一种用于研究轴突变性及白质神经生物学的多功能小鼠皮层下白质卒中模型

摘要

本文介绍了一种通过局部注射不可逆的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）抑制剂（L-Nio）在小鼠白质中诱导局灶性脑卒中的方法。文中展示了两种立体定位手术变体、逆行神经元示踪、新鲜组织标记与分离技术，拓展了该技术的潜在应用范围。

摘要

影响白质的卒中占临床卒中表现的25%，其无症状发生率可能高出5至10倍，并对血管性痴呆的发展具有显著贡献。目前存在的局灶性白质卒中模型较少，缺乏合适的模型严重阻碍了对这类卒中后损伤反应及修复过程中涉及的神经生物学机制的理解。其他皮层下卒中模型的主要局限在于无法将梗死灶严格限制在白质区域内，或主要在非小鼠物种中得到验证。这限制了利用丰富的小鼠研究工具来探索白质卒中神经生物学的能力。本文介绍了一种通过局部注射不可逆eNOS抑制剂，可靠地在小鼠白质中诱导局灶性卒中的方法。我们还提供了该通用方案的多种变体，包括两种独特的立体定位变异方法、逆行神经元示踪，以及新鲜组织标记与分离技术，这些显著拓展了该技术的潜在应用范围。这些变体使得研究人员能够从多个角度分析这种常见但研究不足的卒中形式所引起的神经生物学效应。

引言

影响皮层下白质的卒中是一种常见的临床病症，每年在美国占临床卒中病例的近25%¹。白质的缺血性损伤也以更高的频率无症状发生，并促进血管性痴呆的发展^2,3。目前，此类脑缺血患者几乎没有任何有效的治疗选择。尽管该疾病具有重要的临床意义，但目前仍缺乏与临床情况相关的动物模型^4,5。

本实验方案的目标是在小鼠的白质中制造一个局灶性缺血性损伤。这种模拟人类疾病的小鼠模型可用于专门研究轴突在中风后的损伤反应，以及白质中的细胞成分（即少突胶质细胞、星形胶质细胞和轴突）对中风的响应及修复过程。

既往研究已描述了一种使用内皮素-1（ET-1）⁶建立皮层下白质脑卒中模型的方法，该方法与本文所述模型相似。通过对实验方案进行若干关键性改进，此模型的潜在应用范围得以拓展^7,8。本方案提供了一种可靠且可调节的策略，用于在小鼠脑白质中诱导局灶性脑卒中。

该模型的主要优势在于使用了一种化学性内皮型一氧化氮合酶（eNOS）抑制剂——N(5)-(1)-亚氨基乙基-L-鸟氨酸盐酸盐（L-Nio）⁹，其对白质中细胞成分无已知的旁分泌作用，而使用内皮素-1的模型曾存在此类并发症¹⁰。此外，通过立体定位技术靶向小鼠白质，可利用各种转基因或基因敲除品系，极大地扩....

方案

本方案中动物的使用已按照加州大学洛杉矶分校动物护理和使用委员会批准的程序进行。

注意：首先确定目标小鼠种群。在以往的研究中，仅使用了雄性野生型 C57/Bl6 小鼠，但也可使用各种转基因或基因敲除小鼠。请注意，立体定位坐标是基于 C57/Bl6 的解剖结构。建议每位使用者最初验证脑卒中定位是否准确到达白质区域。

1. 白质脑卒中诱导——内侧斜角入路

1. 首先使用0.5 mm毛细管制备拉制玻璃移液管，使其远端直径在15–25 µm之间 ¹¹.
2. 在无菌0.9%生理盐水中配制L-Nio（N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl）溶液，浓度为27.4 mg/ml（130 µM），分装为10 µl无菌 aliquot。
3. 用连接至真空管线的管路将拉制好的玻璃移液管末端浸入 L-Nio 溶液中，吸取少量 L-Nio（2–5 µl）。将移液管平放在实验台面上完成预填充。
   1. 抽真空，直至移液管0.5 mm部分至少有2 mm被填充。关闭真空，取出移液管，放置一旁待用，直至步骤1.12。
4. 将小鼠放入诱导室，使用异氟烷蒸发器以标准的32%异氟烷（5 L/min异氟烷与5 L/min氧气混合吸入，另加0.5 L/min氮气）诱导小鼠麻醉₂）1 分....

