一种用于研究轴突变性及白质神经生物学的多功能小鼠皮层下白质卒中模型

摘要

本文介绍了一种通过局部注射不可逆的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）抑制剂（L-Nio）在小鼠白质中诱导局灶性脑卒中的方法。文中展示了两种立体定位手术变体、逆行神经元示踪、新鲜组织标记与分离技术，拓展了该技术的潜在应用范围。

摘要

影响白质的卒中占临床卒中表现的25%，其无症状发生率可能高出5至10倍，并对血管性痴呆的发展具有显著贡献。目前存在的局灶性白质卒中模型较少，缺乏合适的模型严重阻碍了对这类卒中后损伤反应及修复过程中涉及的神经生物学机制的理解。其他皮层下卒中模型的主要局限在于无法将梗死灶严格限制在白质区域内，或主要在非小鼠物种中得到验证。这限制了利用丰富的小鼠研究工具来探索白质卒中神经生物学的能力。本文介绍了一种通过局部注射不可逆eNOS抑制剂，可靠地在小鼠白质中诱导局灶性卒中的方法。我们还提供了该通用方案的多种变体，包括两种独特的立体定位变异方法、逆行神经元示踪，以及新鲜组织标记与分离技术，这些显著拓展了该技术的潜在应用范围。这些变体使得研究人员能够从多个角度分析这种常见但研究不足的卒中形式所引起的神经生物学效应。

引言

影响皮层下白质的卒中是一种常见的临床病症，每年在美国占临床卒中病例的近25%¹。白质的缺血性损伤也以更高的频率无症状发生，并促进血管性痴呆的发展^2,3。目前，此类脑缺血患者几乎没有任何有效的治疗选择。尽管该疾病具有重要的临床意义，但目前仍缺乏与临床情况相关的动物模型^4,5。

本实验方案的目标是在小鼠的白质中制造一个局灶性缺血性损伤。这种模拟人类疾病的小鼠模型可用于专门研究轴突在中风后的损伤反应，以及白质中的细胞成分（即少突胶质细胞、星形胶质细胞和轴突）对中风的响应及修复过程。

既往研究已描述了一种使用内皮素-1（ET-1）⁶建立皮层下白质脑卒中模型的方法，该方法与本文所述模型相似。通过对实验方案进行若干关键性改进，此模型的潜在应用范围得以拓展^7,8。本方案提供了一种可靠且可调节的策略，用于在小鼠脑白质中诱导局灶性脑卒中。

该模型的主要优势在于使用了一种化学性内皮型一氧化氮合酶（eNOS）抑制剂——N(5)-(1)-亚氨基乙基-L-鸟氨酸盐酸盐（L-Nio）⁹，其对白质中细胞成分无已知的旁分泌作用，而使用内皮素-1的模型曾存在此类并发症¹⁰。此外，通过立体定位技术靶向小鼠白质，可利用各种转基因或基因敲除品系，极大地扩展了研究中风对脑白质影响的可用工具。本文描述了该技术的两种变体，并展示了可用于增强对中风后轴突及白质损伤与修复机制理解的其他可选方法。

方案

本方案中动物的使用已按照加州大学洛杉矶分校动物护理和使用委员会批准的程序进行。

注意：首先确定目标小鼠种群。在以往的研究中，仅使用了雄性野生型 C57/Bl6 小鼠，但也可使用各种转基因或基因敲除小鼠。请注意，立体定位坐标是基于 C57/Bl6 的解剖结构。建议每位使用者最初验证脑卒中定位是否准确到达白质区域。

