伤口划痕试验的优化来探测在小鼠间充质干细胞迁移的可溶性香烟烟雾提取物受损后

摘要

迁移能力是许多不同细胞类型的关键功能，包括间充质基质细胞 （MSC）。然而，量化损伤后洄游能力的变化是具有挑战性的。该方案描述了一种易于调整的迁移测定法，它使用严格的统计数据来量化损伤后 MSC 迁移能力的变化。

摘要

细胞迁移对许多生理和病理过程至关重要，包括组织发育、修复和再生、癌症转移和炎症反应。鉴于目前对间充质基质细胞在介导组织修复中的作用的兴趣，我们有兴趣量化这些细胞的迁移能力，并了解损伤后迁移能力如何改变。优化易于定制且具有成本效益的严格定量迁移分析，是回答有关响应各种刺激的细胞迁移改变问题的关键。目前用于量化细胞迁移的方法，包括划痕测定、反式孔迁移测定（Boyden 室）、微柱阵列和细胞排阻区测定，在重现性、可定制性、定量和成本效益方面存在一系列限制。尽管划痕测定的用途突出，但与细胞微环境损伤、细胞迁移障碍、邻近衰老细胞的影响和细胞增殖以及缺乏严格的定量相关的可重复性问题使划痕测定感到困惑。此处描述的优化划痕分析展示了稳健的结果、可量化和基于图像的分析能力、成本效益和对其他应用的适应性。

引言

细胞迁移是高度协调和至关重要的许多生理过程，如组织发育，修复和再生，以及病理过程，如癌症转移和动脉硬化^1。细胞迁移的理解是特别相关的用于修复受损的组织和治疗的病理状态，包括细胞移植技术和人工组织嫁接²新兴疗法。鉴于间充质干细胞（MSCs）在介导组织修复^3，用分析是严格计量的，适应性强，具有成本效益的感兴趣量化这些细胞的迁移能力的作用，目前的利息。重要的是，这样的测定必须是足够敏感的损害后，以检测在细胞迁移能力相对微妙的变化。目前的方法用于定量细胞的迁移，包括刮测定法，反式井迁移测定（Boyden小通道琥珀），微柱阵列，和细胞排除区检测具有一系列在再现性，可定制，量化，和成本效益^-1,4,5-限制。此处所描述的优化划痕试验表明健壮的结果，量化的和基于图像的分析能力，成本效益，并适应其它应用。

划痕试验已被用于多种能力来评估不同的实验条件下⁵细胞迁移和增殖。该检测限嗣继承播种指定的细胞，他们成长，完成或接近汇合，和刮擦产生的单层用消毒针头或吸管尖^6。是最常见的，在随机选择的位置^7-9比较所述划痕在多个时间点的宽度进行分析。尽管其突出使用，划痕试验通过与重现性和定量的问题混淆。变异代划痕不仅改变细胞的微环境，而且还可以通过破坏该板面和底层的细胞外基质⁵阻碍细胞的迁移。测定是经常进行了超过7〜12小时，但对于细胞株显示较慢的迁移和更长的实验时间，增殖成为一个混杂变量^7,10。最后，通过划痕过程中产生的衰老细胞中可以释放与缩小差距，在单层¹所需的细胞外信令干扰因素。优化划痕测定需要创建一个一致的间隙不与表面性质干扰，减少分析时间长度，并防止操作过程中不希望的细胞死亡。止动基础的分析是小区排除区域测定的优化。该测定法利用塞子放置在排除细胞生长的孔的中间，但是允许细胞可围绕中心隔离区电镀。为了评估迁移，挡块被删除，并将所得排除区提供了用于迁移发生的表面。然而，该测定是困难的定制或调整¹⁰和对于一些应用，这种技术也可以成本过高。

