本文描述了一种基于油包水乳液的、将水溶性蛋白质与疏水性色素组装的简单且高通量的方法。我们通过将天然叶绿素与在大肠杆菌（E. coli）中表达的四种重组水溶性叶绿素结合蛋白（WSCPs）变体进行组装，验证了该方法的有效性，这些蛋白来源于芸苔属（Brassica）植物。
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摘要
摘要
叶绿素（Chls）和细菌叶绿素（BChls）是执行光合作用光能捕获和电子传递的主要辅因子。它们的功能高度依赖于其在大型、复杂的多亚基跨膜蛋白复合物中的特定排列方式。为了在分子水平上理解这些复合物如何促进太阳能转化，必须深入了解蛋白质-色素以及色素-色素之间的相互作用及其对激发态动力学的影响。实现这一目标的一种途径是构建并研究叶绿素与简单水溶性重组蛋白形成的复合物。然而，将亲脂性的叶绿素和细菌叶绿素整合到水溶性蛋白中十分困难。此外，目前尚无通用方法可用于将水溶性蛋白与疏水性色素进行组装。本文展示了一种基于油包水乳液的简单且高通量的系统，可实现水溶性蛋白与疏水性叶绿素的组装。该新方法通过将十字花科（Brassicaceae）植物的水溶性叶绿素结合蛋白（WSCP）的重组蛋白与叶绿素a进行组装得以验证。我们证明了可利用表达WSCP的E. coli细胞的粗裂解液成功组装叶绿素a，该体系可用于开发针对新型水溶性叶绿素结合蛋白的遗传筛选系统，并可用于研究叶绿素-蛋白相互作用及组装过程。
引言
疏水性色素（如叶绿素（Chls）、细菌叶绿素（BChls）和类胡萝卜素）是光合作用反应中心和捕光蛋白中的主要辅因子，负责电子传递以及光能的捕获与传递。反应中心及大多数结合叶绿素的捕光复合体均为跨膜蛋白。非产氧光合绿硫细菌中的芬纳-马修斯-奥尔森（Fenna-Matthews-Olson, FMO）蛋白 1,2，以及甲藻的多甲藻素-叶绿素蛋白（PCP） 3 是水溶性光捕获蛋白的典型代表。植物中的水溶性叶绿素结合蛋白（WSCPs） 十字花科, 蓼科, 藜科 和 苋科 植物 4,5 是另一个独特的例子，然而与FMO和PCP不同，它们既不参与光捕获，也不参与任何初级光合作用反应，其确切的生理功能尚不明确 5-8它们对叶绿素具有高结合亲和力，因此被推测在叶绿素及其衍生物的临时转运中发挥作用。 9,10或者，有研究假设WSCP在受损细胞中具有清除叶绿素的作用，并可防止叶绿素引起的光氧化损伤 7,11-13最近有研究提出，WSCP 具有蛋白酶抑制剂的功能，在植物抵抗食草动物过程中发挥作用，同时也调控花发育过程中的细胞死亡。 14根据其光物理特性，WSCPs 分为两大类。第一类（I 类， 例如. 来自 藜（Chenopodium album））在光照下可能发生光转化。来自芸薹属植物的II类WSCPs不会发生光转化 5,10，进一步细分为 IIa 类（例如，来自 甘蓝（Brassica oleracea），萝卜（Raphanus sativus）IIb（例如，来自 Lepidium virginicumIIb类WSCP的结构 Lepidium virginicum 通过X射线晶体学在2.0 Å分辨率下解析 8它呈现出一个对称的同源四聚体结构，其中蛋白质亚基形成一个疏水核心。每个亚基结合一个叶绿素（Chl），导致四个紧密堆积的叶绿素分子整齐排列于核心内部。这种完全由叶绿素组成的简单排列方式使得WSCPs成为研究叶绿素-蛋白质复合物结合与组装，以及邻近叶绿素分子和蛋白质环境对单个叶绿素光谱和电子特性影响的潜在有用模型系统。此外，该结构还可为构建可用于人工光合作用装置中集光模块的人工叶绿素结合蛋白提供模板。
