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方法文章

研究核细胞周期激酶Cdk1在线粒体定位与功能的实验方法

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DOI：

10.3791/53417

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2016年2月25日

 ,  ,  , 
1Radiation Oncology, University of California, Davis

本文内容

摘要

本文概述了如何研究一种（细胞周期）激酶在线粒体中的定位，以及如何确定其在线粒体内的亚结构定位和潜在的线粒体底物或靶标。将蛋白强制表达于线粒体中，是研究目的蛋白在线粒体定位后所产生功能效应的有效工具。

摘要

尽管线粒体拥有自身的转录机制，但仅有约1%的线粒体蛋白在线粒体内合成。由细胞核编码的蛋白则通过其线粒体靶向序列（MTS）被转运至线粒体；然而，大多数定位于线粒体的蛋白并不具有可识别的MTS。尽管如此，MTS能够引导蛋白进入线粒体这一特性，为研究通常定位于细胞核和/或细胞质的蛋白在线粒体中的功能提供了有价值的工具。我们近期在线粒体中鉴定了细胞周期激酶CyclinB1/Cdk1复合物。为了特异性地研究该复合物在线粒体中的功能，必须实现在线粒体中对该复合物的过表达和敲低，同时不干扰其在细胞核或细胞质中的功能。通过将CyclinB1/Cdk1与MTS融合标记，我们成功实现了该复合物在线粒体中的过表达，从而研究其线粒体靶标及功能。此外，通过将显性负性Cdk1与MTS融合标记，实现了对Cdk1活性的特异性线粒体抑制。我们采用基于凝胶的蛋白质组学方法鉴定了CyclinB1/Cdk1复合物潜在的线粒体靶标。与传统的二维凝胶分析不同，我们采用了二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）技术，并结合磷酸化蛋白染色，对表达线粒体Cdk1的细胞中差异磷酸化的蛋白进行荧光标记。通过比较野生型与携带显性负性Cdk1的线粒体中发生改变的磷酸化蛋白点，确定了Cdk1的线粒体靶标。最后，为了确定CyclinB1/Cdk1在线粒体中定位对细胞周期进程的影响，我们使用合成胸腺嘧啶类似物EdU（5-乙炔基-2′-脱氧尿苷）进行细胞增殖检测，以监测细胞在细胞周期中的进程及其DNA复制情况。综上所述，我们展示了一系列可用于研究细胞周期激酶在线粒体中定位与活性的方法。这些方法先进且易于操作，将对众多细胞生物学研究人员具有重要帮助。

引言

在哺乳动物中，细胞周期的进程依赖于由细胞周期蛋白（cyclins）和细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdks）调控的高度有序的事件1。CyclinB1/Cdk1通过其在细胞质、细胞核和中心体的定位，能够协调有丝分裂中的多种事件，例如核膜破裂和中心体分离2。CyclinB1/Cdk1可保护有丝分裂期细胞免于凋亡3，并促进线粒体分裂，这是线粒体均等分配至新形成的子细胞的关键步骤4。

在增殖的哺乳动物细胞中，线粒体ATP通过氧化磷酸化（OXPHOS）系统（即电子传递链）生成，该系统由5个多亚基复合物组成：复合物I至复合物V（CI-CV）。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）：泛醌氧化还原酶，即复合物I（CI），是这五种复合物中最大且最不明确的一个5。该复合物包含45个亚基，其中14个构成催化核心。组装完成后，复合物呈现L形结构，一臂伸入基质，另一臂嵌入内膜6,7。CI亚基的突变可导致多种线粒体疾病8。功能高效的CI不仅对整体线粒体呼吸至关重要9，也对细胞周期的顺利进行具有重要作用10。揭示该膜结合酶复合物在健康与疾病状态下功能机制，有助于开发新型诊断方法和先进治疗策略。在最近的一项研究中，我们发现CyclinB1/Cdk1复合物在G2（间隙2期）/M（有丝分裂期）阶段转位至线粒体，并磷酸化CI亚基，从而增强线粒体能量产生，可能用于满足细胞周期过程中增加的能量需求11。本文以CyclinB1/Cdk1为例，展示可用于研究通常位于细胞核/细胞质的激酶向线粒体的转位、其线粒体底物以及其在线粒体定位后功能影响的实验方法与策略。

研究发现，CyclinB1/Cdk1 复合物在需要时会转位至线粒体，这一发现推动了针对该复合物在线粒体中特异性过表达和敲低的研究。为实现蛋白质在线粒体中的特异性表达，可在目标蛋白的 N 末端添加一段线粒体靶向序列（mitochondria targeting sequence, MTS）。线粒体靶向序列能够将线粒体蛋白分选至其正常定位的线粒体中12。我们采用了一段来源于人细胞色素 c 氧化酶亚基 8A（COX8）前体的 87 个碱基的线粒体靶向序列，并将其以同框方式克隆至表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的 CyclinB1 或红色荧光蛋白（RFP）标记的 Cdk1 的质粒中。该方法使我们能够将 CyclinB1 和 Cdk1 特异性地靶向至线粒体，从而在不影响其细胞核内蛋白水平的情况下，特异性改变它们在线粒体中的表达。通过荧光标记这些蛋白，我们能够实时监测其定位情况。类似地，我们也将 MTS 引入含有 RFP 标记的显性负性 Cdk1 的质粒中，从而特异性地敲低 Cdk1 在线粒体中的表达及其功能。对于像 Cdk1 这类具有双重定位的激酶，区分其在线粒体和细胞核中的功能至关重要。将 MTS 构建至这些双功能激酶的 N 末端，是一种简便且高效的策略。