结果

利用所展示的模型，可可靠地靶向前肢感觉运动皮层下方的白质。该化学诱导性卒中模型可产生局灶性轴突和髓鞘丢失、星形胶质细胞增生以及小胶质细胞活化（图1），这些特征与人类腔隙性脑梗死中典型表现一致。通过三次注射，可建立具有临床实用价值的模型，表现为前肢运动任务的早期功能障碍⁷，且仅有小部分脑组织发生缺血，但该模型适用于免疫组织化学、免疫荧光及生物化学技术，并可在定量水平上实现可行性和可重复性。在卒中诱导后的早期时间点（小时级），即可检测到轴突分子结构的改变（图2）。至第7天，卒中病灶完全成熟，形成一个界限明确的轴突丢失区域（图1a）。在我们的操作中，该方法产生的局灶性白质损伤水平直径约为800 µm，沿胼胝体前后轴延伸约1 mm。至第7天，平均总梗死体积约为0.200 mm³，呈椭圆形。我们观察到，由于切片位置在椭圆内的不同，动物间及切片间的梗死体积变异率约为10%。超过7天后，梗死范围进一步扩大的情况很少见。

讨论

已有多种既往的皮层下卒中模型被报道，包括在大鼠^12-14和小鼠^6,15的内囊、皮层下白质和纹状体中进行内皮素-1的局部注射。近期的一些小范围局灶性卒中模型则采用颈动脉内注射胆固醇微栓塞¹⁶，或单根穿支小动脉的光化学血栓闭塞¹⁷。这些模型各自具有优缺点⁵。本文所描述的模型所产生的病灶具备多种类似人类腔隙性梗死的特征，包括轴突异常与丢失、髓鞘降解、局灶性坏死核心，以及轻微的临床功能缺损，且其恢复速度相对较快，与年龄相关⁷。针对小鼠白质建立卒中模型，可支持多种遗传学操作，有助于开展机制性研究。

该实验方案的关键步骤包括使用精确的立体定位坐标。由于小鼠的白质体积较小，且不同品系之间存在差异，因此可能需要根据所使用小鼠的年龄和品系对立体定位坐标进行调整。控制注射体积也至关重要，因为这与梗死灶的大小直接相关。较大的注射体积将导致更大的脑卒中病灶，可能累及上方的皮层和下方的纹状体。

已有文献报道采用本文所述方法.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
L-N5-(1-亚氨基乙基)鸟氨酸二盐酸盐	Calbiochem	400600-20MG
异氟烷	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
毛细管	World Precision Instruments	50-821-807
微量喷射仪	Parker Instrumentation	Picospritzer II
立体定位装置	Kent Scientific	KSC51725
拉针仪	KOPF	Model 720
体视显微镜 SZ51	Olympus	88-124
精细剪刀	Fine Scientific Tools	14084-08
镊子	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
弯头镊子	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
钝性解剖工具	Fine Scientific Tools	10066-15
钻孔机	Dremel	8220-1/28
钻头	Fine Scientific Tools	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
甲哌卡因	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
复方新诺明	STI Pharmacy	NDC 54879-007-16
氟金红	Fluorochrome Inc	30 mg
多聚甲醛	Fisher	O4042-500
蔗糖	Fisher	BP220-10
冷冻切片机	Leica CM3050 S	14047033518
载玻片	Fisher	12-544-7
快绿	Sigma	F7252-5G
解剖显微镜	Nikon	SMZ1500
23 G 蝶形针	Fisher	14-840-35
10x Hank's 平衡盐溶液	Life Technologies	14065056
1 M HEPES-KOH，pH 7.4	Affymetrix	16924
D-葡萄糖	Sigma	G8270
碳酸氢钠	Sigma	S5761
放线菌酮	Sigma	01810