：使用本方案的典型偶联效率略低于第1.1节（约75%），因此应相应调整初始蛋白质浓度以达到相同的偶联密度。
- 试剂准备：
2. 偶联效率的测定
注意：测定蛋白质浓度时，使用 Bradford 试剂10 进行比色法检测，步骤如下：
- 轻轻倒置 Bradford 试剂，确保试剂均匀。
- 使用 10 mg/ml 的 BSA 储备液，在缓冲液中配制浓度范围为 0.1 至 1.5 mg/ml BSA 的蛋白质标准品。
- 向 96 孔板的各孔中加入 250 µl Bradford 试剂。为所有样品、蛋白质标准品和阴性对照（仅缓冲液）准备足够数量的孔。
- 向 96 孔板中的试剂中加入 5 µl 蛋白质样品（蛋白质标准品或用于阴性对照的缓冲液）。
- 将板置于摇床上，室温孵育 10 分钟。
- 使用酶标仪在 595 nm 处测定吸光度。
- 绘制 BSA 浓度与 A595 nm 的标准曲线，并利用该曲线确定初始样品和上清液样品中的蛋白质浓度。
- 按下式计算偶联蛋白的浓度：
![蛋白质偶联方程；[偶联] = [初始] - [上清液]；公式，数据分析方法。](/files/ftp_upload/53400/53400eq3.jpg "figure-protocol-5")
- 按下式计算偶联效率：
3. 使用珠偶联黏附素进行竞争实验
- 准备：
- 在竞争实验前一天，将 Hela 细胞以每毫升 150,000 个细胞的浓度接种到 24 孔板中，每孔 1 ml，使细胞在实验开始前达到约 80% 的融合度。
- 每个实验条件设置三个重复。包括阴性对照孔（竞争实验期间不添加细菌）、阳性对照孔（仅在竞争实验期间加入偶联了融合标签的对照珠）以及裂解对照孔（用于细胞毒性实验）。
- 用新鲜的 V. parahaemolyticus 菌落接种 5 ml 海水 LB（MLB）培养基，在 30 °C 条件下振荡过夜培养。
- 按照第 1 节（偶联）所述方法制备足量的珠偶联 MAM。每孔预留 100 ml 的 10 倍珠储存液。
- 竞争实验：
- 在进行竞争实验当天，测定细菌培养物的 OD600。
- 通过将细菌培养物稀释至无色 DMEM 培养基（不含添加剂，预热至 37 °C）中来制备感染培养基，其中含有 10% v/v 的珠悬浮液（黏附素偶联珠或对照珠），使 MOI 达到 10。每孔准备 1 ml，并为每个样品额外准备 10–20% 的过量体积。注意：对于上述条件（24 孔板、V. parahaemolyticus、MOI 10），每孔所需加入的过夜培养物体积（ml/ml）计算公式为 3/OD600。例如，1 ml 感染培养基通常包含 100 ml 珠悬浮液、少量细菌培养物，并用无色无添加 DMEM 补足至 1 ml。
- 吸除孔中旧培养基，向每孔加入 1 ml 预热至 37 °C 的无菌 PBS，洗涤培养的 Hela 细胞。
- 吸除 PBS，每孔加入 1 ml 感染培养基。同时设置对照组：加入含对照珠和细菌的溶液（阳性对照），或黏附素珠但无细菌的溶液（阴性对照），或含 0.1% Triton X-100 的 DMEM（裂解对照，仅在细胞毒性测定时需要）。
- 将培养板置于 37 °C 组织培养箱中孵育所需时间（例如，细胞毒性测定为 4 小时，黏附测定为 1 小时）。