由于Cdk1是一种细胞周期激酶，因此在Cdk1定位于线粒体时，确定细胞周期进程显得至关重要。为此，我们采用了一种新方法来监测细胞中的DNA含量。传统方法包括使用BrdU（溴脱氧尿苷），这是一种合成的胸苷类似物，可在细胞周期S期掺入新合成的DNA中以替代胸苷。随后可通过抗BrdU抗体检测正在活跃复制DNA的细胞。该方法的一个缺点是需要通过强酸或高温等剧烈手段对DNA进行变性处理，以便BrdU抗体能够结合，这可能导致实验结果不一致13,14。作为替代方案，我们采用了一种类似的方法，使用另一种胸苷类似物EdU来监测活跃分裂的细胞。EdU检测无需剧烈的DNA变性处理，仅需温和的去垢剂处理即可使检测试剂进入新合成的DNA并与EdU结合。EdU方法已被证明更加可靠、结果更一致，并具有实现高通量分析的潜力15。

最后，为了确定Cdk1的线粒体底物，我们使用了一种名为二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）的蛋白质组学工具，这是经典双向凝胶电泳的高级版本。双向电泳在第一维中根据蛋白质的等电点进行分离，在第二维中根据其分子量进行分离。由于磷酸化等翻译后修饰会影响蛋白质的等电点和分子量，因此二维凝胶可以检测不同样品中蛋白质磷酸化状态的差异。蛋白质斑点的大小（面积和强度）随蛋白质表达水平的变化而变化，从而实现多个样品之间的定量比较。利用该方法，我们能够区分在表达野生型与突变型线粒体靶向Cdk1的细胞中磷酸化蛋白质的差异。那些在野生型样品中出现但在线粒体靶向突变型Cdk1样品中缺失的特异性蛋白质斑点被分离出来，并通过质谱分析进行鉴定。

在传统的二维凝胶电泳中，使用三苯甲烷类染料对凝胶上的蛋白质进行显色。二维荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）则采用对蛋白质电泳迁移率影响极小的荧光蛋白标记物。不同的蛋白质样品可用不同的荧光染料标记后混合，并在同一块凝胶中进行分离，从而实现多个样品在单块凝胶上的共电泳16。这种方法可显著减少凝胶间的差异，而凝胶间差异是基于凝胶的蛋白质组学研究中的一个关键问题。

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方案

1. 从培养细胞中分离线粒体

  1. 细胞分离缓冲液（IBc缓冲液）的配制
    1. 配制 0.1 M Tris/MOPS（三（羟甲基）氨基甲烷/3-(N-吗啉丙磺酸）：将12.1 g Tris溶解于800 ml蒸馏水中，使用MOPS粉末调节pH至7.4，加蒸馏水定容至1 L，4 ℃保存 oC.
    2. 配制 0.1 M EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸）/Tris：将 38.1 g EGTA 溶于 800 ml 蒸馏水中，用 Tris 粉末调节 pH 至 7.4，加蒸馏水定容至 1 L，4 ℃ 保存 oC.
    3. 制备1 M蔗糖溶液：将34.23 g蔗糖溶解于100 ml蒸馏水中，分装为20 ml等份，于-20℃保存 oC.
    4. 制备 IBc 缓冲液：配制100 ml IBc 缓冲液配制：向20 ml溶液中加入10 ml 0.1 M Tris/MOPS和1 ml 0.1 M EGTA/Tris 1 M蔗糖溶液。加蒸馏水至总体积100 ml。调节pH至7.4。
  2. 细胞裂解缓冲液的制备
    1. 配制含有20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA（乙二胺四乙酸）、1 mM EGTA、1% Triton-X-100、2.5 mM 焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸钠、1 mM 原钒酸钠的裂解缓冲液。使用前立即加入蛋白酶抑制剂，包括1 µg/ml 亮抑蛋白酶肽（Leupeptin）和1 mM PMSF（苯甲基磺酰氟）。
  3. 线粒体的分离
    1. 收获 3 × 107 用预冷的1×PBS（磷酸盐缓冲盐水），pH 7.4，洗涤细胞，于4℃下以600 × g离心10分钟 oC. 弃去上清液，将沉淀重悬于 5 ml 冰冷的 IB 中c 缓冲液
    2. 使用玻璃/玻璃组织研磨器匀浆细胞，持续约10分钟。将匀浆液转移至15 ml离心管中，在4℃下以600 × g离心10分钟。 oC. 对于功能完整的线粒体，应使用玻璃/特氟龙研磨器，因其对线粒体的损伤小于玻璃/玻璃组织研磨器。
    3. 将上清液收集至1.5 ml离心管中，于4°C下以7,000 x g离心10分钟 oC. 将上清液转移至1.5 ml离心管中，作为胞质蛋白保存。
    4. 用 200 µl 冰冷的 IB 缓冲液将沉淀（线粒体）洗涤两次c 缓冲液重悬，4 ℃下以 7,000 × g 离心 10 分钟 oC.
    5. 弃去上清液，将沉淀重悬于细胞裂解缓冲液中，立即使用或于-80℃保存 oC 以备后续使用。若需要具有功能的线粒体，可在弃去上清液后，用剩余的缓冲液重悬沉淀。进一步稀释线粒体组分可能导致线粒体功能丧失。样品需置于冰上保存，并在制备后1–3小时内使用，以获得最佳效果。
    6. 将重悬的沉淀物在冰浴中进行超声处理，每次3秒，共30次；然后在10,000 × g离心5分钟，保留上清液作为线粒体组分。