由于从植物中纯化的复合物总是含有不同叶绿素组合的异质四聚体混合物，因此对天然WSCPs的严格研究不可行。 a 和 Chl b 9因此，一种将重组表达的WSCPs与Chls组装的方法 体外 是必需的。然而，叶绿素（Chls）极低的水溶性对此构成了挑战，使其难以形成该复合物 在 体外 通过将水溶性脱辅基蛋白与色素在水溶液中简单混合即可实现。 在 体外 通过将脱辅基蛋白与类囊体膜混合进行组装 15 已得到证实，但该方法仅限于存在于类囊体中的天然叶绿素。Schmidt 等报道了通过在大肠杆菌中重组表达带有组氨酸标签的蛋白质，将多种叶绿素（Chl）和脱镁叶绿素（BChl）衍生物与来自花椰菜的色素结合蛋白（CaWSCP）组装在一起 E. coli 将其固定到Ni亲和柱上，并引入溶于去污剂的叶绿素衍生物 11成功重组了重组WSCPs A. thaliana 6，采用类似方法也报道了球芽甘蓝（BoWSCP）、日本野萝卜（RshWSCP）和弗吉尼亚胡椒草（LvWSCP）。
本文介绍了一种新颖、通用且直接的叶绿素（Chls）与水溶性叶绿素结合蛋白（WSCP）组装方法，该方法无需对蛋白质进行标记或固定化。该方法基于将水溶性脱辅基蛋白的水溶液在矿物油中形成乳剂，使蛋白质被包裹在水包油（W/O）微滴中，具有极高的表面积与体积比16。疏水性辅因子随后溶解于油相中，并可轻易从油相扩散进入微滴。我们报道了利用该方法将大肠杆菌（E. coli）中重组表达的多种WSCP脱辅基蛋白与叶绿素a进行组装。我们还展示了直接从过表达WSCP的细菌粗裂解液中完成组装的过程，该体系可作为开发新型叶绿素结合蛋白的筛选平台。
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方案
1. 准备叶绿素 a 储备溶液
- 关键步骤：为尽量减少光损伤，叶绿素制备的所有步骤均需在通风橱内、绿光（520 nm）下或避光条件下进行。色素样品在冷冻保存前务必通入氮气或氩气。确保所用溶剂均为分析纯级。
- 称取约 5 mg 冻干的螺旋藻（Spirulina platensis）细胞或其他仅含叶绿素 a 的蓝细菌细胞 a 在类囊体膜中使用研钵和研杵进行研磨破碎。
- 将破碎的细胞上样至玻璃柱中，用约50–100 ml 100%丙酮洗涤以去除类胡萝卜素。弃去洗脱出的橙色/绿色组分。
注意：如果橙色组分未随100 ml丙酮洗脱，则继续用丙酮洗涤细胞，直至绿色组分开始洗脱。 - 用100%甲醇置换丙酮，并收集含有叶绿素的绿色组分 a洗脱组分的体积可能在50–100 ml之间。洗脱初期，洗脱液呈深绿色，随着洗脱进行，颜色逐渐变为浅绿色。当洗脱液颜色变为浅绿色时，停止洗脱。
- 使用旋转蒸发仪将甲醇蒸干，直至提取物完全干燥。切勿对溶液加热，确保蒸发仪水浴温度不超过30 °C。
注意：蒸发时间取决于所蒸发甲醇馏分的体积，可能在10–60分钟之间。必须将提取物完全干燥。 - 将干燥提取物中的色素溶解于少量乙醚（约5-10 ml）中，通过脱脂棉过滤。过滤前应确保色素已完全溶解于乙醚中。
- 将乙醚蒸发至色素完全干燥（10–30 分钟）。
注意：干燥的色素可在-20 °C避光条件下用氮气或氩气吹扫并保存，直至进一步处理。 - 将干燥的色素溶于尽可能小体积的100%甲醇中（约1 ml），即使并非所有物质完全悬浮也无妨。向溶液中加入4 ml丙酮，并轻轻弹动玻璃器皿，以确保色素完全溶解。
- 使用巴斯德移液管，将样品轻轻加样至已用100%丙酮平衡的DEAE Sepharose柱上。
- 用100%丙酮洗脱类胡萝卜素（橙黄色条带），然后洗脱叶绿素 a （绿色条带）用体积比为3:1的丙酮/甲醇混合液处理。
注意：丙酮以及丙酮/甲醇混合液的体积大致等于层析柱上样时DEAE Sepharose的体积。 - 验证叶绿素 a 使用二氯甲烷/正己烷/异丙醇/甲醇（v/v，68:25:5:2）混合溶剂作为洗脱剂，通过薄层色谱法测定纯度 17.