在对比划痕测定和它们的衍生物，反-井迁移测定（或Boyden小室测定法）通过定量细胞移动从一个腔室的数目，通过微孔滤膜过滤，到含有趋化剂^8,11的室评估^迁移 ， ^12。这种技术具有有限的效用为贴壁细胞如间充质干因为以下通过多孔膜的迁移，细胞粘附在膜侧暴露于趋化剂，并且可能很难准确量化。虽然检测是能够研究一些三维的迁移模式，受限制的细 ​​胞类型，这就是它能够准确量化细胞迁移限制其效用¹⁰。另一替代划伤试验采用了微柱阵列，它通过一个三维空间使用细胞变形并迁移到数组作为替代的能力测量细胞运动。聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体固化过精密模具和用臭氧处理和纤连蛋白产生均匀和不可降解的微环境。根据需要，以评估细胞的进入^阵列 4的能力的微柱间距也可以变化。模具是通过硅晶片的深反应离子蚀刻创建以创建高宽比^阵列 13的负版本。虽然试验是由它的可定制性加强，能够通过细胞迁移的直接可视化模型的三维迁移和分析，难以产生微柱阵列在经济上阻碍了它的广泛使用。

在本协议中所描述的优化划痕试验提供了一个高效，COS叔有效的制造方法，可以使用免费提供的软件进行分析一致划痕。而不是之前和细胞迁移后，整个从头做起简单的宽度测量，该软件能够使用户在迁移前后测定总划伤的地方。这个前进限制了试图确定何处划痕宽度测量应采取的问题，以及是否划痕的宽度是沿着它的长度是均匀的。此外，细胞数，细胞融合和类型和损伤造成对细胞的程度的谨慎的优化，以便进一步优化测定法进行了讨论。

方案

注意:对于该研究中，肺间质基质细胞（LR-的MSC）从远端肺组织中分离或者基于它们的细胞表面标记物的表达（CD45 ^阴性 ，CD31 ^阴性 ，的^Sca-1的高，EPCAM ^{负）14,15，}用植出生长^16，或使用酶消化^17。粘附LR-的MSCs培养在DMEM高糖和无谷氨酰胺，15％FBS，1×抗生素/抗 ​​真菌剂，和2mM谷氨酰胺（此后完全培养基）并在_37℃，5％的CO 2。 LR-MSCs的传代3-4次，以确保细胞群与用于迁移测定相对同质生长特性。

1.准备一个融合的单层

1. 分离从标准的100毫米培养皿中的MSC，洗涤细胞，用10毫升37℃的预热的PBS中，吸出PBS并加入胰蛋白酶4毫升（0.25％）。孵育在37℃培养箱中3-5分钟。吸的CELLS到锥形管中，以300g添加完全培养基，离心等体积为5分钟以沉淀下来的细胞。
   注意:在胰蛋白酶长孵育可以改变细胞表面受体，并可能影响迁移。
2. 吸媒体和悬浮细胞，新鲜完整的媒体。计数细胞，用台盼蓝染色排除死细胞和板50万间充质干细胞在4毫升完整的媒体对60毫米的细胞培养皿。
   注意:根据细胞的来源上，测试可能是必要的，以确定所需要的细胞的最佳数量。
3. 孵育细胞，直到板为90％融合了最佳的细胞附着和增殖，一般48-72小时的干细胞。
   注:100％融合，不推荐，因为许多锚定依赖性细胞的体验接触抑制，这可能会改变他们的迁移能力。板的小于80％汇合，将导致不能使用的照片，因为图像分析软件将解释间隙细胞作为划痕的周边的部分之间秒（ 见图1D）。
4. 后的细胞达到90％汇合时，损伤细胞以适合应用。为了评估暴露于可溶性香烟烟雾提取物（CSE）后的细胞损伤，经到25 ml完全培养基在Buchner瓶超过2分钟^，18吸引来自肯塔基大学的1个研究香烟（3R4F）烟雾产生100％的自定义搜索引擎。
5. 孵育细胞24小时4毫升1-4％CSE稀释在完全培养基中。培养后，用4毫升温无菌PBS洗细胞两次，用4ml新鲜完全培养基更换之前。
   注:毁伤能力的细胞具有高浓度的香烟烟雾提取物（> 5％），可大大降低汇合。