注意：宿主细胞上的细菌黏附和细胞毒性均可作为抑制效果的检测指标。若细胞毒性和黏附测定的时间点一致，则可使用同一孔中的样品同时进行两项检测，因为细胞毒性通过培养上清液测定，而黏附实验使用剩余细胞层的样品。
- 细胞毒性测定：
- 在指定时间点（例如，感染后 4 小时），从每个 24 孔中重复取样三次，每次 200 ml，转移至 96 孔板中。
- 将 96 孔板以 1,500 × g 离心 5 分钟，然后从每孔转移 100 ml 至新的 96 孔板中。在新 96 孔板的空白孔中，每孔加入 100 ml 感染实验所用培养基，设三个重复（作为空白对照）。
- 使用乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒，按照制造商说明书进行 LDH 释放实验。
- 简要地，以 25 为增量计算所需试剂总量（例如，若需检测 62 个样品，则配制足够用于 75 个样品的试剂混合液等）。
- 例如，对于 100 个样品，将 11.25 ml 试剂 A 与 250 µl 试剂 B 混合。轻轻倒置混匀，切勿涡旋，以防产生气泡。
- 将混合液置于储液槽中，以便使用多通道移液器操作。每孔加入 100 µl 试剂混合液。
- 在室温下孵育培养板，并在 10、20、30 分钟时用酶标仪读取 490 nm 处的吸光度。
- 选择裂解对照样品吸光度较高但仍处于酶标仪线性范围内的数据集进行分析（通常为 2–3 吸光度单位）。
- 使用以下公式将结果表示为细胞毒性的百分比：
- 细菌黏附测定：
- 在指定时间点（例如，感染后 1 小时），移除细胞层上的培养基。
- 用无菌预热的 PBS 彻底洗涤细胞层（至少 3–4 次，每次 1 ml PBS），以去除未结合的细菌。
- 每孔加入 1 ml 无菌的 1% v/v PBS Triton X-100 溶液裂解宿主细胞，在 37 °C 孵育 5 分钟。
- 在将每孔内容物转移至独立的 1.5 ml 离心管前，用移液器反复吹打数次。用无菌 PBS 对样品进行 10 倍系列稀释（例如，取 100 ml 样品加入 900 ml PBS）。
- 取每种样品 100 ml 涂布于 MLB 琼脂平板上，使用涂布棒均匀涂布。根据细菌菌株和时间点优化所涂布的稀释倍数。注意：在所述实验条件下，105 或 106 倍稀释可获得合适的 CFU 数量。
- 在 37 °C 过夜培养平板，通过菌落计数确定细菌数量。
结果
该 副溶血性弧菌 黏附素 MAM7 包含七个串联的哺乳动物细胞进入（MCE）结构域，参与识别宿主细胞表面受体。我们使用偶联了重组纯化片段的聚苯乙烯微球，这些片段包含全部七个串联 MCE 结构域（MAM7）或仅第一个 MCE 结构域（MAM1），以检测这些材料与 副溶血性弧菌 用于宿主细胞结合以及评估这些材料作为黏附抑制剂的效果。Hela细胞被感染 副溶血性弧菌 菌株POR1，以及由此产生的细胞毒性 体外 感染在4小时后进行评估（图3). 用 0.1% Triton X-100 处理 Hela 细胞（阳性裂解对照）导致细胞完全裂解，而未感染细胞表现出极低水平的细胞毒性。 体外 未处理细胞感染POR1后导致极高水平的细胞裂解，而这种裂解可被MAM7偶联的微珠抑制，但MAM1偶联微珠或GST偶联对照微珠则无抑制作用（图3).