2. Cdk1、CyclinB1 与线粒体定位蛋白 COXIV 的共免疫染色

  1. 在24孔板中将5 × 104个细胞接种于盖玻片上，培养过夜 或至细胞融合度达70%。吸除培养基，用500 µl预冷的1 × PBS（pH 7.4）洗涤细胞两次。
  2. 加入500 µl预冷的4%多聚甲醛，在室温 下固定细胞10分钟。吸除固定液，用500 µl 1 × PBS在室温下轻轻振荡洗涤3次，每次5分钟。
  3. 加入含0.2% Triton X-100的500 µl PBS溶液，在室温下透化细胞5分钟。吸除溶液后，用500 µl PBS洗涤3次，每次5分钟。加入封闭液（500 µl，含1% Tween 20的PBS缓冲液配制的1% BSA（牛血清白蛋白）），室温封闭30分钟。
  4. 将一抗按1:250（v:v）比例溶于500 µl封闭液中，使用不同物种来源的一抗以避免交叉信号（如CyclinB1（小鼠）与COXIV（兔）或Cdk1（小鼠）与COXIV（兔）），在室温下孵育30–60分钟，或在4 oC过夜孵育。
  5. 用500 µl 1 × PBS洗涤盖玻片3次，每次5分钟，然后加入用500 µl封闭液按1:1,000稀释的二抗，室温孵育1小时，再用500 µl PBS洗涤3次，每次5分钟。
  6. 滴加20 µl抗荧光淬灭封片液将盖玻片封固于载玻片上，并用指甲油密封边缘。立即使用荧光显微镜观察成像，或置于4 oC避光保存1–2周。

3. 完整线粒体的碳酸钠提取

  1. 培养约 20 × 107 个细胞，收集后用 PBS 洗涤一次，并按照第 1 节所述方法分离线粒体。在最后一次离心形成线粒体沉淀前（步骤 1.3.4 之前），将线粒体样品分为两部分：保留一半用于总线粒体分析（步骤 3.2），另一半用于碳酸钠提取（后续步骤 3.3–3.6），以分离可溶性蛋白和膜结合蛋白。
  2. 用 30 µl 细胞裂解缓冲液裂解总线粒体沉淀，将裂解液储存于 -80 oC，待后续用于免疫印迹分析。
  3. 向另一半线粒体沉淀中加入 250 µl 0.1 M Na2CO3（碳酸钠），pH 11.0，冰上孵育 30 分钟。
  4. 以 100,000 × g 离心 20 分钟。收集上清液并进行步骤 3.5。用 30 µl 细胞裂解缓冲液裂解沉淀，并按步骤 1.3.6 进行超声处理。储存于 -80 oC，待后续用于免疫印迹分析。
  5. 向上清液中加入等体积的 20% 新鲜配制的三氯乙酸（TCA），以沉淀蛋白质，冰上静置 30 分钟。
  6. 以 15,000 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀溶解于 80 µl 细胞裂解缓冲液中，储存于 -80 oC，待后续用于免疫印迹分析。

4. 线粒体内膜与外膜的分离（线粒体基质裸粒的制备）

  1. 培养约 20 × 107 个细胞，收集后用 PBS 洗涤一次，并按照第 1 节所述方法分离线粒体。在最后一次离心沉淀线粒体之前（即步骤 1.3.4 之前），将线粒体组分均分为 10 份。
  2. 将每份沉淀溶解于 30 µl 含有指定浓度低渗蔗糖缓冲液（1 mM EDTA，10 mM MOPS/KOH（氢氧化钾），pH 7.2；蔗糖浓度范围为 25–200 mM）中，可选择性加入 50 µg/ml 胰蛋白酶（见表 1），冰上孵育 30 分钟。
  3. 向含有胰蛋白酶的管中加入 3 µl 10 mM PMSF（使 PMSF 的终浓度达到 1 mM），以终止胰蛋白酶消化反应，冰上继续孵育 10 分钟。
  4. 在 4 oC 下以 14,000 × g 离心 10 分钟。将上清液转移至新管中，用 30 µl 细胞裂解缓冲液重悬沉淀，按步骤 1.3.6 进行超声处理，随后于 -80 oC 保存。

