本文介绍了两种实验方案：一种用于检测能够成功侵入宿主并在其中存活的厌氧菌，另一种用于观察厌氧菌与宿主细胞之间的相互作用。该研究可应用于任何可培养的厌氧菌以及任何真核细胞类型。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
在人体多个微环境（如肠道、口腔和阴道）中，厌氧菌的数量远超需氧菌。此外，厌氧菌感染较为常见，且多为内源性感染。某些厌氧病原体具有侵入人体细胞的能力，借此获得逃避免疫系统先天防御的适应性机制，并可调控宿主细胞行为。然而，在研究这些过程的实验中，确保厌氧菌保持活性可能面临挑战。Porphyromonas gingivalis 是一种革兰氏阴性厌氧菌，能够侵入多种真核非吞噬性细胞。本文概述了如何成功培养P. gingivalis，并评估其侵入人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的能力。本研究建立了两种实验方案：一种用于检测能够成功侵入并在宿主细胞内存活的细菌，另一种用于观察细菌与宿主细胞的相互作用。这些技术需要使用厌氧培养箱，为P. gingivalis提供适宜生长的厌氧环境。
第一个方案基于抗生素保护实验，该方法被广泛用于研究细菌对宿主细胞的侵袭。然而，抗生素保护实验存在局限性：仅能检测经抗生素处理和宿主细胞裂解后仍可培养的胞内细菌。为了评估与宿主细胞相互作用的所有细菌（包括活菌和死菌），我们开发了一种利用荧光显微镜观察宿主-病原体相互作用的实验方案。细菌用2',7'-双(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素乙酰甲酯（BCECF-AM）进行荧光标记，并在厌氧条件下用于感染真核细胞。经多聚甲醛固定和0.2% Triton X-100透化处理后，使用TRITC标记的鬼笔环肽和DAPI对宿主细胞的细胞骨架和细胞核分别进行染色。通过在不同焦平面获取多张图像（Z轴层扫），实现细菌的时间-空间可视化。本研究中使用的方法可适用于任何可培养的厌氧菌以及任何类型的真核细胞。
引言
厌氧菌几乎定植于人体的所有表面。尽管在氧气浓度较低的肠道和泌尿生殖道菌群中占主导地位，它们也大量存在于皮肤、口腔、鼻腔和咽喉部位1。厌氧菌是内源性感染的常见病因，常从病变部位分离得到。然而，由于其营养要求苛刻，厌氧菌的分离与培养往往较为困难。涉及厌氧菌的研究必须在受限条件下进行。现代厌氧培养技术使研究人员能够模拟研究多种厌氧实验室菌株甚至临床分离株所需的厌氧环境2,3。
致病性厌氧菌与其寄生的宿主细胞之间已形成动态关系并共同进化。大多数厌氧菌在达到感染水平之前易被宿主免疫反应杀灭。然而，某些致病菌已进化出逃逸或干扰宿主免疫反应的机制。这些细菌通过逃避免疫识别、中和免疫介质、改变细胞介导的免疫、侵入宿主细胞以及干扰免疫信号通路等方式实现这一目标。4. 牙龈卟啉单胞菌一种与口腔及口腔外疾病相关的革兰氏阴性厌氧菌， 是一种高度适应的细菌病原体，能够引起宿主的致病性改变5-7.
