本文描述了一种基于油包水乳液的、将水溶性蛋白质与疏水性色素组装的简单且高通量的方法。我们通过将天然叶绿素与在大肠杆菌（E. coli）中表达的四种重组水溶性叶绿素结合蛋白（WSCPs）变体进行组装，验证了该方法的有效性，这些蛋白来源于芸苔属（Brassica）植物。
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本文内容
摘要
摘要
叶绿素（Chls）和细菌叶绿素（BChls）是执行光合作用光能捕获和电子传递的主要辅因子。它们的功能高度依赖于其在大型、复杂的多亚基跨膜蛋白复合物中的特定排列方式。为了在分子水平上理解这些复合物如何促进太阳能转化，必须深入了解蛋白质-色素以及色素-色素之间的相互作用及其对激发态动力学的影响。实现这一目标的一种途径是构建并研究叶绿素与简单水溶性重组蛋白形成的复合物。然而，将亲脂性的叶绿素和细菌叶绿素整合到水溶性蛋白中十分困难。此外，目前尚无通用方法可用于将水溶性蛋白与疏水性色素进行组装。本文展示了一种基于油包水乳液的简单且高通量的系统，可实现水溶性蛋白与疏水性叶绿素的组装。该新方法通过将十字花科（Brassicaceae）植物的水溶性叶绿素结合蛋白（WSCP）的重组蛋白与叶绿素a进行组装得以验证。我们证明了可利用表达WSCP的E. coli细胞的粗裂解液成功组装叶绿素a，该体系可用于开发针对新型水溶性叶绿素结合蛋白的遗传筛选系统，并可用于研究叶绿素-蛋白相互作用及组装过程。
引言
疏水性色素（如叶绿素（Chls）、细菌叶绿素（BChls）和类胡萝卜素）是光合作用反应中心和捕光蛋白中的主要辅因子，负责电子传递以及光能的捕获与传递。反应中心及大多数结合叶绿素的捕光复合体均为跨膜蛋白。非产氧光合绿硫细菌中的芬纳-马修斯-奥尔森（Fenna-Matthews-Olson, FMO）蛋白 1,2，以及甲藻的多甲藻素-叶绿素蛋白（PCP） 3 是水溶性光捕获蛋白的典型代表。植物中的水溶性叶绿素结合蛋白（WSCPs） 十字花科, 蓼科, 藜科 和 苋科 植物 4,5 是另一个独特的例子，然而与FMO和PCP不同，它们既不参与光捕获，也不参与任何初级光合作用反应，其确切的生理功能尚不明确 5-8它们对叶绿素具有高结合亲和力，因此被推测在叶绿素及其衍生物的临时转运中发挥作用。 9,10或者，有研究假设WSCP在受损细胞中具有清除叶绿素的作用，并可防止叶绿素引起的光氧化损伤 7,11-13最近有研究提出，WSCP 具有蛋白酶抑制剂的功能，在植物抵抗食草动物过程中发挥作用，同时也调控花发育过程中的细胞死亡。 14根据其光物理特性，WSCPs 分为两大类。第一类（I 类， 例如. 来自 藜（Chenopodium album））在光照下可能发生光转化。....
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方案
1. 准备叶绿素 a 储备溶液
- 关键步骤：为尽量减少光损伤，叶绿素制备的所有步骤均需在通风橱内、绿光（520 nm）下或避光条件下进行。色素样品在冷冻保存前务必通入氮气或氩气。确保所用溶剂均为分析纯级。
- 称取约 5 mg 冻干的螺旋藻（Spirulina platensis）细胞或其他仅含叶绿素 a 的蓝细菌细胞 a 在类囊体膜中使用研钵和研杵进行研磨破碎。
- 将破碎的细胞上样至玻璃柱中，用约50–100 ml 100%丙酮洗涤以去除类胡萝卜素。弃去洗脱出的橙色/绿色组分。
注意：如果橙色组分未随100 ml丙酮洗脱，则继续用丙酮洗涤细胞，直至绿色组分开始洗脱。 - 用100%甲醇置换丙酮，并收集含有叶绿素的绿色组分 a洗脱组分的体积可能在50–100 ml之间。洗脱初期，洗脱液呈深绿色，随着洗脱进行，颜色逐渐变为浅绿色。当洗脱液颜色变为浅绿色时，停止洗脱。
- 使用旋转蒸发仪将甲醇蒸干，直至提取物完全干燥。切勿对溶液加热，确保蒸发仪水浴温度不超过30 °C。
注意：蒸发时间取决于所蒸发甲醇馏分的体积，可能在10–60分钟之间。必须将提取物完全干燥。 - 将干燥提取物中的色素溶解于少量乙醚（约5-10 ml）中，通过脱脂棉过滤。过滤前应确保色素已完全溶解于乙醚中。
- 将乙醚蒸发至色素完全干燥（10–30 分钟）。
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结果
根据前文所述方案，将重组WSCP脱辅基蛋白与叶绿素a在水/油乳液中进行组装。该方案所用的水相包含纯化的WSCP，或过表达WSCP的大肠杆菌（E.coli）细胞裂解液（图1）。该方法操作简便、快速，除组织匀浆器外无需任何特殊设备。
四种重组WSCP变体（即RshWSCP、CaWSCP、BoWSCP和LvWSCP）的叶绿素a复合物的吸收光谱和圆二色光谱如图2所示。这些光谱的谱带形状和位置与先前报道的相应天然复合物的光谱相似10,18,19。这些结果清楚地表明，在水/油乳液体系中重建的WSCP/叶绿素复合物与天然复合物相似。
为了展示水包油（W/O）乳液作为快速筛选含叶绿素（Chls）的水溶性叶绿.......
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讨论
我们的目标是开发一种用于组装含有疏水性色素的水溶性叶绿素结合蛋白的新通用系统。本文证明，基于水包油乳液（W/O乳液）的新重建系统是一种通用方法，已验证可用于组装在大肠杆菌（E. coli）中重组表达的来自 Brussels sprouts、花椰菜、山葵和 Virginia pepperweed 的 WSCP 脱辅基蛋白。本文展示了使用 10 倍摩尔过量的叶绿素 a 对 1 mg WSCP 进行重建的结果。然而，也可采用较低浓度的 WSCP 以及不同的叶绿素/蛋白摩尔比进行重建。我们能够在 W/O 乳液中成功组装的最低蛋白量为 100 µg，而色素与蛋白的摩尔比可在 5:1 至 20:1 范围内变化。此外，水相体积可降低至 50 µl。本研究展示了 WSCP 与叶绿素 a 的组装。但 WSCP 也可与其他疏水性叶绿素、细菌叶绿素（BChls）及其衍生物进行组装。目前，我们正在将该系统应用于其他水溶性色素结合蛋白（如 FMO 和 PCP）的测试中。
尽管我们的方法快速且简便，但在制备水/油乳液以及将叶绿素（Chl）重新整合到WSCP.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
DN 承认获得欧盟第七框架计划项目 PEPDIODE（GA 256672）和 REGPOT-2012-2013-1（GA 316157）以及以色列科学基金会个人研究资助（编号 268/10）的支持。我们感谢美国马萨诸塞州剑桥市哈佛大学工程与应用科学学院的 Shmuel Rubinstein 教授提供共聚焦显微镜图像。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 矿物油 | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | 用于天然序列WSCP纯化的亲和层析柱 |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | 用于带His标签WSCP纯化的亲和层析柱 |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | 叶绿素纯化用层析介质 |
参考文献
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorba....
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