- 使用旋转蒸发仪将溶剂蒸发，直至叶绿素 a 完全干燥（10–60 分钟）。
注意：干燥的 Chl a 可用氮气或氩气吹扫，并在-20 °C避光条件下于氩气氛围中保存。 - 制备 Chl a 通过将干燥的叶绿素重新溶解来制备储备液 a 在2-4 ml的100%乙醇中。
注意：叶绿素的消光系数 a 在663 nm处为74,400 cm⁻¹-1M-1 (83.3 cm-1 (毫克/毫升)-1) 溶于乙醇中。典型的储备液其光密度（OD）应为1,860，对应浓度为25 mM（23 mg/ml）。取20 µl该储备液加入乳液中，乳液包含5 ml有机相，以及1 mg WSCP溶于1 ml水相，最终混合物中叶绿素（Chl）的摩尔过量为10倍。 a 与 WSCP 相比。
2. 准备乳液的有机相
注意：乳液的有机相由含有4.5%（v/v）Span 80和0.4%（v/v）Tween 80的矿物油组成。
- 在50 ml离心管中称取0.2 g吐温80、1.8 g司盘80和38 g矿物油。充分混匀所有组分，并置于冰上冷却。
注意：有机相可在4 °C下保存最多一周。
3. 准备乳液的水相
注意：乳液的水相可由纯化的 WSCP 或过表达 WSCP 的细菌粗提物组成。
- 制备含有纯化WSCP的水相。
- 培养 大肠杆菌 含 WSCP 质粒的 BL21 细菌 12 在37 °C的1 L LB培养基中培养至OD值为0.3–0.6。
- 通过加入1 mM IPTG诱导蛋白表达。诱导后，在30 °C培养细菌12–16小时。
- 在 4 °C 条件下，以 5,000 x g 离心 10 分钟收集细菌。
- 将沉淀溶解于结合缓冲液中，冰上超声处理（开启30秒，关闭15秒，重复5次）。对于从250 ml过表达该蛋白的LB培养基中离心获得的沉淀，使用10 ml缓冲液。
注意：根据纯化方法的不同，结合缓冲液可能由100 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.2）或50 mM Tris（pH 7.5）、500 mM NaCl、5 mM EDTA组成。 - 在 4 °C 条件下，以 12,000 x g 离心 30 分钟，沉淀细胞裂解物。
- 通过亲和层析纯化WSCP。根据融合在WSCP上的标签类型，选择相应的商品化亲和层析系统，按照制造商说明书纯化重组蛋白。
- 用于乳液制备时，使用溶于50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.8）中的纯化WSCP。确保每1 ml缓冲液中用于重组的最终蛋白用量为0.5–1.0 mg。
- 制备含有粗制细菌裂解液和WSCP的水相。
- 培养 E.coli 在37 °C下，将含有表达WSCP质粒的BL21细胞接种于250 ml LB培养基中，培养至OD值达到0.3–0.6。
- 用1 mM IPTG诱导蛋白表达，并在30 °C下过夜培养细菌。
- 在 4 °C 条件下，以 5,000 × g 离心 10 分钟收集细菌细胞。
- 将沉淀物溶于1-2 ml 50 mM pH 7.8磷酸钠缓冲液中，超声处理（每次30秒，间隔15秒，重复三次），然后在4 °C下以12,000 × g离心30分钟。
- 将0.125 ml上清液与0.875 ml pH 7.8的50 mM磷酸钠缓冲液混合，制备乳液的水相。
4. 乳液中 WSCP 与叶绿素 a 的组装
- 将5 ml油-表面活性剂混合物转移至玻璃小瓶中，并在冰上冷却。移液前需确认有机相的所有组分已充分混合，表面活性剂与矿物油之间无相分离现象。
- 将按第3节所述制备的1 ml冰冻水相加入5 ml有机相中。
- 在冰上使用组织匀浆器以9,500 rpm速度混合两相，持续2分钟。
- 关键步骤：从本步骤开始，所有后续操作均需在绿光（520 nm）条件下进行，以最大限度减少光损伤。向乳液中加入20 µl浓度为25 mM的叶绿素a储备液（见第1.13节）。通过轻弹和倒置玻璃小瓶使溶液分散，确保叶绿素在乳液中均匀分布。
- 将乳液在冰上避光孵育1–2小时。
- 为破坏乳液并使水相液滴与有机相分离，将乳液转移至1.5 ml塑料离心管中，在室温下以14,000 × g离心5分钟。