图3. 表征 副溶血性弧菌 在竞争实验中诱导上皮细胞的细胞毒性。 细胞经处理后 副溶血性弧菌 (V.p) 接种（以 (+) 表示）或无细菌（以 (-) 表示），在存在不同竞争物（comp.）的情况下进行实验，具体包括：无竞争物（-）、MAM7 包被的微珠（MAM7）、MAM1 包被的微珠（MAM1）或 GST 对照微珠（GST）。作为对照，细胞经 Triton X-100 处理（triton，裂解对照）或保持未感染状态（uninf）。感染 4 小时后乳酸脱氢酶（LDH）的释放量按第 3 节所述方法测定，结果按上述方法以 Triton 对照组（100%）和空白组（0%）进行归一化处理。数据为三次重复实验的平均值 ± 标准误（s.e.m）。 请点击此处查看此图的放大版本。
通过计数附着于未经处理的Hela细胞或经MAM7-、MAM1-或GST对照微珠孵育的细胞上的V. parahaemolyticus数量，结果显示MAM7-微珠能够竞争性抑制V. parahaemolyticus与宿主细胞表面受体的结合，而MAM1-或GST-对照微珠则无此作用（图4）。
图4. 竞争实验中细菌黏附特性的表征 Hela 细胞被感染了 副溶血性弧菌 POR2（V.p. +），在无（-）或存在竞争物质（comp.）的情况下，竞争物质包括：MAM7 琼脂糖 beads（MAM7）、MAM1 琼脂糖 beads（MAM1）或 GST 对照琼脂糖 beads（GST）。细菌黏附率在孵育 1 小时后测定，测定方法见第 3 部分。结果为三次重复实验的平均值 ± 标准误（s.e.m.）。各组均值（从左到右，CFU/ml）为 2.30106, 1.53105, 2.05106, 2.12106. 请点击此处以查看此图的放大版本。
将黏附素与荧光标记的微珠偶联，可制备出模拟细菌对宿主细胞黏附的材料，这类材料是细胞成像的有力工具（图5）。我们利用与荧光蓝色微珠偶联的MAM7，表征了MAM7介导的上皮细胞黏附过程。MAM7与宿主细胞的结合导致肌动蛋白重排并形成应力纤维，通过使用罗丹明-鬼笔环肽对F-肌动蛋白进行染色，可实现共聚焦成像观察（图5B）。
图5. 用于成像的荧光标记仿生微球的制备与使用。(A) 荧光蓝色仿生微球悬液（右侧试管，10倍浓缩液）与缓冲液对照（左侧试管）。(B) MAM7偶联微球与HeLa细胞结合后引起肌动蛋白重排及应力纤维形成。通过显微镜观察荧光蓝色微球的结合及由此产生的肌动蛋白应力纤维（红色，用罗丹明-鬼笔环肽染色）。标尺：10 μm。B图中的图像改编自Lim et al.1，根据知识共享署名许可协议转载。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本文中，我们描述了两种分别用于将含巯基的蛋白质偶联至胺基或羧基修饰的聚苯乙烯微球的实验方案。由于操作简便，优先推荐使用巯基-胺基偶联法；但根据所需微球的特性（如直径、荧光性质），可能无法使用胺基修饰的微球，因此我们提供了一种将羧基转化为胺基的方案，以使研究者在支架选择上具有最大的灵活性。尽管巯基-胺基和巯基-羧基偶联均可用于任何含半胱氨酸的蛋白质，但实现定向偶联（即，模拟表面展示，按蛋白质N端固定）则需要不含半胱氨酸的蛋白质，或以GST融合蛋白形式表达的蛋白质，或通过定点诱变引入单一末端半胱氨酸的蛋白质。若蛋白质内含多个活性半胱氨酸，则会导致随机固定，可能阻碍蛋白质功能。许多细菌黏附素天然不含半胱氨酸；对于其他蛋白质，可通过定点诱变去除这些残基，但需进行大量检测以确保突变体仍保持天然结构和功能。对于GST融合蛋白，可使用纯化的GST标签偶联微球作为合适的阴性对照。应避免使用未偶联的微球作为对照，因为它们往往更容易发生非特异性聚集或非特异性地黏附于细胞。使用仅含EDC的简化版方案1.2，也可将蛋白质偶联至羧基功能化的聚合物微球，但此时偶联通过蛋白质中的伯胺进行，因此不能保证定向偶联。
作为还原剂，TCEP 不得替换为其他市售且常用的还原剂，例如二硫苏糖醇（DTT）或2-巯基乙醇（BME），因为这些试剂所含的巯基会在巯基-马来酰亚胺偶联步骤中与蛋白质偶联发生竞争。PBS 可以替换为其他缓冲液，但需注意以下事项：缓冲液中不得含有伯胺（因此含 Tris 的缓冲液不适用）；使用盐浓度极低（< 10 mM）的缓冲液会导致微珠聚集，也应避免。蛋白质纯度在此实验过程中也是一个需要重点考虑的因素，为获得高质量的数据，应使用高纯度的蛋白质。我们通常采用多步纯化方法，至少包括亲和层析和凝胶过滤层析步骤，在某些情况下还会增加离子交换层析作为第三步。因此，用于偶联的蛋白质纯度通常在90%或以上，通过SDS-PAGE检测判断。
建议在初始反应混合物以及反应完成后的上清液中分别测定蛋白质浓度。这有助于确定磁珠偶联蛋白的表观浓度，进而计算偶联密度。同时测定这两个数值还可用于计算偶联效率。在后续反应中配制初始蛋白溶液时，可据此调整以达到目标终浓度和偶联密度。在偶联反应前后，使用Bradford试剂测定蛋白质浓度尤为合适，因为在所用浓度下，反应体系中的任何组分均不会干扰染料复合物的形成。若需使用较低的蛋白浓度，则可能需要采用更灵敏的检测方法，但必须注意所选方法应与偶联反应体系中的成分相容。建议使用新鲜配制的试剂，并小心操作粉末状试剂。例如，将试剂存放在密封容器中，并使用硅胶珠以防止吸湿，因为试剂质量会影响偶联效率。如果偶联效率低于预期，可能的补救措施包括提高初始磁珠和蛋白浓度。若使用较高浓度的蛋白或磁珠，则需按比例增加偶联试剂的浓度，以确保足够的摩尔过量。通常，调整磁珠或蛋白浓度比延长反应时间更有利于优化实验条件。由于磁珠偶联的操作流程较长，我们通常会一次性制备大量材料。悬浮液可分装后在液氮中速冻，并于 -20 °C 保存数月。解冻后的分装样品不应再次冷冻，应置于 4 °C 保存并在 1–2 天内使用完毕。然而，具体保存条件可能因所用蛋白的性质和稳定性而异，建议先用小批量样品进行测试。