1. 白质脑卒中诱导——内侧斜角入路

1. 首先使用0.5 mm毛细管制备拉制玻璃移液管，使其远端直径在15–25 µm之间 ¹¹.
2. 在无菌0.9%生理盐水中配制L-Nio（N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl）溶液，浓度为27.4 mg/ml（130 µM），分装为10 µl无菌 aliquot。
3. 用连接至真空管线的管路将拉制好的玻璃移液管末端浸入 L-Nio 溶液中，吸取少量 L-Nio（2–5 µl）。将移液管平放在实验台面上完成预填充。
   1. 抽真空，直至移液管0.5 mm部分至少有2 mm被填充。关闭真空，取出移液管，放置一旁待用，直至步骤1.12。
4. 将小鼠放入诱导室，使用异氟烷蒸发器以标准的32%异氟烷（5 L/min异氟烷与5 L/min氧气混合吸入，另加0.5 L/min氮气）诱导小鼠麻醉₂）1 分钟，或直至深度麻醉。将小鼠转移至配备立体定位显微镜的立体定位仪。通过蒸发器提供维持麻醉，使用 32% 异氟烷（以 2 L/min 吸入，氧气流量为 5 L/min，氮气流量为 0.5 L/min）₂）和一个鼻罩。通过夹捏脚趾检查麻醉深度。 
5. 将注射臂调整至36°。
6. 将拉制的玻璃微量移液管固定器连接至低容量压力注射系统的远端，并将其安装到立体定位装置的注射臂上。
7. 用凡士林涂抹麻醉动物的胡须，并在双眼上涂抹人工泪膏。通过在动物头部覆盖无菌手术巾，留出5-10 cm的无菌手术区域，以准备无菌手术场地。 头部上方3厘米切口。 通过剃除颅骨上方的毛发准备无菌手术区域。使用聚维酮碘和70%酒精棉片交替擦拭清洁头皮。
8. 用无菌精细剪刀在颅顶正中做一条1.5 cm的切口，暴露颅骨表面。用无菌棉签擦干颅骨，并在体视显微镜1–3倍放大下，使用无菌微尖工具清除覆盖的骨膜组织。
9. 使用细头标记笔标记前囟作为参考点。
10. 使用无菌精细 stip 外科钻头钻出一个 2 mm 椭圆形颅骨开窗 从人字缝后方开始，沿中线左侧向前延伸。清除骨碎片及覆盖的软组织，以暴露大脑皮层。
11. 通过间歇性滴加无菌生理盐水，保持手术区域和皮层表面湿润。
12. 将拉制的玻璃移液管固定在立体定位仪的注射臂上。将移液管末端与前囟对齐，并将立体定位坐标归零。
13. 将移液管推进至提供的第一组前后（A/P）和内外（M/L）坐标位置 表1.
14. 将移液管推进至皮层表面，并将背腹（D/V）测量值归零。
15. 缓慢将移液管插入脑内，直至到达第一个背腹向（D/V）坐标位置 表1.
16. 使用低体积压力注射系统，设定为20 psi、20毫秒脉冲，向脑内注射100 nl L-Nio，随后等待5分钟，以防止液体沿移液管路径回流。
    1. 使用体视显微镜目镜中已校准的测微尺，并将放大倍数设为3倍。
    2. 相应地，总共位移 0.100 mm³ （从拉制的玻璃移液管中取出每组坐标对应的0.5 mm长度，直径为0.5 mm，相当于100 nl）。使用目镜测微尺进行测量并标准化，因为每套装置会因使用的放大倍数和标尺不同而有所差异。
    3. 为在每次注射过程中准确测量体积，应从侧面通过显微镜观察倾斜的移液管，使气-液弯月面呈矢状面视图。弯月面应与移液管内壁和外壁处于相同的焦平面。
17. 缓慢抽出移液器，并在提供的第二组和第三组坐标处重复步骤 1.13–1.16.3。 表1.
18. 末次注射后，移除移液管，并放置足量骨蜡以填满颅骨开孔部位。拉拢头皮切口边缘，并用皮肤黏合剂固定。
19. 使用无菌30 G针头将0.1 ml 0.5%布比卡因注入伤口边缘，以预防 以预防与头皮切口相关的局部疼痛。
20. 将动物放回饲养环境，并给予术后抗生素（0.48 mg/ml 甲氧苄啶-磺胺甲噁唑，或 0.5 mg/ml 左氧氟沙星）溶于饮水中连续给予5天。

2. 白质脑卒中诱导——后方倾斜入路

1. 按照内侧倾斜入路方案中的步骤1.1-1.12进行操作，但需将立体定位装置的注射臂调整为从前向后倾斜45度。
2. 将移液管推进至表2中提供的第一个前后（A/P）和内侧/外侧（M/L）坐标位置。
3. 按照外侧倾斜入路方案完成剩余的步骤1.14-1.20。

3. 逆行性神经元标记

1. 在0.9%生理盐水中制备浓度为54.8 mg/ml的L-Nio无菌10 µl分装液。
2. 在0.9%生理盐水中制备20% Fluororuby（或20%生物素化葡聚糖胺，或2% Fluorogold）的无菌分装液。
3. 将上述两种溶液等体积混合，得到终浓度为27.4 mg/ml的L-Nio和10% Fluororuby的混合液。
4. 按照前述步骤1.3–1.23执行脑卒中实验方案。
5. 通过灌注固定、冷冻切片及显微镜观察，对组织切片中天然荧光示踪剂进行可视化检测，方法如先前所述⁸。

4. 免疫荧光组织处理

1. 在卒中后适当的时间间隔（从卒中后3小时至14天），通过异氟烷过量或当地IACUC批准的程序处死小鼠。
2. 使用斜角剪刀打开胸腔，并将23 G蝶形针插入左心室。
3. 使用精细剪刀在右心房做一小切口，以提供灌注液的流出通道。
4. 以10 ml/min的流速在室温下经心脏灌注30–40 ml冷磷酸盐缓冲盐水，随后灌注30–40 ml冷的4%多聚甲醛。
5. 将小鼠断头，使用无菌剪刀从后方剪开颅骨，再用解剖刀轻轻移除覆盖的颅骨，取出脑组织并置于冷的4%多聚甲醛中固定24小时，然后转移至含30%蔗糖的PBS溶液中48小时。
6. 使用冷冻切片机制备40微米厚的游离切片，并按照先前描述的方法进行抗体处理^6-8。本研究中使用以下抗体：兔抗神经丝蛋白200（1:500稀释）；兔抗波形蛋白（1:500）；山羊抗GFAP（1:500）；兔抗Iba-1（1:1,000）。

