优化划痕损伤实验以检测可溶性香烟烟雾提取物损伤后小鼠间充质基质细胞迁移能力的变化

摘要

迁移能力是多种不同类型细胞的关键功能，包括间充质基质细胞（MSCs）。然而，量化损伤后迁移能力的变化具有挑战性。本方案描述了一种易于调整的迁移检测方法，该方法采用严格的统计学手段来量化损伤后MSC迁移能力的变化。

摘要

细胞迁移在许多生理和病理过程中至关重要，包括组织发育、修复与再生、癌症转移以及炎症反应。鉴于目前对间充质基质细胞在介导组织修复中作用的广泛关注，我们希望量化这些细胞的迁移能力，并了解损伤后其迁移能力可能发生的变化。优化一种严格定量、易于定制且成本效益高的迁移检测方法，是回答有关细胞迁移在不同刺激下发生改变这一问题的关键。目前用于量化细胞迁移的方法，包括划痕实验、跨孔迁移实验（Boyden小室）、微柱阵列和细胞排除区实验，在可重复性、可定制性、定量分析和成本效益方面均存在不同程度的局限性。尽管划痕实验被广泛使用，但其结果易受多种因素干扰，如对细胞微环境的损伤、阻碍细胞迁移的因素、邻近衰老细胞的影响以及细胞增殖等，且缺乏严格的定量手段。本文所述的优化划痕实验具有结果可靠、可进行基于图像的定量分析、成本低以及可适应其他应用等优点。

引言

细胞迁移具有高度协调性，在多种生理过程（如组织发育、修复和再生）以及病理过程（如癌症转移和动脉硬化）中起着至关重要的作用¹。理解细胞迁移对于新兴的组织修复和疾病治疗策略尤为重要，包括细胞移植技术和人工组织移植²。鉴于目前对间充质基质细胞（MSCs）在介导组织修复中作用的关注³，开发一种可严格量化、可灵活调整且成本效益高的方法来评估这些细胞的迁移能力具有重要意义。尤为重要的是，该方法必须具备足够的灵敏度，以检测细胞在受损后迁移能力发生的相对细微变化。现有的细胞迁移定量方法，包括划痕实验、跨孔迁移实验（Boyden小室）、微柱阵列和细胞排斥区实验，在可重复性、可定制性、定量分析和成本效益方面均存在不同程度的局限性^1,4,5。本文所述的优化划痕实验具有结果稳定、支持图像化定量分析、成本低以及可拓展应用于其他研究场景等优势。

划痕实验已被广泛用于在不同实验条件下评估细胞迁移和增殖能力⁵。该实验包括将指定细胞接种并培养至完全或接近融合状态，然后使用无菌针头或移液器吸头划伤形成的单层细胞⁶。分析通常通过在多个时间点随机选择位置比较划痕宽度来进行^7-9。尽管该方法应用广泛，但其可重复性和定量分析存在困难。划痕操作的差异不仅会改变细胞的微环境，还可能因损伤培养板表面及下方的细胞外基质而阻碍细胞迁移⁵。实验通常持续7至12小时，但对于迁移较慢的细胞系或需要更长实验时间的情况，细胞增殖会成为干扰因素^7,10。最后，划痕过程中产生的衰老细胞可能释放干扰因子，影响单层细胞间隙闭合所需的细胞外信号传导¹。优化划痕实验需要创建一个一致的间隙，且不干扰表面特性，同时尽量缩短实验时间，并防止操作过程中发生非预期的细胞死亡。基于阻隔器的实验是对细胞排除区实验的一种优化，该方法利用置于孔板中央的阻隔器阻止细胞生长，但允许细胞在中央排除区周围接种。在评估迁移能力时，移除阻隔器后形成的排除区即为细胞迁移提供的表面。然而，该方法难以定制或调整¹⁰，在某些应用中，该技术的成本也可能过高。

