离体 培养鸡小脑切片及颗粒细胞前体的靶向电穿孔

摘要

小脑外颗粒层是发育中大脑内发生最大规模过渡性扩增的部位。本文介绍了一种在增殖高峰期靶向该层进行遗传修饰的实验方案 离体 电穿孔及培养孵化第14天鸡胚胎的小脑切片

摘要

小脑外颗粒层（EGL）是发育中大脑内发生最大规模转分化扩增的部位，也是研究神经元增殖与分化的理想模型。此外，该层增殖能力在进化过程中的改变，导致了羊膜动物小脑体积的显著扩张，使小脑成为研究脊椎动物脑部演化发育（evo-devo）的优良模型。构成EGL的细胞——小脑颗粒细胞前体，同时也是最常见的儿童神经元肿瘤——髓母细胞瘤的重要起源细胞之一。经过转分化扩增后，颗粒细胞前体径向迁移至小脑内颗粒层，在成熟哺乳动物大脑中形成数量最多的神经元群体。在鸡胚中，EGL增殖高峰出现在孵化第二周的末期。为了在增殖高峰期特异性靶向该层进行遗传修饰，我们建立了一种通过体外（ex vivo）电穿孔技术对孵化第14天鸡胚小脑切片进行遗传操作的方法。该方法重现了体内（in vivo）颗粒神经元发育的多个关键特征，将有助于深入理解小脑颗粒细胞的增殖与分化机制，从而推动对小脑发育、进化及疾病的研究。

引言

小脑位于后脑的前端，在成熟大脑中负责感觉与运动信息的整合，同时也调控高级认知过程¹。在哺乳动物和鸟类中，小脑具有复杂的形态结构，并高度折叠，这种结构是发育过程中祖细胞大量迁移扩增的结果，由此产生的神经元占成年大脑神经元总数的一半以上。数百年来，小脑一直是神经生物学家的研究对象，在分子生物学时代同样受到广泛关注。这不仅源于其本身有趣的生物学特性，还因为它与多种人类疾病密切相关，包括自闭症谱系障碍等发育性遗传疾病²，以及最突出的小脑肿瘤——髓母细胞瘤³，后者是最常见的儿童脑肿瘤。重要的是，小脑是研究脑发育过程中细胞命运决定和神经发生的一个极佳模型系统⁴。近年来，由于在脊椎动物系统发育过程中观察到小脑形态的高度多样性，它也已成为脑发育比较研究的模型系统^5-10。

小脑起源于后脑菱脑节1的背侧半部分¹¹，在发育过程中主要由两类祖细胞群体构成：菱唇和室管膜区。菱唇环绕于后脑神经上皮背侧区域，位于其与顶板交界处，是小脑谷氨酸能兴奋性神经元的产生部位^12-14。室管膜区则产生抑制性GABA能小脑神经元，其中最显著的是体积较大的浦肯野神经元^14,15。在发育后期（小鼠约胚胎第13.5天；鸡胚约第6天¹⁶），谷氨酸能祖细胞从菱唇沿切线方向迁移，形成位于软脑膜下的一层祖细胞，即称为外颗粒层（EGL）的....

方案

注意：所有实验均按照英国伦敦国王学院及英国动物护理指南（UK Home Office animal care guidelines）进行。

1. e14 小脑的解剖

1. 将受精的褐色母鸡蛋在38 °C下孵育至胚胎第14天。
2. 使用卵剪去除鸡胚头部 在卵内 并将头部移至含有冰冻 PBS 的培养皿中（图1A).
3. 使用标准镊子，在每只眼睛后方穿过组织进行切口，取下眼睛和上颌。再做第二个切口，完全穿过咽部，取下下颌。图1B).
4. 使用标准镊子，通过剥离的方式将颅骨表面的所有皮肤完全去除（图1C) 并移除额骨和顶骨，暴露脑组织。
5. 从腹侧去除咽部软骨及附属间充质。
6. 从背侧小心去除小脑后方的间充质，注意不要损伤软脑膜，并分离出完整的大脑图1D).
7. 在中脑与后脑之间完全切开组织，分离包含小脑在内的后脑图1E).
8. 通过在小脑与后脑翼板两侧交界处完全切透组织，完整移除小脑，注意在整个解剖过程中保持软脑膜的完整性（图1F）。移除正在形成的脉络丛（图1G).
9. 将解剖出的小脑移....

结果

本部分展示了使用孵化第14天鸡胚小脑进行脑片电穿孔及培养所能获得的结果示例。小脑解剖过程如图1所示，电穿孔腔室的组装如图2所示。我们证明了可以对小脑脑片进行电穿孔并成功进行体外培养，脑片在体外仍能保持其组织结构和细胞形态（in vitro）（图3A）。可轻松实现对单个叶片（folia）的靶向电穿孔（图3B）。我们成功将多种不同的质粒电穿孔转入外颗粒层（EGL）细胞中，并证明了以下可能性：i）利用报告基因构建体标记细胞以观察其行为（图3C）；ii）检测基因组特定区域在小脑细胞中的功能活性（图3D）；以及iii）通过过表达目的蛋白对EGL细胞进行遗传操作（图3E）。此外，还可对电穿孔后的脑片进行药理学处理（结果未显示）。培养后可进一步进行组织分析，如免疫组织化学染色或增殖检测（图3F）。我们.......

讨论

本文报道的方案描述了一种对鸡胚第14天小脑进行切片、电穿孔和培养的方法。该方案能够将电穿孔靶向至外颗粒层（EGL）的微小局灶区域，包括单独靶向单个小脑叶。与现有的啮齿类动物技术相比，该方法可在高分辨率、操作便捷且低成本的条件下实现遗传学分析和成像^43-47。由于发育时间较长、小鼠中缺乏针对EGL的特异性遗传靶向手段，以及菱唇与EGL之间存在普遍的分子机制重叠，导致影响EGL生物学过程的改变往往无法被单独分析——因为这些改变通常同时影响菱唇的神经发生并阻碍EGL的形成，因此目前在活体（in vivo）条件下尚无法实现此类分析⁴⁹。因此，我们的系统在特异性靶向EGL进行遗传修饰方面代表了重要进展，并且我们预计该方法还可适用于其他具有比较研究价值的物种，例如非模式哺乳动物和爬行动物。

在进行脑片培养电穿孔技术操作时，需重点考虑若干技术因素。首先，脑片在培养过程中必须具备足够的存活能力，既要避免发生广泛的细胞死亡，又要维持其结构完整性，因此在本实验条件下，脑片厚度限制在300 µm。第二个重要考虑因素是DNA溶液的黏度，该特性可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
McIlwain 组织切碎机	Mickle Laboratory Engineering Ltd		切割厚度设为 300 μm 可获得最佳效果。
基础伊格尔培养基（Gibco）	Life Technologies	41010-026
L-谷氨酰胺	Sigma	G7513
青霉素/链霉素	Sigma	P4333
0.4 μm 培养小室插入物	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne 电穿孔仪	Intracel	01-916-02	电穿孔时使用 3 次 10 V、10 毫秒的脉冲。