注意：若组装成功，下层水相应呈现绿色。 - 弃去上层油相，加入1 ml矿物油。通过涡旋或彻底翻转离心管将矿物油与沉淀的乳液充分混匀。在室温下以14,000 × g离心5分钟。重复此步骤，直至获得清晰的液-液界面，水相与矿物油相之间无任何中间乳液层。
- 在通风橱内进行此步骤。待水相与矿物油相完全分离后，移除矿物油并加入1 ml水饱和的乙醚。涡旋混匀后在室温下以14,000 × g离心5分钟。重复该步骤两次。
- 第二次离心后，移除乙醚，并将离心管在通风橱中敞口放置5–20分钟。
- 最后，将含有WSCP/叶绿素a复合物的水相上样至脱盐柱，并使用适用于后续实验的缓冲液进行洗脱。
注意：该蛋白在较宽pH范围（6.0–7.5）的磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液中均稳定。样品可在4 °C避光条件下保存长达一个月。
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结果
根据前文所述方案，将重组WSCP脱辅基蛋白与叶绿素a在水/油乳液中进行组装。该方案所用的水相包含纯化的WSCP，或过表达WSCP的大肠杆菌（E.coli）细胞裂解液（图1）。该方法操作简便、快速，除组织匀浆器外无需任何特殊设备。
四种重组WSCP变体（即RshWSCP、CaWSCP、BoWSCP和LvWSCP）的叶绿素a复合物的吸收光谱和圆二色光谱如图2所示。这些光谱的谱带形状和位置与先前报道的相应天然复合物的光谱相似10,18,19。这些结果清楚地表明，在水/油乳液体系中重建的WSCP/叶绿素复合物与天然复合物相似。
为了展示水包油（W/O）乳液作为快速筛选含叶绿素（Chls）的水溶性叶绿...
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讨论
我们的目标是开发一种用于组装含有疏水性色素的水溶性叶绿素结合蛋白的新通用系统。本文证明，基于水包油乳液（W/O乳液）的新重建系统是一种通用方法，已验证可用于组装在大肠杆菌（E. coli）中重组表达的来自 Brussels sprouts、花椰菜、山葵和 Virginia pepperweed 的 WSCP 脱辅基蛋白。本文展示了使用 10 倍摩尔过量的叶绿素 a 对 1 mg WSCP 进行重建的结果。然而，也可采用较低浓度的 WSCP 以及不同的叶绿素/蛋白摩尔比进行重建。我们能够在 W/O 乳液中成功组装的最低蛋白量为 100 µg，而色素与蛋白的摩尔比可在 5:1 至 20:1 范围内变化。此外，水相体积可降低至 50 µl。本研究展示了 WSCP 与叶绿素 a 的组装。但 WSCP 也可与其他疏水性叶绿素、细菌叶绿素（BChls）及其衍生物进行组装。目前，我们正在将该系统应用于其他水溶性色素结合蛋白（如 FMO 和 PCP）的测试中。
尽管我们的方法快速且简便，但在制备水/油乳液以及将叶绿素（Chl）重新整合到WSCP...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
DN 承认获得欧盟第七框架计划项目 PEPDIODE（GA 256672）和 REGPOT-2012-2013-1（GA 316157）以及以色列科学基金会个人研究资助（编号 268/10）的支持。我们感谢美国马萨诸塞州剑桥市哈佛大学工程与应用科学学院的 Shmuel Rubinstein 教授提供共聚焦显微镜图像。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 矿物油 | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | 用于天然序列WSCP纯化的亲和层析柱 |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | 用于带His标签WSCP纯化的亲和层析柱 |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | 叶绿素纯化用层析介质 |
参考文献
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