与划痕实验及其衍生方法不同，跨孔迁移实验（或称 Boyden 小室实验）通过定量测定从一个腔室穿过微孔滤膜迁移至含有趋化因子腔室的细胞数量来评估细胞迁移能力^8,11,12。该技术在用于间充质干细胞（MSCs）等贴壁细胞时存在局限性，因为细胞在穿过微孔膜后会贴附于暴露于趋化因子一侧的膜表面，难以准确计数。尽管该方法能够检测某些三维迁移模式，但其可准确量化细胞迁移的细胞类型受限，从而限制了其应用价值¹⁰。另一种替代划痕实验的方法是使用微柱阵列，该方法通过检测细胞变形并迁入阵列的能力作为替代指标，以测量细胞在三维空间中的运动性。将聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体浇铸于精密模具上，经臭氧和纤连蛋白处理后，可形成均一且不可降解的微环境。微柱间距也可根据需要进行调整，以评估细胞进入阵列的能力⁴。该模具通过深硅反应离子刻蚀技术在硅晶圆上加工而成，形成高长径比阵列的负模¹³。尽管该实验方法具有可定制性强、能模拟三维迁移，并可通过直接观察迁移细胞进行分析等优势，但微柱阵列的经济化制备困难，阻碍了其广泛应用。

本方案中描述的优化划痕实验提供了一种高效且经济的方法，可产生一致的划痕，并可利用免费软件进行分析。该软件使用户能够测定细胞迁移前后划痕的总面积，而不仅仅是测量细胞迁移前后划痕的简单宽度。这一改进避免了需确定在划痕的何处测量宽度，以及划痕沿其长度方向宽度是否均匀的问题。此外，本文还讨论了细胞数量、细胞汇合度以及对细胞造成损伤的类型和程度的精细优化，以进一步提高实验的可靠性。

方案

注意：本研究中，远端肺组织来源的肺间充质基质细胞（LR-MSCs）的分离方法基于细胞表面标志物表达（CD45^neg、CD31^neg、Sca-1^high、Epcam^neg）^14,15，或采用组织块贴壁法¹⁶，或采用酶消化法¹⁷。贴壁生长的LR-MSCs使用含高糖但不含谷氨酰胺的DMEM培养基，添加15%胎牛血清（FBS）、1×抗生素/抗真菌剂和2 mM谷氨酰胺（以下简称完全培养基），在37 °C、5% CO₂条件下培养。LR-MSCs传代3–4次，以确保用于迁移实验的细胞群体具有相对均一的生长特性。

1. 准备融合单层细胞

1. 为使间充质干细胞（MSCs）从标准的100 mm培养皿中脱落，用10 ml预热至37 °C的PBS洗涤细胞，吸除PBS后加入4 ml胰蛋白酶（0.25%），在37 °C培养箱中孵育3-5分钟。将细胞吸入锥形管中，加入等体积的完全培养基，并在300 g条件下离心5分钟以沉淀细胞。
   注意：胰蛋白酶孵育时间过长可能改变细胞表面受体，进而影响细胞迁移能力。
2. 吸除培养基，将细胞重悬于新鲜完全培养基中。使用台盼蓝染色排除法计数活细胞，并在60 mm细胞培养皿中接种50万间充质基质细胞，加入4 ml完全培养基。
   注意：根据细胞来源不同，可能需要进行测试以确定所需的最佳细胞数量。
3. 将细胞孵育至培养皿中细胞融合度达到90%，以确保最佳的细胞贴壁和增殖状态，MSCs通常需要48-72小时。
   注意：不建议达到100%融合，因为许多贴壁依赖性细胞会出现接触抑制，可能影响其迁移能力。若融合度低于80%，将导致图像无法使用，因为图像分析软件会将细胞间的空隙误识别为划痕边缘的一部分（见图1D）。
4. 当细胞融合度达到90%后，根据实验需求对细胞进行损伤处理。若需评估可溶性香烟烟雾提取物（CSE）暴露后的细胞损伤情况，可通过在2分钟内将1支肯塔基大学研究用香烟（3R4F）产生的烟雾通入装有25 ml完全培养基的布氏烧瓶中，制备100% CSE¹⁸。
5. 将细胞在含1-4% CSE的完全培养基中孵育24小时。孵育结束后，用4 ml温热的无菌PBS洗涤细胞两次，随后更换为4 ml新鲜完全培养基。
   注意：使用高浓度香烟烟雾提取物（>5%）处理细胞可能导致融合度显著下降。

