皮层下的多功能小鼠模型白质行程轴索变性和白质神经生物学的研究

摘要

在这里，我们提出了通过局部注射不可逆的内皮一氧化氮合酶 （eNOS） 抑制剂 （L-Nio） 在小鼠白质中产生局灶性卒中的方法。介绍了两种立体定向变体，逆行神经元示踪以及新鲜组织标记和解剖，它们扩展了该技术的潜在应用。

摘要

中风影响白质占的临床冲程演示高达25％，在费率可能5-10倍更大默默地发生，并且显著血管性痴呆的发展有助于。存在焦白质中风的几个型号，这缺乏适当的模式阻碍了参与这类中风后损伤反应和修复neurobiologic机制的理解。其他皮层下中风模型的主要限制是，它们不灶性限制梗塞的白质或已经主要在非鼠物种得到验证。这限制应用各种各样的鼠研究工具来研究白质中风的神经生物学的能力。在这里，我们提出了一个方法，为可靠的生产使用的是不可逆的eNOS抑制剂局部注射鼠白质的焦点中风。我们还提出对一般协议，包括两个独特的立体几个变化变型中，逆行神经追踪，以及新鲜组织标记和解剖，大大扩大该技术的潜在应用。这些变化允许多种方法来分析的行程这个共同的和充分研究形式neurobiologic影响。

引言

累及皮质下白质的卒中是一种常见的临床疾病，在美国每年占临床卒中的25%¹。白质的缺血性损伤也以显着更高的速率悄无声息地发生，并导致血管性痴呆的发展 ^2,3。目前，患有这种形式的脑缺血的患者几乎没有任何治疗选择。尽管这种疾病具有临床重要性，但很少有临床相关的动物模型存在 ^4,5。

该方案的目标是在小鼠白质内产生局灶性缺血病变。这种人类疾病的小鼠模型允许具体研究轴突损伤对中风的反应以及白质的细胞成分，即少突胶质细胞和星形胶质细胞以及轴突如何响应和修复中风后。

以前的报告描述了一种使用内皮素-1 （ET-1） ⁶ 的皮质下白质卒中模型，该模型与此处描述的模型相似。对实验方案进行了几项关键更改，因此该模型的潜在用途已扩大 ^7,8。该协议提供了一种可靠且可修改的策略，可在小鼠脑白质内产生局灶性中风。

该模型的主要优点是使用了化学内皮一氧化氮合酶 （eNOS） 抑制剂 N（5）-（1）-亚氨基乙基-L-鸟氨酸盐酸盐 （L-Nio） ⁹，对白质细胞元件没有已知的旁分泌影响，这是使用内皮素-1 的模型的并发症 ¹⁰。此外，小鼠白质的立体定向靶向允许使用任何种类的转基因或敲除菌株，大大扩展了确定中风对脑白质影响的可用工具。在这里，描述了该技术的两种变体，并展示了一些可用于增强对中风后轴突和白质损伤和修复的理解的其他变体。

方案

在这个协议中使用的动物是按照由加州大学洛杉矶分校的动物护理和使用委员会的批准大学的程序进行。

注:确定目标人群小鼠开始。在以前的研究中，只有雄性野生型C57 / BL6小鼠已被使用，但是各种转基因或基因敲除小鼠也可以使用。注意，立体定向坐标基于C57 / BL6解剖。建议每个用户最初验证中风白质的定位。