2.创建暂存

1. 在一个无菌的环境，请从受损的干细胞的60毫米的钢板盖，并奠定了直边（例如无菌塑料尺）交流罗斯板的顶部边缘。如果不取出介质，使用消毒200μl枪头进行无菌直边引导，使整个板块差一分四点平行划痕大约间隔5毫米，50毫米长。
   注:直边最小化所需要的板材，当它是在显微镜舞台上旋转的调整量。当务之急是划痕出现在屏幕上完全垂直（或水平）。在60毫米的钢板产生多个划痕不会改变，影响细胞迁移（数据未显示）的方式的微环境，但也可以是对其它细胞类型的考虑。使用更小的孔的不推荐，因为细胞生长接近井的边缘的变异性变得更加明显，并且可能影响均匀代划痕。
2. 吸媒体，轻轻用2ml预热完整的媒体，以防止细胞粘到划痕的中心洗平板，并以除去细胞s表示已松动的的刮伤。更换用4毫升新鲜完整的媒体。
3. 用无菌永久性标记，标号1-4在板的下侧的每个刮在不会与成像划痕干扰位置。
   注意:从同一个临时图像迁移前后进行比较是很重要的，因为可以有变化的划痕宽度。

3.以暂存的初始图像

注意:如果划痕试验是在多个板中进行，所以建议在单个板的所有划痕初始图像被拍摄之前划痕上的下一个板制成。

1. 使用倒置相差显微镜用照相机以生成分析所需的图像。
2. 定位在显微镜的培养板，并使用低功率物镜（10X）来定位刮＃1。如果缩合在培养板的盖子妨碍清晰IMAGE中的细胞，用加热的阶段设定为37℃。
3. 保持刮完全水平和在视场的中心，得到尽可能多的图像作为必要在包括90％的划痕长度的。获得的耐擦伤不同的部分图像的图像之间没有重叠。
   注意:光在培养皿的边缘上的折射曝光过度的图像，使它们不可能分析。因此，不从第一个拍摄图像和最后划痕的长度的5％。
4. 保存每个从无到有的图像在一个单独的文件夹中。
5. 重复步骤3.2-3.4是否有划痕2，3和4。
6. 最初的影像后立即返回板的孵化器。让细胞迁移4-7小时。
   注:评估干细胞受损与CSE时7小时是最佳的。孵化细胞大于7小时不建议，因为细胞的增殖可以作为细胞迁移混杂变量（参见下面的可选注8.2）。

4。初步分析划痕图片

1. ImageJ的下载和安装伤口愈合工具插件（请参阅的材料/设备表）。
2. 在打开ImageJ的图像文件，然后单击"进程"和"查找边缘"突出周边划伤的伤口愈合工具来计算临时区域（ 图2B）的细胞。接下来，单击"图片"，"调整"，"颜色阈值"，并在标有"门槛颜色"下拉菜单值更改为"B＆W"。
3. 在"颜色阈值"菜单，同时调整亮度阈值滑块，直到从无到有，小区前的最佳的对比度达到。要允许尝试创建图像的对比度，完全移动底部滑块向右（全黑图像），然后调整顶部滑块产生最大对比度时，最大的范围内。
4. 慢慢调整前BRIghtness滑块从左至右直到图像干净地显示划痕（图2C）的轮廓。一旦划伤的边缘已经确定，单击"更多选项"，在ImageJ的工具栏，在下拉菜单中选择"MRI_Wound_Healing_Tool"，然后按"M"键（将出现在ImageJ的工具栏）突出刮开区并输出所计算的区域中一个结果弹出出窗口（图2D）。
5. 复制并从结果窗口 （图2E）的所有号码粘贴到Excel电子表格。请务必将数据从单独划痕分开。

5.与划痕的最终图像

1. 在细胞迁移（4-7小时），重复步骤3.2-3.4。图像以相同的顺序它们被划伤，使细胞在每个板上有相等的时间迁移的板。
   注:细胞可以在多个时间点进行成像，这取决于它们的森西拉了一到温度和pH值的变化。或者，活细胞成像可以用于跟踪单元的实时，因为它们迁移。