牙齿与牙龈黏膜组织之间形成的深沟隙中积聚的生物膜菌斑微区可藏匿厌氧细菌，使其免受大气氧的暴露8这些牙周袋为多种厌氧病原体提供了生态位，例如 P. gingivalis9. P. gingivalis 是一种关键的病原菌，能够重塑口腔微生物群落，从而促进牙....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
以下方案将描述培养和研究厌氧菌P. gingivalis侵袭的方法；然而，这些方案也可用于多种其他厌氧病原体。尽管本方案使用了HUVECs，但也可适用于其他免疫性和非免疫性的真核细胞。
1. 厌氧培养箱的使用与维护
注意：P. gingivalis 是一种对空气中正常氧浓度敏感的厌氧菌。培养 P. gingivalis 必须具备可控的厌氧环境。
- 在此，于乙烯基厌氧室中维持一种指定为混合厌氧气体（80% N2, 10% H2, 10% CO2）的人工环境（图1A）。使用气闸室（图1B）将物品从实验室环境转移至厌氧室。气闸室需手动操作，在引入混合厌氧气体前，先用 N2 气体置换两次。
- 使用硫化氢去除柱（图1C）以实现无需维护的硫化氢清除。在厌氧室内放置除湿器，以去除催化剂反应生成的 H2O，避免产生促进污染扩散的气溶胶。
注意：硫化氢是多种厌氧细菌自然代谢的副产物，其积累对细菌具有毒性，并可能导致电子设备损坏以及催化剂寿命缩短。 - 使用风扇箱将厌氧室内的气体循环通过钯催化剂，以在氢气存在条件下....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
上述方案用于研究牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）与内皮细胞之间的宿主-病原体相互作用。本研究中使用了P. gingivalis W83菌株以及携带PG0228基因缺失的P. gingivalis V3150突变菌株。PG0228基因预测可编码一种可能影响RNA和蛋白质水平的蛋白质，最终可能影响P. gingivalis与宿主细胞的相互作用。为探究PG0228对P. gingivalis与宿主细胞相互作用能力的影响，比较了亲本菌株与突变菌株与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）相互作用的能力。本研究采用了存活实验方案（图2）。因此，两种菌株均按照步骤2所述条件培养至对数生长期。两种菌株具有相似的生长曲线，因此在感染前对细胞数量进行归一化处理时未遇到显著问题。经过七天的孵育后，在血琼脂平板上观察到菌落形成单位（CFUs）（图3）。将不同稀释度的样品（1:10（图3A）、1:100（图3C）和1:1,000（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
上述所有方法均可用于设计特异性检测厌氧菌与真核细胞相互作用的实验。然而，要成功开展这些实验，需考虑若干因素。首先是研究所用的微生物菌株。
在使用存活率检测和显微镜分析比较两种菌株时，确保它们处于相似的生长阶段并达到相近的细胞浓度至关重要，因为上述任何差异都可能影响侵袭效率13。当两种细菌菌株的生长曲线不同时，应进行调整，以最终获得具有稳定浓度的相似生长模式21。此外，应将细菌均匀分散，避免细胞聚集。同时，选择能够有效清除胞外细菌的抗生素也极为关键。如果所选抗生素对宿主细胞具有不良影响，则可使用其他替代抗生素或裂解酶24,25。最后，必须考虑菌株异质性；尽管某一种细菌可能被确认具有侵入宿主细胞的能力，但不同菌株之间的致病性可能存在显著差异26，因此应对每一种待研究的菌株开展预实验。
第二个关键步骤是在设计实验方案时确定最佳的孵育时间与细菌接种量（感染复数 [MOI]，即用于感染宿主细胞的细菌数量）。较短的孵育时间可用于评估细菌被宿主细胞内化的.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢宫崎博博士、Scott Henderson博士、Todd Kitten博士、Justin Hutcherson博士、Catherine Jauregui博士以及Collin R. Berry。本研究由美国国立卫生研究院国家牙科与颅面研究所（NIH NIDCR）资助，项目编号为R01DE016124、R01DE018039和R01DE023304，授予J.P. Lewis。
显微成像在弗吉尼亚联邦大学解剖学与神经生物学系显微成像中心完成，部分资金来自美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所中心核心资助（5P30NS047463）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙烯厌氧培养箱-型号B | Coy Laboratory Products | Model 2000 培养箱 | |
| 含5%羊血的TSA II胰蛋白酶大豆琼脂 | BBL | 221261 | |
| 人脐静脉内皮细胞（10名供体混合样本） | LifeLine Technology | FC-0044 | |
| VascuLife VEGF完全培养基试剂盒 | LifeLine Technology | LL-0003 | |
| TrypKit | LifeLine | LL-0013 | |
| 皂苷 | Riedel-de Haen | 16109 | |
| 硫酸庆大霉素盐 | Sigma-Aldrich | G-1264 | |
| 甲硝唑 | Sigma-Aldrich | M-3761 | |
| BCECF-AM | LifeTechnologies | B1150 | |
| TRITC鬼笔环肽 | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 18 mm圆形盖玻片 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| 含DAPI的VectaShield封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 |
参考文献
- Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
- Willis, A. T. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
- Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