偶联有黏附素的微珠可用于多种应用，如下所述。本方案描述了一种常用于检测细菌对宿主细胞黏附及病原体介导的细胞毒性的抑制作用的实验方法。该实验通常用于检测微珠偶联的MAMs是否能够竞争性地抑制食源性病原体Vibrio parahaemolyticus对Hela上皮细胞的感染，其检测指标可为细菌对宿主细胞黏附的减少或细胞毒性降低。在这两种情况下，样品制备和竞争性抑制实验均遵循相同的方案。根据检测指标的不同，使用不同的V. parahaemolyticus菌株：细胞毒性菌株POR1用于细胞毒性检测，而非细胞毒性菌株POR2用于细菌黏附检测，因为细胞死亡和细胞脱落会影响黏附细菌的定量分析。
最初，竞争实验采用分步方案进行，即先将宿主细胞与微珠预孵育，然后再加入细菌。对于副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）以及所使用的微珠规格（偶联MAM7的2 μm微珠），微珠和细菌可同时加入，而不会影响最终的细胞毒性结果。即，在此实验条件下，微珠在宿主细胞结合位点上可有效竞争过细菌。根据所用细菌种类和微珠几何形状的不同，将微珠黏附与细菌感染分为两个独立步骤可能具有必要性。例如，在感染非运动性细菌时，通常在加入感染培养基后对培养板进行离心。然而，应避免对含有微珠悬浮液的培养板进行离心，因为这会导致微珠在细胞层上的分布极不均匀。若使用较小粒径的微珠，其在细胞表面沉降所需时间更长，此时应在感染前预留足够时间以确保微珠充分黏附。当以细菌黏附作为检测指标时，应选择宿主细胞尚未被感染菌株显著损伤的时间点取样，因为细胞脱落和裂解会影响黏附细菌的定量准确性。
除了通过稀释平板法计数细菌黏附外，样品也可进行成像处理（图5）。在此情况下，组织培养细胞应接种于玻璃盖玻片上，而非直接接种于孔板中。此外，可使用荧光微球以及表达荧光蛋白的细菌，并结合感染特异性的宿主细胞标记物。例如，竞争实验通常采用荧光红色的罗丹明-鬼笔环肽对宿主细胞的肌动蛋白细胞骨架进行染色，以评估感染引起的形态学变化，同时结合荧光蓝色微球和荧光绿色（表达GFP或经SYTO18染色）的细菌。
一系列与微珠偶联的黏附素，包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的 FnBPA、化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的 F1 FUD 以及副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的 MAM，已被用作仿生材料来研究黏附过程、黏附抑制作用以及黏附在病原体介导的细胞毒性中的作用1, 7, 8。该方法的优势之一在于黏附事件易于观察，因为作为支架的聚合物微珠具有多种颜色可供选择（例如，蓝色、荧光红色、绿色、橙色）。因此，可避免对蛋白质进行直接标记，而此类标记可能干扰其功能。此外，表面偶联的方式模拟了黏附素在细菌表面的多价展示状态，因而相较于可溶性蛋白，更接近生理条件下的真实构象。
与使用完整细菌或细菌突变体的研究相比，微珠方法避免了与细菌生长相关的问题。例如，长期（例如使用完整细菌进行细菌黏附宿主细胞的过夜（O/N）研究常受到细菌生长伴随现象的干扰——培养基酸化和营养耗竭会对宿主细胞产生负面影响，而细菌的复制最终会降低成像质量。
最近，偶联了黏附素的微珠已被进一步用作亲和纯化工具，以分离和鉴定细菌黏附后参与宿主细胞下游信号转导过程的宿主因子。V. parahaemolyticus 的 MAM7 通过与宿主细胞膜中的磷脂酸结合，可触发 RhoA 的活化以及肌动蛋白的重排1, 3。目前正利用 MAM 偶联的微珠来纯化并鉴定因 MAM 与宿主细胞结合而组装形成的信号转导平台中的相关蛋白。由于微珠可通过短暂离心步骤轻松地从上清液中分离，且目标蛋白为共价偶联，因此该方法可有效分离污染物蛋白，富集目标蛋白复合物，所得产物可用于蛋白质组学或蛋白质印迹等后续实验。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Krachler 团队成员对本文手稿的审阅。DHS、DV 和 AMK 获得了生物技术和生物科学研究委员会（BB/L007916/1）的资助，FA 获得了伊拉克共和国高等教育与科学研究部奖学金的资助，NPS 获得了 CONICYT 奖学金的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 三(2-羧乙基)膦 (TCEP) | Sigma | 646547 | 危险；腐蚀性 可购买现成溶液或新鲜配制 |