1.白质行程感应 - 内侧斜角方法

1. 通过使用0.5毫米毛细管使得远端直径为15-25微米¹¹之间制备拉玻璃吸管开始。
2. 在无菌的0.9％生理盐水27.4毫克/毫升（130μM） - 制备L-NiO的无菌10微升等分试样（（1）-iminoethyl -L-鸟氨酸盐酸N（5））。
3. 预填拉玻璃吸管与由固定用玻璃吸管的小体积的L-仁王（2-5微升）至管连接到真空管线。躺在工作台上吸管平并插入拔出端插入L-仁王解决方案。
   1. 直到吸管0.5毫米部的至少2mm填充应用真空。关闭真空和撤回移液器。将它放在一旁，直到步骤1.12。
4. 鼠标放置在感应腔和诱导使用标准的32％异氟烷鼠标麻醉通过蒸发器流入（5升/分钟吸入用5升/分钟的氧气和0.5升/分钟N _2），持续1分钟或直至深麻醉。鼠标转移到配备有立体显微镜立体定位装置。提供一种使用32％异氟烷维持麻醉通过蒸发器流入（2L /分吸入用5升/分钟的氧气和0.5升/分钟N _2）和一鼻锥体。检查麻醉深度与脚趾捏。
5. 注射臂调整到36°。
6. 阿菲XA拉玻璃吸管持有人一个低量的压力喷射系统的末端，并将其连接到立体设置的注入手臂。
7. 涂抹麻醉动物用凡士林和地点人工泪液软膏超过两只眼睛胡须。通过将无菌悬垂在动物的头用5-10厘米开幕的头准备一个无菌手术领域。剃皮毛覆颅骨准备aspetic手术的表面。清洁交替优碘和70％酒精棉签头皮。
8. 请用无菌剪刀罚款1.5厘米的头皮正中切口，显露颅骨表面。干后用消毒棉签头骨和1-3X的放大倍率用显微镜立体，用无菌微点工具可以删除任何覆盖骨膜组织。
9. 标记为前囟门用细点标记的参考点。
10. 使用无菌细STIP手术钻头钻2毫米ellipitical开颅手术0;在后方前囟门开始，向前延伸刚出中线。去除骨碎片和上覆的软组织，以便大脑皮层可以可视化。
11. 保持手术视野和皮质表面湿润通过间歇应用无菌生理盐水滴。
12. 贴上拉玻璃吸管立体定向仪的注射器手臂。对准前囟吸管的远端和零的立体定向坐标。
13. 前进移液器到第一前/后（A / P）和内侧/外侧（M / L） 表1坐标提供。
14. 推进吸管皮质表面和零背/腹（D / V）的测量。
15. 慢慢通过吸管进入脑，直到达到表1的第一D / V坐标。
16. 使用低容量压力喷射系统20毫秒脉冲设置为20磅，注入100 NL L-仁王的入脑，并等待5分钟，以防止反流了吸管轨道。
    1. 在立体定向显微镜的目镜和3X的倍率使用校准掩模版。
    2. 因此，置换共有0.100毫米^3（0.5毫米的长度在0.5毫米直径的移液管中，对应于100 NL）从拉玻璃吸管为每组坐标。通过使用划板，测量和标准化，因为每个设置取决于所使用的放大率和体重秤。
    3. 对于每一个在注射过程中准确体积测量，接近与显微镜倾斜移液器从侧面使空气流体弯月面具有矢状图。弯液面应该出现在这两个吸移管的内壁和外壁的同一焦平面。
17. 慢慢抽出吸管和重复步骤1.13-1.16.3在第二和第三组在表1中提供的坐标。
18. 最后一次注射后，取出吸管，并放置足够的骨蜡填补了开颅手术部位。一个pproximate头皮伤口的边缘，并与皮肤粘合剂结合。
19. 注入0.1毫升0.5％麻卡因成使用无菌​​地下30针，以防止以防止与头皮切口相关联的局部疼痛的伤口边缘。
20. 返回动物壳体和供应术后抗生素（0.48毫克/毫升复方新诺明，或0.5毫克/毫升左氧氟沙星）的饮用水5天。

2.白质行程感应 - 后路斜角方法

1. 执行步骤1.1-1.12为在内侧倾斜的方式协议中，除了调整立体设置面向从前到后45度的注入手臂。
2. 前进移液器向第一A / P和M / L的坐标在表2中提供。
3. 完成剩余的步骤1.14-1.20作为在横向成角度的方法的协议。

3.逆行神经标签

1. 制备无菌的10在0.9％的生理盐水54.8毫克/毫升的L-仁王的微升等分试样。
2. 制备20％Fluororuby（或20％的生物素化葡聚糖胺或2％荧光金）的0.9％生理盐水的无菌等分试样。
3. 稀释一起1:1 27.4毫克/毫升的L- NiO和10％Fluororuby的最终浓度。
4. 步骤1.3-1.23执行行程协议如上。
5. 如前所述⁸灌注固定，cryosectioning和显微可视化组织切片的原生荧光示踪剂。

4.组织处理的免疫

1. 在适当的中风后间隔时间从3小时到中风后14天内，通过安乐死过量的异氟醚或当地IACUC小鼠批准的程序。
2. 使用倾斜的剪刀打开胸腔，并插入一个23政蝴蝶针进入左心室。
3. 放置在用细剪刀，以允许灌注流体流出轨道右心房的小切口。
4. 在室温为10毫升/分钟的速率用30-40毫升冷的磷酸盐缓冲盐水后30-40毫升冷的4％多聚甲醛的Transcardially灌注。
5. 斩首鼠标和使用无菌剪刀向后打开颅骨取出大脑，然后轻轻地用刮勺除去覆颅骨，将脑入冷的4％PFA中24小时，然后转移到30％蔗糖的PBS中48小时。
6. 制备40使用低温恒温器微米浮动切片，并如前所述^6-8执行抗体的处理。在这项研究中，使用下列抗体:兔抗神经丝200（1:500稀释度）;兔抗波形蛋白（1:500）;山羊抗GFAP（1:500）;兔抗伊巴-1（1:1000）。