5. 线粒体靶向GFP/RFP标记的CyclinB1/Cdk1载体的构建及其线粒体定位的验证

  1. 将线粒体靶向序列（MTS；来源于人细胞色素c氧化酶亚基8A（COX8）前体的第76–161位核苷酸）通过标准分子克隆技术，以正确的阅读框插入pEGFP-N1或pERFP-N1载体的NheI和BamHI位点，连接至GFP或RFP的N端。
  2. 设计CyclinB1和Cdk1基因的PCR引物时，在引物的5'端添加BamHI限制性内切酶识别位点（加粗）。
    正向 Cdk1 BamH1 5' CAG TGG ATC CAA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    反向 Cdk1 BamH1 5' CTG TGG ATC CTG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
    正向引物 CyclinB1 BamH1 5' ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
    反向 CyclinB1 BamH1 5' ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
  3. 使用上述引物，采用标准技术扩增 Cdk1 和 CyclinB1 基因。加入 1 µl BamHI 限制性内切酶，在 37 °C 条件下消化 PCR 产物 2 小时。将消化产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳。用剃刀切下大小正确的 DNA 片段，并使用凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化 DNA。
  4. 用1 µl BamHI酶在37 °C下消化1 µg MTS-pEGFP-N1和MTS-pERFP-N1质粒，反应2小时。加入1 µl小牛肠碱性磷酸酶（CIP），在37 °C孵育30分钟。将消化产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，并参照步骤5.3从凝胶中纯化线性质粒。
  5. 将5.4步骤中的1 µl质粒和5.3步骤中的5 µl Cdk1或CyclinB1加入3 µl连接酶缓冲液、0.5 µl T4连接酶和20.5 µl dH₂O中，配制连接反应体系2O. 4 °C 条件下孵育过夜。
  6. 转化 大肠杆菌 将10 µL连接产物加入DH5α感受态细胞，按照标准操作程序转化，并在含10 mg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上于37 °C过夜培养以获得菌落。
  7. 挑取一个菌落 用无菌移液器枪头挑取过夜培养的平板菌落，将枪头插入含5 ml卡那霉素-LB培养基的离心管中，过夜培养。按照生产商说明书，使用质粒小提试剂盒提取质粒，并采用标准方法进行质粒测序。
  8. 转染指数生长期的 MCF10A 细胞（1.5 × 104 将第5.7步制备的MTS-Cdk1-RFP或MTS-CyclinB1-GFP质粒以质粒/转染试剂比例1:2（w:v，100 ng:0.2 µl）加入100 µl无血清无抗生素培养基中，转染接种于96孔板的细胞。
  9. 将细胞在质粒/试剂混合物中于37 °C的CO₂培养箱中孵育48小时。2 带有湿度控制的培养箱（5% CO₂）2，95% 相对湿度）。
  10. 配制线粒体红色和绿色荧光染料的1 mM储存液：将50 µg粉末溶于100 µl DMSO中。将储存液用1×PBS稀释400倍，得到2.5 µM的工作液。储存液可在-20 °C保存一年。
  11. 将2 µl浓度为2.5 µM的红色染料与98 µl培养基混合，配制终浓度为50 nM的溶液。
  12. 将携带CyclinB1-GFP的MCF10A细胞（步骤5.8中构建）的细胞培养基更换为含红色染料的培养基，孵育2分钟。对携带Cdk1-RFP的MCF10A细胞，重复相同操作，使用含绿色染料的培养基。
  13. 用 100 µl 1 × PBS 洗涤两次，以去除多余的染色液，然后向 96 孔板中加入 100 µl 1 × PBS。
  14. 在荧光显微镜下以40倍物镜观察96孔板中的线粒体以及CyclinB1-GFP（激发波长488 nm，发射波长494 - 536 nm）和Cdk1-RFP（激发波长560 nm，发射波长565 - 620 nm） 放大倍数