| 磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯 (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | 危险；有毒 |
| L-半胱氨酸 | Sigma | 30089 | 危险；有毒 |
| 氨基修饰聚苯乙烯乳胶微球，荧光蓝色 – 水悬浮液，平均粒径 2.0 μm | Sigma | L0280 | 有害； 可提供多种不同粒径和颜色的替代产品 |
| 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺 (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
| N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
| 羧基修饰聚苯乙烯微球 | Sigma | CLB9 | 有害； 可提供多种不同粒径和颜色的替代产品 |
| 乙二胺 | Sigma | E26266 | 危险；易燃、腐蚀性、有毒、致敏性 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Promega | W3841 | |
| Bradford 试剂 | Sigma | B6916 | 危险；腐蚀性和有毒 |
| Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 - 高糖 - 含 4,500 mg/L 葡萄糖和碳酸氢钠，不含 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和酚红，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养 | Sigma | D1145 | 用于感染实验 |
| DMEM | Sigma | D6429 | 用于培养宿主细胞的维持 |
| 胎牛血清，热灭活 | Sigma | F9665 | 组织培养基的添加物 |
| 青霉素-链霉素 - 稳定化溶液，含 10,000 单位青霉素和 10 mg 链霉素/mL，经无菌过滤，BioReagent，适用于细胞培养 | Sigma | F9665 | 组织培养基的添加物 |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| LDH 细胞毒性检测试剂盒 | Takara | MK401 | |
| 塑料耗材 | |||
| 试剂储液槽 (25ml) | SLS | F267660 | |
| 24 孔板 | Greiner | 662160 | |
| 96 孔板 | Greiner | 655182 | |
| 设备 | |||
| 血细胞计数板 | |||
| 微量离心机 | |||
| 酶标仪 | |||
| 组织培养设施 | |||
| 多通道移液器 |
参考文献
- Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathog. 10 (9), e1004421(2014).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).
- Krachler, A. M., Orth, K. Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands. J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).
- Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules. Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).
- Bingham, R. J., et al. Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).
- Ensenberger, M. G., et al. Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin. J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).
- Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function. PLoS One. 8 (11), e81216(2013).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent. Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).
- Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel. Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
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