2. 制造划痕

1. 在无菌环境中，打开受损MSCs的60 mm培养皿盖，将一条直边（例如灭菌的塑料直尺）放置在培养皿上缘。不移除培养基，使用无菌的200 µl移液枪头并沿灭菌直边引导，在培养皿表面划出1至4条平行划痕，划痕间距约5 mm，长度约50 mm。
   注意：使用直边可最大限度减少培养皿置于显微镜载物台时所需的旋转调整。必须确保划痕在屏幕上呈现完全垂直（或水平）的状态。在60 mm培养皿上制作多个划痕不会以影响细胞迁移的方式改变微环境（数据未显示），但可能对其他细胞类型存在影响。不建议使用较小的孔板，因为细胞在孔边缘附近生长的变异性更为显著，可能影响划痕生成的均匀性。
2. 吸除培养基，并用2 ml预热的完全培养基轻轻洗涤培养皿，以防止细胞黏附于划痕中央，并清除因划痕操作而松动的细胞。随后加入4 ml新鲜完全培养基。
3. 使用无菌永久性记号笔，在培养皿底部标记每条划痕编号1至4，标记位置应避免干扰划痕成像。
   注意：由于划痕宽度可能存在差异，比较迁移前后图像时，必须确保为同一条划痕的图像进行对比。

3. 获取划痕的初始图像

注意：如果在多块培养板上进行划痕实验，建议在对下一块培养板进行划痕前，先采集同一块培养板上所有划痕的初始图像。

1. 使用配备相机的倒置相差显微镜生成分析所需的图像。
2. 将培养板置于显微镜载物台上，使用低倍物镜（10X）定位划痕#1。若培养板盖上有冷凝水影响细胞图像清晰度，可使用加热载物台并设定为37 °C。
3. 保持划痕完全水平且位于视野中央，拍摄足够数量的图像以覆盖划痕总长度的90%。拍摄划痕的不同区段时，各图像之间不得有重叠。
   注意：培养皿边缘对光的折射会导致图像过曝，无法进行分析。因此，应避免采集划痕起始和末尾各5%区域的图像。
4. 将每条划痕的图像分别保存在独立的文件夹中。
5. 对划痕2、3和4重复执行步骤3.2–3.4。
6. 初次成像后立即将培养板放回培养箱，继续培养4–7小时以允许细胞迁移。
   注意：当评估经CSE损伤的MSCs时，7小时为最佳孵育时间。不建议孵育超过7小时，因为细胞增殖可能成为影响细胞迁移分析的混杂因素（详见下方可选说明8.2）。

4. 分析初始划痕图像

1. 下载 ImageJ 并安装 Wound Healing Tool 插件（参见表格） 材料/设备).
2. 在 ImageJ 中打开图像文件，然后点击 "过程" 和 "查找边缘" 以突出划痕周围的细胞，便于伤口愈合分析工具计算划痕区域图2B。接下来，单击 "图像", "调节", "颜色阈值" 下拉菜单中，标签为 "阈值颜色" 将值更改为 "B&W."
3. 在 "颜色阈值" 菜单中，调节两个亮度阈值滑块，直至划痕与细胞前沿之间的对比度达到最佳。为在图像中获得最大对比度调节范围，先将底部滑块完全移至右侧（图像完全变黑），然后调节顶部滑块以获得最大对比度。
4. 缓慢地将顶部亮度滑块从左向右调节，直至图像清晰显示划痕的轮廓（图2C）。一旦确定了划痕的边缘，点击 "更多工具" 在 ImageJ 工具栏中，选择 "MRI伤口愈合评估工具" 从下拉菜单中选择，并按下 "m" 按钮（将出现在 ImageJ 工具栏中）以高亮划痕区域，并在结果弹出窗口中输出计算得到的面积（图 2D).
5. 从结果窗口复制并粘贴所有数字（图2E) 输入 Excel 电子表格中。确保将不同划痕的数据分开。

5. 获取划痕的最终图像

1. 待细胞迁移完成后（4-7 小时），重复步骤 3.2-3.4。以与划痕相同的顺序对各孔板成像，以确保每块孔板上的细胞具有相同的迁移时间。
   注意：可根据细胞对温度和 pH 变化的敏感性，在多个时间点进行成像。或者，也可采用活细胞成像技术实时追踪细胞迁移过程。