5.组织处理的蛋白质或RNA分析

1. 在适当的中风后间隔时间从3小时到中风后14天，异氟醚通过安乐死过量或当地IACUC批准的程序。
2. 斩首用无菌剪刀向后打开颅骨鼠标和取出大脑，然后轻轻地用锅铲除去覆头骨。
3. 在大脑的前面插入一个无菌4毫米刮刀切断嗅球和视神经。轻轻抬起脑出颅骨并放入冰冷的夹层缓冲液（1×Hank氏平衡盐溶液，25mM的HEPES-KOH，pH 7.4的35毫摩尔葡萄糖，4mM的碳酸氢钠，和0.01毫克/毫升环己酰胺）。
4. 用脑块，并育新刀片，制成含有中风并放入冷夹层缓冲器2-3毫米的板坯。
5. 在解剖显微镜下，确定在所注入的半球白质底层运动皮层。在较长的脑卒中后的时间间隔，该区域可在视觉上由局灶性坏死和髓鞘苍白鉴定。
   注:在早期中风后的时间间隔，L-仁王的注射1微升10％混合固绿可以让中风的视觉识别（ 图4A）。
6. 在解剖显微镜下的指导，并用新鲜的手术刀，小心解剖的白质含有行程，由任一坚牢绿标签或组织损失确定的区域。根据需要取出覆皮层和纹状体底层。

结果

使用提出的模型，白质底层前肢感觉运动皮层能够可靠地针对性。此化学诱导中风模型产生焦轴突和髓磷脂损失，星形胶质细胞增生，和小神经胶质细胞（ 图1），如在人类腔隙性脑梗死通常看到。通过使用三次注射，临床有用的模型建立与前肢运动任务⁷月初^，障碍和脑组织经验，一个小而显著部分缺血的免疫，免疫和生化技术是在定量层面可行，可靠。在中风诱导后早期时间点（小时），在轴突分子组织的变化可以被检测（ 图2）。在7天，行程完成其成熟轴索损（ 图1a）的限定区。在我们的手中，这种方法产生的焦白质病变approximately 800微米水平直径和延伸沿胼胝体的前后轴约1毫米。由7天，平均总梗塞大小大约0.200毫米³和将具有椭圆形状。我们观察到约10％的变异笔触大小两种动物之间和部分，取决于其中有椭圆形的部分之间发生。在梗死面积进一步增长很少见到超过7天。

讨论

已经描述了若干皮层下行程的前模型，包括内皮素-1的焦点注射进入内囊，皮层下白质和纹状体在大鼠^12-14和鼠标^6,15。更近的小焦点冲程模型已经利用在颈动脉¹⁶胆固醇微栓子注射和单个穿透动脉¹⁷的光化学闭塞。每个模型都有有利有弊^5。目前描述的模型产生具有许多模仿人类腔隙性脑梗塞，包括轴突异常和损失，髓鞘退化，焦距坏死核心和临床赤字是最小的，并演示了较快的恢复依赖于⁷年龄特点的病变。鼠靶向脑白质允许多种，可以支持机制研究遗传操作的。

关键该协议的步骤包括利用立体定向精确坐标。由于鼠类白质体积小和应变变化应变，可以根据使用鼠标的年龄和应变需要的立体坐标修订。注射的体积的控制也很重要，因为这是直接相关的梗塞的大小。注射较大将产生上覆皮层和纹状体底层染指大招。

使用此处描述的方法的ET-1的焦点注射已经报道，但内皮素-1显示出具有对少突胶质细胞的分化和成熟^10,18混杂中风后白质生物学...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
L-N5-（1-亚氨基乙基）鸟氨酸，二盐酸盐	Calbiochem	400600-20MG
异氟醚	Phoenix Pharmaceutical， Inc.	NDC 57319-559-06
毛细管	世界精密仪器	50-821-807
Picospritzer	派克仪器	Picospritzer II
立体定向设置	Kent Scientific	KSC51725
移液器拉拔器	KOPF	型号 720
立体显微镜 SZ51	奥林巴斯	88-124
精细剪刀	Fine Scientific Tools	14084-08
镊子	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
弯曲镊子	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
钝器解剖工具	Fine Scientific Tools	10066-15
钻头	Dremel	8220-1/28
	钻头 Fine科学工具	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
Marcaine	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
甲氧苄啶-磺胺甲酯	STI 药房	NDC 54879-007-16
荧光红宝石	荧光染料公司	30 毫克
多聚甲醛	Fisher	O4042-500
蔗糖	Fisher	BP220-10
低温恒温器	Leica CM3050 S
玻璃滑片	Fisher	12-544-7
Fast Green	Sigma	F7252-5G
解剖显微镜	尼康	SMZ1500
23 G 蝶针	Fisher	14-840-35
10x Hank's 平衡盐溶液	Life Technologies	14065056
1 M HEPES-KOH，pH 7.4	Affymetrix	16924
D-葡萄糖	Sigma	G8270
碳酸氢钠	Sigma	S5761
环己酰胺	Sigma	01810