通过二维差异凝胶电泳鉴定差异磷酸化蛋白质

  1. 样品制备
    1. 分离线粒体并裂解线粒体组分，步骤同1.3。向每个样品中加入等体积的20%三氯乙酸（TCA，溶于水），涡旋15秒。将样品置于冰上孵育30分钟，使蛋白质从溶液中沉淀析出。
    2. 在4°C下以9,300 × g离心5分钟，弃去上清液，加入60 µl冷丙酮（100%），再在4°C下以9,300 × g离心5分钟。
    3. 重复丙酮洗涤步骤（步骤6.1.2）一次，弃去上清液，将样品重悬于50 µl DIGE标记缓冲液（7 M尿素，2 M硫脲，4% CHAPS，30 mM Tris，pH 8.5）中。
  2. 制备荧光染料
    1. 制备储备液：将染料（5 nmol）溶解于5 µl新鲜的二甲基甲酰胺（DMF）中，终浓度为1 nmol/µl。将染料储备液保存于-20 oC，可使用数月。
    2. 制备工作液：将染料在室温放置5分钟。取1 µl染料用4 µl DMF稀释，终浓度为200 pmol/µl。使用期间保持在冰上。注意：工作液可在-20 oC保存3周。
  3. 蛋白质标记
    1. 每12.5 µg蛋白质加入1 µl工作染料溶液。根据需要按比例放大。对于混合标准品，向300 µg混合蛋白质中加入6 µl Cy2工作溶液。
    2. 涡旋30秒，在4°C、12,000 × g离心30秒。避光冰上孵育30分钟。每使用1 µl工作液，加入1 µl 10 mM赖氨酸终止标记反应。充分混匀后，避光冰上继续孵育10分钟。
    3. 将分别标记的样品混合，并与再水化缓冲液（7 M尿素，2 M硫脲，4% CHAPS，1.2% destreak，1% pharmalytes，溴酚蓝）混合。总体积为125 µl。
    4. 涡旋样品30秒，室温静置30分钟。将125 µl样品上样至7 cm pH 4–9的等电聚焦（IEF）胶条上。
  4. 第一维电泳
    1. 将胶条槽（棺槽）放置在电极板上，确保胶条槽完全清洁且干燥。用移液器将125 µl样品加入棺槽中，均匀分布在整个槽内。
    2. 使用镊子取出IEF胶条，小心移除塑料保护膜，将胶条（凝胶面向下）放入棺槽/再水化缓冲液中。避免产生气泡。缓慢向棺槽中加入矿物油（1–1.5 ml），然后盖上棺槽盖。
    3. 按照表2中的方案开始等电聚焦：
      注意：运行完成后，胶条可保存于塑料管中置于-80 oC，或直接进行平衡处理并进入第二维电泳。
  5. 第二维——十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
    1. 平衡处理
      1. 解冻SDS平衡缓冲液（每根胶条8 ml，含6 M尿素，30%甘油，2% SDS）。称取二硫苏糖醇（DTT；每1 ml SDS平衡缓冲液加10 mg DTT），将DTT溶解于4 ml SDS平衡缓冲液中。
      2. 称取碘乙酰胺（IAA；每1 ml SDS平衡缓冲液加25 mg IAA），将IAA溶解于4 ml SDS平衡缓冲液中。
      3. 在水浴中融化1 ml封胶用琼脂糖溶液，备用。
      4. 若胶条已冷冻，请完全解冻。将胶条凝胶面向上放入再水化托盘中。每根胶条加入4 ml含DTT的SDS平衡缓冲液，轻轻振荡孵育15分钟。
      5. 倒掉所有含DTT的SDS平衡缓冲液。每根胶条加入4 ml含IAA的SDS平衡缓冲液，继续轻轻振荡孵育15分钟。IAA缓冲液平衡完成后，倒掉SDS平衡缓冲液。
    2. SDS-PAGE
      1. 拆开小型凝胶，取出梳子，用ddH2O冲洗凝胶及加样孔。电泳前移除凝胶底部的白色胶带。正确放置胶条于凝胶上，凝胶方向对蛋白点切割至关重要。
      2. 将凝胶小板朝上、凝胶顶部面向操作者平放于实验台。将胶条放置于大板上，阳极端（++端，即条形码端）朝向凝胶左侧。使用直尺缓慢将胶条压至凝胶表面，避免胶条与凝胶之间产生气泡。将凝胶竖直立于玻璃板支架中。
      3. 向胶夹的开口处加入1 ml热封胶琼脂糖溶液。使用平直尺确保所有气泡被挤出。组装电泳装置，以恒定125 V电压运行90分钟。
      4. 电泳结束后，将凝胶置于分子成像仪上，加入2 ml ddH2O，使用635 nm激发激光和665 nm发射滤光片，在荧光采集模式下扫描凝胶。
    3. 磷酸化蛋白染色
      1. 用50%甲醇和10%乙酸混合液（10 ml）固定凝胶，每次30分钟，重复两次。用10 ml水洗涤10分钟，重复三次。加入10 ml磷酸化蛋白染色液染色60–90分钟，随后用10 ml脱色液脱色30分钟，重复三次。
      2. 用10 ml水洗涤5分钟，重复两次，使用激光凝胶扫描仪在532 nm激发/560 nm发射条件下成像。
    4. 蛋白质消化与鉴定
      1. 根据制造商说明，使用自动蛋白点切割仪将凝胶中所有差异表达的蛋白点切割并转移至微孔板孔中。加入100 mM碳酸氢铵（2 ml），室温孵育1小时以脱色。用2 ml 100%乙腈洗涤两次进行脱水，并在真空浓缩仪中干燥30分钟。
      2. 用100 µl含13 ng/µl修饰猪胰蛋白酶的50 mM碳酸氢铵溶液重悬凝胶块，在37 °C孵育16小时。收集上清液，并用100 µl含5%三氟乙酸的50%乙腈溶液进一步提取蛋白质30分钟。
      3. 通过真空离心浓缩仪将肽段浓缩至5 µl，进行基质辅助激光解吸电离-飞行时间-串联质谱分析（MALDI TOF-MS/MS）17。