6.分析最终划痕图片

1. 最终划痕图像重复步骤4.2-4.5。

7.计算刮开区量化迁移

1. 通过平均各刮痕的初始面积值计算的平均预迁移区域。
2. 减去最后的迁移区域的每个图像，在步骤6中计算出的，从平均迁移前区域（步骤7.1）计算迁移的总量。生成值的每一个从无到有代表迁移变化的列表。
3. 池相同的测试组（ 如对细胞的所有板和所有的划痕暴露在0％CSE）内多处抓痕的数据。使用方差测试的分析方法来分析实验组之间的差异。
4. 如果细胞迁移慢并且需要较长的培育时间划伤（大于10〜12小时）后，执行的BrdU或EDU掺入法^19，以确定是否细胞中，其中移民法正在发生期间发生的任何扩散。选择迁移实验时间，以避免显著细胞增殖。

8.可选

1. 为了评估显著细胞衰老是否发生如划痕过程的结果，搔抓¹⁹之后执行在测试板上的衰老相关的β-半乳糖苷酶测定在预定的时间。

结果

这里介绍的划痕试验用鼠肺间质居民基质细胞（LR-MSCS）进行，分离引用在协议中说明。在LR-MSCs的接种500,000个细胞在60毫米组织培养皿的密度，并在48小时生长至90％汇合。为了产生损害，4％CSE（如上所述）中的与细胞一起培养24小时后的初始播种期间，但在划痕试验前。对于每个测定，用200μl移液管尖端部中产生的划痕。最初的图像拍摄已产生的划痕后，任何松散的细胞和碎片已经被冲走完整的媒体。 如图1A和 B，适当合流重要的是要确保成像软件可以正确识别划伤的边界。 如图1C所示，细胞不是充分汇合（因为接种密度不足的任，不足增量ubation倍，或过度损伤），这可能会导致划痕与不是容易由成像软件（图1D）区分异构边界。 图2展示了图像采集和分析。 图2A示出了分析前的原始图象。 图2B示出在"进程"菜单中的"查找边缘"工具的结果（步骤4.2）和图2C显示图像如下...

讨论

这里描述的协议提供了一个强大的定量，标准化的方法来执行和分析划痕试验。简单划痕测定法常规使用的在研究的许多不同领域，研究细胞迁移。然而，传统上的划痕试验一直缺乏标准化设置和定量协议，这已导致问题重复性^7,10。许多的修改和优化用于提高划痕试验的减少这些问题，包括个人的活细胞成像，标准化塞为基础的测定，和三维微柱测定^-4,8,10。但是，这些测定法可能难以定制或调整¹⁰和对于一些应用，这些技术也可以成本过高。

以产生标准化的划痕测定方案，存在需要对细胞invol特定信息在协议几个关键步骤这里提出基于相关细胞特征VED，以及将分析的优化。特别是，它以优化，以达到均匀的单层在90-100％汇合的测定（步骤1.3和步骤1.4）所需要的细胞的数量和在必要培养的时间是很重要的。太少细胞（小于90％汇合），细胞不会形成足够的单层。这不仅会影响到细胞微环境，但它也将影响正确识别划伤的边缘的成像软件的能力。与此相反，太多的细胞单层（100％汇合，或堆叠的细胞）可能导致接触抑制，并因此改变细胞的迁移特性。划痕试验方案的一些变推荐细胞生长...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM（高葡萄糖，不添加谷氨酰胺）	Life Technologies	31053-036
牛血清，Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3091002
抗生素/抗真菌剂，Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SV3007901
谷氨酰胺，200 mM，Thermo Scientific HyCloneFisher	Scientific	SH3003401
TypeLE 细胞解离试剂	Life Technologies	12563-01
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水，Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3002802
Falcon 标准 60 mm 组织培养皿	Fisher Scientific	08-772B
Fisherbrand 无菌 200 μl 移液器吸头	Fisher Scientific	02-707-502
带相机附件的倒置光学显微镜	Variable
ImageJ 软件	http://imagej.nih.gov/ij/
MRI_Wound_Healing 插件	http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool
Excel			统计分析软件