6. 分析最终划痕图像

1. 对最终划痕图像重复步骤 4.2–4.5。

7. 计算划痕面积以定量分析细胞迁移

1. 通过取相应划痕的初始面积值的平均值，计算平均划痕前面积。
2. 通过从平均划痕前面积（步骤7.1）中减去步骤6中计算得到的每张图像的最终划痕后面积，计算每个样本的总迁移量。生成一个代表各划痕迁移变化的数值列表。
3. 合并同一实验组内多个划痕的数据（i.e. 所有培养板以及暴露于0% CSE的细胞上的所有划痕）。采用方差分析（ANOVA）检验分析不同实验组之间的差异。
4. 若细胞迁移较慢，划痕后需要更长的孵育时间（超过10–12小时），则应进行BrDU或EdU掺入实验¹⁹，以确定在划痕实验期间细胞是否发生增殖。应选择适当的划痕实验时间，以避免明显的细胞增殖。

8. 可选步骤

1. 为了评估划痕操作是否导致了显著的细胞衰老，可在划痕后预设的时间点对测试培养板进行衰老相关β-半乳糖苷酶检测¹⁹。

结果

本研究中展示的划痕实验使用小鼠肺驻留间充质基质细胞（LR-MSCs）进行，细胞分离方法参见方案注释。将LR-MSCs以每60 mm组织培养皿500,000个细胞的密度接种，并在48小时内培养至90%融合度。为诱导损伤，在初次接种后、划痕实验开始前，用4% CSE（如上所述）处理细胞24小时。每次实验均使用200 µl移液枪头制造划痕。在完成划痕并用完全培养基洗去松散细胞和碎片后，采集初始图像。如图1A和B所示，适当的细胞融合度对于确保成像软件能够准确识别划痕边界至关重要。如图1C所示，若细胞融合度不足（可能由于接种密度过低、孵育时间不足或损伤过度），会导致划痕边界不均，难以被成像软件清晰识别（图1D）。图2展示了图像采集与分析过程。图2A为分析前的原始图像；图2B显示了在“Process”菜单下使用“Find Edges”工具后的结果（步骤4.2）；图2C显示了调整“C...

讨论

本文所述方案提供了一种定量可靠且标准化的方法，用于进行和分析划痕实验。简单的划痕实验常规应用于多个研究领域，以检测细胞迁移。然而，传统划痕实验缺乏标准化的操作流程和定量分析方法，导致实验重复性存在问题^7,10。许多针对划痕实验的改进和优化措施已减轻了这些问题，包括单个活细胞成像、基于标准化挡板的实验以及三维微柱实验^4,8,10。然而，这些实验方法可能难以定制或调整¹⁰，并且在某些应用中，这些技术的成本也可能过高。

为了建立标准化的划痕实验方案，本文所介绍的实验流程中有若干关键步骤需要针对所涉及细胞的具体信息进行优化，以根据相关细胞特性对实验条件进行调整。尤其重要的是，需优化接种细胞数量以及培养时间，以确保在实验时形成90%-100%融合度的均匀单层细胞（步骤1.3和步骤1.4）。若细胞数量过少（融合度低于90%），则无法形成足够致密的单层；这不仅会影响细胞微环境，还会影响成像软件对划痕边缘的准确识别。相反，若单层细胞过多（达到100%融合或出现细胞堆叠），则可能导致接触抑制，从而改变细胞的迁移特性。某些划痕实验方案建...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM（高糖，不含谷氨酰胺）	Life Technologies	31053-036
胎牛血清，Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3091002
抗生素/抗真菌剂，Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SV3007901
谷氨酰胺，200 mM，Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3003401
TypeLE 细胞解离试剂	Life Technologies	12563-01
杜氏磷酸盐缓冲液，Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3002802
Falcon 标准 60 mm 组织培养皿	Fisher Scientific	08-772B
Fisherbrand 无菌 200 μl 移液器吸头	Fisher Scientific	02-707-502
带相机接口的倒置光学显微镜	可变
ImageJ 软件	http://imagej.nih.gov/ij/
MRI_Wound_Healing 插件	http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool
统计分析软件	Microsoft Excel