7. 体外 激酶活性检测

  1. 基底的制备
    1. 将鉴定为Cdk1差异磷酸化靶点的复合体I（CI）亚基（NDUFV1、NDUFV3、NDUFS2、NDUFB6和NDUFA12）亚克隆至pGEX-5X-1载体，以构建谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标签的细菌表达质粒11使用高亲和力谷胱甘肽柱，按照以下方案纯化CI亚基。
      1. 培养含有GST标签的CI亚基 大肠杆菌 在含有50 µg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）肉汤中，将BL-21菌株于37℃摇床培养 oC，直至光密度（OD）达到0.6。向培养物中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG），使其终浓度为0.1 mM，继续孵育3小时。
      2. 在600 × g下离心10分钟以收集细菌，然后重悬于5 ml含有5 mM DTT、1 ×蛋白酶抑制剂混合物和0.1%溶菌酶的1 × PBS缓冲液中。通过超声处理（二十次，每次5秒）裂解细胞，随后在600 × g下离心10分钟去除细胞碎片。
      3. 收集上清液，并按4:1的体积比（上清液：珠子）与谷胱甘肽-agarose 4B珠子在室温下孵育1小时。
      4. 用 3 ml 谷胱甘肽洗脱缓冲液（10 mM 还原型谷胱甘肽，50 mM Tris-HCl，pH 8.0）从琼脂糖珠上洗脱 GST 融合蛋白，并将洗脱后的蛋白置于分子量截留值为 12–14 千道尔顿的分子透析膜管中，对 1× PBS / 1 mM EDTA 进行透析。将纯化的蛋白储存于 -80 ℃ oC.
  2. Cdk1 激酶活性检测
    1. 开始激酶反应实验前，将加热模块预热至 30 °C 和 100 °C。在冰上解冻市售的 CyclinB1/Cdk1 酶复合物和底物。
    2. 在冰上配制反应混合液。由于 32若涉及P ATP同位素，请在含有O形圈的1.5 ml带螺口盖样品管中配制所有反应混合物，以防止放射性物质扩散。
      注意：遵守放射性材料防护规定。使用8 mm厚的有机玻璃屏蔽，并在至少一臂距离外操作。用水擦拭任何受污染区域。 
    3. 配制30 µl反应缓冲液，其中包含1 x Cdk1缓冲液（50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0.01% Brij 35, pH 7.5）、0.6 mM冷ATP和0.1 µCi 32P ATP，2单位CyclinB1/Cdk1和6 µg底物蛋白。用ddH₂O调整体积至30 µl。2O. 作为阳性对照反应，将底物替换为0.01 mM组蛋白H1，后者是已知的CyclinB1/Cdk1底物。
      1. 阴性对照反应中，(1) 仅以 GST 蛋白替代底物，(2) 以 0.01 mM 组蛋白 H1 加 0.5 µM RO-3306 替代底物，其中 RO-3306 为选择性 Cdk1 抑制剂。
    4. 用移液器充分混匀，离心使所有液体沉降至管底，以最大限度降低污染风险。在30 °C下孵育60分钟。
    5. 加入6 µl 5x SDS上样缓冲液以终止反应，并在100℃下变性 oC 下孵育 10 分钟。在 160 V 条件下电泳 2 小时，或直至染料前沿迁移至凝胶底部，使用 10% SDS-PAGE 凝胶分离样品。将凝胶转移至层析滤纸上，并用保鲜膜包裹。
      注意：所有接触过放射性同位素的液体均应作为放射性废物处理，并按照机构规定，置于环境健康与安全管理部门提供的5加仑聚乙烯废液桶中处置。
    6. 将凝胶在 -20℃ 下曝光至 X 射线胶片，时间可为 1 天至最长 1 周 oC，具体取决于所用放射性同位素的活性及酶的种类。

8. 位点定向诱变以生成显性负性Cdk1（D146N）

  1. 设计定点突变引物：两条相互互补的引物，包含突变位点（G将被A核苷酸取代，从而编码N而非D氨基酸），突变位点两侧各包含20个碱基11。
  2. 配制50 µl的聚合酶链式反应（PCR）体系，包含1×反应缓冲液、2.5 mM dNTPs、10 µM引物（正向和反向引物）、40 ng模板DNA和ddH2O。向反应体系中加入2.5 U DNA聚合酶。
  3. 运行以下PCR程序：95 °C 3 min，95 °C 30 sec，55 °C 30 min，68 °C 6 min；共16个循环（注意：68 °C的延伸时间根据DNA大小确定。对于≤10 kb的DNA，需1 min/kb；对于更大的DNA，需2 min/kb，并额外增加每个循环10 sec）。随后在68 °C延伸7 min，然后在4 °C保存备用。
  4. 向反应体系中加入2 µl Dpn I限制性内切酶（10 U/µl）和5.7 µl Dpn I缓冲液，轻轻弹击管壁混匀，于37 oC孵育1小时。
  5. 取10 µl经Dpn I处理的PCR产物，转入50 µl DH5α感受态细胞中进行转化。冰上孵育30分钟，随后42 oC热激45秒，再置于冰上5分钟。加入500 µl LB培养基，在37 oC摇床中振荡培养1小时，然后涂布于LB-琼脂平板。于37 oC过夜培养。
  6. 用无菌黄色枪头从过夜培养的琼脂平板上挑取单菌落，将枪头直接投入含有5 ml LB培养基的离心管中，在37 oC摇床中过夜培养。使用质粒小提试剂盒提取质粒，并按照制造商说明书进行测序，以确认突变是否成功引入。