5. 蛋白质或RNA分析的组织处理

1. 在卒中后3小时至14天之间的适当时间点，通过异氟烷过量或当地IACUC批准的程序实施安乐死。
2. 断头取鼠脑，使用无菌剪刀从颅骨后部剪开颅腔，然后用解剖刀片轻轻移除覆盖的颅骨。
3. 将无菌的4 mm解剖刀片插入脑前部，切断嗅球和视神经。轻柔地将脑组织从颅腔中取出，并置于冰冻的解剖缓冲液中（1×Hank's平衡盐溶液，25 mM HEPES-KOH，pH 7.4，35 mM葡萄糖，4 mM碳酸氢钠，以及0.01 mg/ml环己酰亚胺）。
4. 使用脑组织切块模具和新的无菌剃须刀片，制备包含卒中区域的2–3 mm厚脑片，并将其放入冷的解剖缓冲液中。
5. 在解剖显微镜下，识别注射侧半球运动皮层下方的白质区域。在较晚的卒中后时间点，该区域可通过局灶性坏死和髓鞘苍白进行肉眼识别。
   注意：在较早的卒中后时间点，可通过注射与1 µl 10%快绿混合的L-Nio来实现卒中区域的可视化识别（图4A）。
6. 在解剖显微镜引导下，使用新的手术刀片仔细分离含有卒中病变的白质区域，该区域可通过快绿标记或组织缺失来识别。根据需要去除上方的皮层和下方的纹状体。

结果

利用所展示的模型，可可靠地靶向前肢感觉运动皮层下方的白质。该化学诱导性卒中模型可产生局灶性轴突和髓鞘丢失、星形胶质细胞增生以及小胶质细胞活化（图1），这些特征与人类腔隙性脑梗死中典型表现一致。通过三次注射，可建立具有临床实用价值的模型，表现为前肢运动任务的早期功能障碍⁷，且仅有小部分脑组织发生缺血，但该模型适用于免疫组织化学、免疫荧光及生物化学技术，并可在定量水平上实现可行性和可重复性。在卒中诱导后的早期时间点（小时级），即可检测到轴突分子结构的改变（图2）。至第7天，卒中病灶完全成熟，形成一个界限明确的轴突丢失区域（图1a）。在我们的操作中，该方法产生的局灶性白质损伤水平直径约为800 µm，沿胼胝体前后轴延伸约1 mm。至第7天，平均总梗死体积约为0.200 mm³，呈椭圆形。我们观察到，由于切片位置在椭圆内的不同，动物间及切片间的梗死体积变异率约为10%。超过7天后，梗死范围进一步扩大的情况很少见。

讨论

已有多种既往的皮层下卒中模型被报道，包括在大鼠^12-14和小鼠^6,15的内囊、皮层下白质和纹状体中进行内皮素-1的局部注射。近期的一些小范围局灶性卒中模型则采用颈动脉内注射胆固醇微栓塞¹⁶，或单根穿支小动脉的光化学血栓闭塞¹⁷。这些模型各自具有优缺点⁵。本文所描述的模型所产生的病灶具备多种类似人类腔隙性梗死的特征，包括轴突异常与丢失、髓鞘降解、局灶性坏死核心，以及轻微的临床功能缺损，且其恢复速度相对较快，与年龄相关⁷。针对小鼠白质建立卒中模型，可支持多种遗传学操作，有助于开展机制性研究。

该实验方案的关键步骤包括使用精确的立体定位坐标。由于小鼠的白质体积较小，且不同品系之间存在差异，因此可能需要根据所使用小鼠的年龄和品系对立体定位坐标进行调整。控制注射体积也至关重要，因为这与梗死灶的大小直接相关。较大的注射体积将导致更大的脑卒中病灶，可能累及上方的皮层和下方的纹状体。

已有文献报道采用本文所述方法...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
L-N5-(1-亚氨基乙基)鸟氨酸二盐酸盐	Calbiochem	400600-20MG
异氟烷	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
毛细管	World Precision Instruments	50-821-807
微量喷射仪	Parker Instrumentation	Picospritzer II
立体定位装置	Kent Scientific	KSC51725
拉针仪	KOPF	Model 720
体视显微镜 SZ51	Olympus	88-124
精细剪刀	Fine Scientific Tools	14084-08
镊子	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
弯头镊子	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
钝性解剖工具	Fine Scientific Tools	10066-15
钻孔机	Dremel	8220-1/28
钻头	Fine Scientific Tools	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
甲哌卡因	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
复方新诺明	STI Pharmacy	NDC 54879-007-16
氟金红	Fluorochrome Inc	30 mg
多聚甲醛	Fisher	O4042-500
蔗糖	Fisher	BP220-10
冷冻切片机	Leica CM3050 S	14047033518
载玻片	Fisher	12-544-7
快绿	Sigma	F7252-5G
解剖显微镜	Nikon	SMZ1500
23 G 蝶形针	Fisher	14-840-35
10x Hank's 平衡盐溶液	Life Technologies	14065056
1 M HEPES-KOH，pH 7.4	Affymetrix	16924
D-葡萄糖	Sigma	G8270
碳酸氢钠	Sigma	S5761
放线菌酮	Sigma	01810