9. 利用EdU掺入法测定细胞周期各时相的持续时间

  1. 细胞分选
    1. 在6孔板中，使用无血清和抗生素的培养基2.5 ml配制DNA与转染试剂按1:2（w:v，2.5 µg:5 µl）比例混合的溶液，转染2 × 105个细胞，持续48小时。通过流式细胞仪对稳定表达GFP标记的Cdk1和RFP标记的CyclinB1蛋白的活细胞进行分选。
      1. 用1 × PBS洗涤细胞，向培养皿中加入100 µl胰蛋白酶，在37 oC孵育5分钟。加入2 ml培养基收集细胞，并通过70 µm滤膜制备单细胞悬液。在上机前，用500 µl含1%胎牛血清的PBS（FCS/PBS）洗涤单细胞悬液。
      2. 根据已建立的实验方案18设置分选参数，圈选同时表达GFP和RFP的双阳性细胞。将从流式细胞仪分选出的细胞收集至含有细胞培养基的离心管中，并用于后续通过EdU脉冲-追踪标记分析细胞周期进程（见第9.2节方案）。
  2. 利用EdU标记流式细胞术检测细胞周期长度
    1. 将分选后的细胞以每孔2.5 × 105个细胞的密度接种于6孔板中，在37 oC、CO2培养箱中过夜培养。向培养基中加入EdU，终浓度为25 µM，在37 oC、CO2培养箱中孵育1小时。
    2. 用含1% BSA的500 µl PBS洗涤细胞，并在2小时时间间隔下收集细胞至1.5 ml离心管中，共收集10–12小时。
    3. 以350 × g离心5分钟，弃去上清液。加入100 µl固定液（由EdU标记试剂盒厂商提供），室温作用15分钟，充分混匀以重悬细胞沉淀。
    4. 用含1% BSA的1 ml PBS洗涤细胞三次。再用0.5 ml 70%乙醇在4 oC过夜固定细胞。
      注意：乙醇固定对于淬灭因重组标签蛋白表达而产生的内源性GFP/RFP荧光至关重要。 
    5. 再次以350 × g离心5分钟，用含1% BSA的1 ml PBS洗涤一次沉淀。将细胞重悬于1 ml通透缓冲液（含0.1% Triton-X-100、1% BSA和0.2 mg/ml RNase A的PBS）中，室温孵育20分钟。
    6. 用含1% BSA的1 ml PBS洗涤一次。每管加入0.5 ml反应混合液，充分混匀。避光、室温孵育30分钟。
    7. 用含1% BSA的1 ml PBS洗涤一次，然后在含1% BSA的1 ml PBS中加入50 µg/ml碘化丙啶（PI）对DNA进行染色。
    8. 通过流式细胞术分析EdU阳性细胞群体。绘制EdU标记细胞的散点图，横轴为DNA含量（PI染色），纵轴为EdU（Alexa 647染色）。
      1. Alexa647-EdU使用APC通道检测，配备670/30带通滤光片，所有波长低于685 nm的光通过该滤光片；PI使用藻红蛋白（PE）通道检测，配备581/15带通滤光片，所有波长低于600 nm的光通过该滤光片。
      2. 将第一个含细胞的样品管放入流式细胞仪，采用标准设门策略进行数据采集：首先绘制FSC-Area与SSC-Area散点图以分析细胞形态，随后绘制PI（PE通道）与Alexa647-EdU（APC通道）散点图以分析染色情况。依次记录所有样品的数据，每个样本采集10,000个事件。
      3. 使用流式细胞术数据分析软件，依据已建立的实验方案11,30确定细胞周期各时相的分布及各时相持续时间。

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结果

细胞周期蛋白B1和Cdk1的线粒体亚定位

碳酸钠提取法可用于确定蛋白质是位于线粒体内还是位于外表面，即外膜。一旦证实蛋白质定位于线粒体内，可通过线粒体破膜（mitoplasting）结合蛋白酶消化进一步确定其线粒体亚结构定位。为明确CyclinB1或Cdk1的线粒体亚结构定位，通过将线粒体稀释至低渗缓冲液中，并逐步降低渗透性蔗糖浓度（从200 mM降至25 mM），从而分离获得线粒体破膜结构（mitoplasts）。当蔗糖浓度降至150 mM时，外膜开始破裂，而内膜则保持完整，直至蔗糖浓度最终降至25 mM（图1A）。结合线粒体破膜处理，可使用胰蛋白酶进行蛋白酶保护实验，消化外膜破裂后暴露的蛋白质，从而降解位于膜间隙的蛋白质。若目标蛋白质未被胰蛋白酶消化，则表明该蛋白质定位于线粒体基质。在此代表性图示中，线粒体基质蛋白Hsp60和膜间隙蛋白Timm13被用作线粒体亚结构定位的标志物。C...

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讨论

与其他靶向特定亚细胞器的蛋白质类似，线粒体靶向蛋白在其一级或二级结构中具有靶向信号，这些信号在复杂的蛋白质转运和折叠机器的协助下，引导蛋白质到达线粒体21,22。来源于 exclusively 定位于线粒体的蛋白质（如 COX8）的线粒体靶向序列（MTS）可被添加至任意基因序列的N端，从而将特定蛋白质靶向导入线粒体11,23,24。在此研究中，CyclinB1 和 Cdk1 基因被克隆至含有 COX8 MTS 的载体中，表达后，重组的 CyclinB1 和 Cdk1 被定位至线粒体。该方法的优势在于，可在不改变整体基因表达水平的前提下，实现对特定亚细胞区室（本例中为线粒体）内基因表达的调控。通过该策略，确定了核激酶 Cdk1 的线粒体特异性功能。类似地，通过将 MTS 添加至显性负性 Cdk1，实现了对 Cdk1 线粒体特异性功能的敲低，从而鉴定了 Cdk1 的线粒体特异性靶点，并可分析 Cdk1 功能在线粒体中缺失所导致的功能后果。若过表达未携带 MTS 标签的 Cdk1，则会导致 Cdk1 在线粒体和细胞核中均表达升高，从而复杂化对 Cdk1 线粒体特异性作用后果的进一步研究。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助 CA133402、CA152313 以及美国能源部科学办公室 DE-SC0001271 的支持。我们感谢加州大学戴维斯分校流式细胞术共享资源实验室，该实验室获得了美国国家癌症研究所（NCI）P30 CA0933730、NIH 国家研究中心资源（NCRR）C06-RR12088、S10 RR12964 和 S10 RR026825 资助，并感谢 Ms. Bridget McLaughlin 和 Mr. Jonathan Van Dyke 在流式细胞术实验中提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
32P ATP PerkinElmerBLU002001MC 
抗小鼠二抗Invitrogen A-11003Alexa-546 标记
抗兔二抗Invitrogen A11029Alexa-488 标记
ATP研究有机物1166A体外激酶实验
Cdk1 抗体细胞信号技术公司9112
Cdk1激酶缓冲液New England BiolabsP6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 成像试剂盒Life TechnologiesC10337使用 EdU 标记进行细胞周期分析
COX IV 抗体细胞信号技术公司4844S用于线粒体免疫染色
细胞周期蛋白B1抗体Santa Cruz Biotechsc-752
细胞周期蛋白B1/细胞周期蛋白依赖性激酶1酶复合物New England BiolabsP6020S避免冻融循环
CyDye DIGE 荧光标记试剂盒GE Healthcare Life Sciences25-8009-83
DIGE 凝胶和 DIGE 缓冲液试剂盒GE Healthcare Life Sciences28-9480-26 AA
二甲基甲酰胺 Sigma Aldrich319937DMF
二硫苏糖醇伯乐（Bio-Rad）161-0611DTT
dNTPEMD Millipore71004用于定点突变
Dpn I 酶Stratagene200519-53用于定点突变
干条覆盖液GE Healthcare Life Sciences17-1335-01用作矿物油
EDTAJ.T. Baker4040-03
EGTAAcros Organics409910250
Eppendorf Vacufuge 浓缩仪Fisher Scientific07-748-13用作真空离心浓缩仪
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01抗荧光淬灭封片液
Fortessa 流式细胞仪BD 生物科学649908使用 EdU 标记进行细胞周期分析
组蛋白 H1Calbiochem382150体外激酶实验
QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒Qiagen28704用于从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段
Immobiline DryStrip 凝胶GE Healthcare Life Sciences18-1016-61等电聚焦胶条
固定化谷胱甘肽赛默飞世尔科技15160谷胱甘肽-琼脂糖珠
碘乙酰胺Sigma AldrichI1149IAA
IPGphor 3 等电聚焦仪GE Healthcare Life Sciences11-0033-64IPGphor 胶条支架
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷 RPI Corp156000-5.0IPTG
亮抑蛋白酶肽Sigma AldrichL9783用于细胞裂解缓冲液
Lipofectamine 2000Life Technologies11668027转染试剂
赖氨酸Sigma AldrichL5501用于CyDye标记
溶菌酶EMD Chemicals5960
MitoTracker Red/GreenInvitrogen M7512/M7514线粒体荧光染料
MOPSEMD Chemicals6310
pEGFP-N1Clonetech6085-1表达GFP的载体
PfuStratagene600-255-52
pGEX-5X-1 GE Healthcare Life Sciences28-9545-53GST表达载体
苯甲基磺酰氟Shelton ScientificIB01090PMSF
磷酸盐缓冲液Life Technologies14040PBS
Spectra/Por 4 透析管Spectrum Labs132700用于透析的多孔膜管
Pro-Q Diamond 磷蛋白凝胶染色剂Life TechnologiesP-33300用于二维凝胶上磷酸化蛋白的染色
蛋白酶抑制剂混合物Calbiochem539134用于细胞裂解缓冲液
QuikChange 定点突变试剂盒Stratagene200519-5
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒Qiagen27104MiniPrep 质粒提取试剂盒
RO-3306Alexis 生物化学公司270-463-M001Cdk1抑制剂
鱼藤酮MP Biomedicals150154复合物 I 抑制剂
碳酸钠Fisher ScientificS93359
氯化钠EMD ChemicalsSX0420-5用于细胞裂解缓冲液
偏钒酸钠MP Biomedicals159664用于细胞裂解缓冲液
十水合焦磷酸钠Alfa Aesar33385用于细胞裂解缓冲液
钠 β-甘油磷酸盐Alfa AesarL03425用于细胞裂解缓冲液
SpectraMax M2e Molecular DevicesM2E酶标仪
蔗糖Fisher Scientific57-50-1
组织研磨器杵Kimble Chase885301-0007用于线粒体分离
组织研磨管Kimble Chase885303-0007用于线粒体分离
三氯乙酸溶液Sigma AldrichT0699TCA
TrisMP Biomedicals103133
Triton X-100TeknovaT1105
胰蛋白酶Calbiochem650211
台风成像仪GE Healthcare Life Sciences28-9558-09用于二维差异凝胶电泳的激光凝胶扫描仪
辅酶QSigma AldrichC7956

参考文献

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