离体 培养鸡小脑切片及颗粒细胞前体的靶向电穿孔

摘要

小脑外颗粒层是发育中大脑内发生最大规模过渡性扩增的部位。本文介绍了一种在增殖高峰期靶向该层进行遗传修饰的实验方案 离体 电穿孔及培养孵化第14天鸡胚胎的小脑切片

摘要

小脑外颗粒层（EGL）是发育中大脑内发生最大规模转分化扩增的部位，也是研究神经元增殖与分化的理想模型。此外，该层增殖能力在进化过程中的改变，导致了羊膜动物小脑体积的显著扩张，使小脑成为研究脊椎动物脑部演化发育（evo-devo）的优良模型。构成EGL的细胞——小脑颗粒细胞前体，同时也是最常见的儿童神经元肿瘤——髓母细胞瘤的重要起源细胞之一。经过转分化扩增后，颗粒细胞前体径向迁移至小脑内颗粒层，在成熟哺乳动物大脑中形成数量最多的神经元群体。在鸡胚中，EGL增殖高峰出现在孵化第二周的末期。为了在增殖高峰期特异性靶向该层进行遗传修饰，我们建立了一种通过体外（ex vivo）电穿孔技术对孵化第14天鸡胚小脑切片进行遗传操作的方法。该方法重现了体内（in vivo）颗粒神经元发育的多个关键特征，将有助于深入理解小脑颗粒细胞的增殖与分化机制，从而推动对小脑发育、进化及疾病的研究。

引言

小脑位于后脑的前端，在成熟大脑中负责感觉与运动信息的整合，同时也调控高级认知过程¹。在哺乳动物和鸟类中，小脑具有复杂的形态结构，并高度折叠，这种结构是发育过程中祖细胞大量迁移扩增的结果，由此产生的神经元占成年大脑神经元总数的一半以上。数百年来，小脑一直是神经生物学家的研究对象，在分子生物学时代同样受到广泛关注。这不仅源于其本身有趣的生物学特性，还因为它与多种人类疾病密切相关，包括自闭症谱系障碍等发育性遗传疾病²，以及最突出的小脑肿瘤——髓母细胞瘤³，后者是最常见的儿童脑肿瘤。重要的是，小脑是研究脑发育过程中细胞命运决定和神经发生的一个极佳模型系统⁴。近年来，由于在脊椎动物系统发育过程中观察到小脑形态的高度多样性，它也已成为脑发育比较研究的模型系统^5-10。

小脑起源于后脑菱脑节1的背侧半部分¹¹，在发育过程中主要由两类祖细胞群体构成：菱唇和室管膜区。菱唇环绕于后脑神经上皮背侧区域，位于其与顶板交界处，是小脑谷氨酸能兴奋性神经元的产生部位^12-14。室管膜区则产生抑制性GABA能小脑神经元，其中最显著的是体积较大的浦肯野神经元^14,15。在发育后期（小鼠约胚胎第13.5天；鸡胚约第6天¹⁶），谷氨酸能祖细胞从菱唇沿切线方向迁移，形成位于软脑膜下的一层祖细胞，即称为外颗粒层（EGL）的次级祖细胞区。正是这一层细胞经历广泛的迁移扩增，最终产生成熟大脑中数量庞大的颗粒神经元。

外颗粒层（EGL）中的细胞增殖长期以来被认为与来自菱脑唇的切向迁移所导致的软脑膜下位置有关¹⁷，而祖细胞退出细胞周期并启动神经元分化则与其从外层EGL迁移至中层EGL相关¹⁸。有丝分裂后颗粒细胞在中层和内层EGL中沿内侧-外侧轴进行广泛的切向迁移¹⁹，随后最终经由径向迁移进入成熟小脑皮层的内颗粒层。细胞从菱脑唇迁移至小脑表面依赖于软脑膜来源的CXCL12信号^20-22，而颗粒细胞表达CXCL12的受体CXCR4。因此，其切向迁移过程与新皮层中切向迁移的抑制性中间神经元群体相似^23-25。有趣的是，电镜研究¹⁷提示，具有增殖形态的EGL细胞维持着与软脑膜的接触，将细胞行为与其增殖能力联系起来，这一特征类似于哺乳动物皮层中的基底祖细胞²⁶。这一点也反映在前述EGL被分为三层亚结构的现象中，这些亚层具有不同的细胞外环境，且颗粒前体细胞在各层中表现出特异的基因表达谱¹⁸。

在小鼠胚胎发育末期，当对小脑外颗粒层（oEGL）中的前体细胞进行单个遗传标记时，这些前体细胞产生的克隆大小呈正态分布，平均每个前体细胞可产生250–500个有丝分裂后颗粒神经元^27,28增殖依赖于来自下方浦肯野神经元的有丝分裂原性SHH信号传导^29-32对SHH的响应能力已被证明完全依赖于细胞自主表达的转录因子 Atoh1，两者均 体外³³ 和 体内^34,35同样，细胞周期退出和分化已被证明依赖于下游转录因子的表达 NeuroD1³⁶，这很可能是直接抑制因子 Atoh1³⁷.

尽管取得了这些进展，以及在解析细胞周期退出的细胞生物学基础方面已有相当大的进步^38-42，目前对细胞周期退出、从祖细胞转变为分化中神经元的决策过程，以及内颗粒层中伴随的有丝分裂后水平迁移和后续向放射状迁移的转换，其基本的分子机制仍未完全阐明。这在很大程度上是由于外颗粒层（EGL）在实验操作上的困难：该结构发育较晚，且难以进行遗传学靶向操作，因为许多参与神经发生的分子在菱唇处颗粒前体细胞生命早期阶段同样具有关键作用。为解决这一问题，许多研究者已开发出 体内 和 离体 电穿孔法作为靶向新生期啮齿类动物小脑的一种方法^43-48在此，我们率先提出使用 离体 在鸡胚中进行电穿孔以研究外颗粒层（EGL），该方法在成本和操作便利性方面具有显著优势。我们的电穿孔方法及 离体 小鸡小脑组织的切片培养采用孵化第14天小鸡的胚胎组织，此时外颗粒层（EGL）处于增殖高峰期。该方法可独立于菱形唇对EGL进行遗传学靶向操作，为研究小脑中颗粒前体细胞向有丝分裂后颗粒神经元转变过程的遗传机制奠定基础。

方案

注意：所有实验均按照英国伦敦国王学院及英国动物护理指南（UK Home Office animal care guidelines）进行。

1. e14 小脑的解剖

1. 将受精的褐色母鸡蛋在38 °C下孵育至胚胎第14天。
2. 使用卵剪去除鸡胚头部 在卵内 并将头部移至含有冰冻 PBS 的培养皿中（图1A).
3. 使用标准镊子，在每只眼睛后方穿过组织进行切口，取下眼睛和上颌。再做第二个切口，完全穿过咽部，取下下颌。图1B).
4. 使用标准镊子，通过剥离的方式将颅骨表面的所有皮肤完全去除（图1C) 并移除额骨和顶骨，暴露脑组织。
5. 从腹侧去除咽部软骨及附属间充质。
6. 从背侧小心去除小脑后方的间充质，注意不要损伤软脑膜，并分离出完整的大脑图1D).
7. 在中脑与后脑之间完全切开组织，分离包含小脑在内的后脑图1E).
8. 通过在小脑与后脑翼板两侧交界处完全切透组织，完整移除小脑，注意在整个解剖过程中保持软脑膜的完整性（图1F）。移除正在形成的脉络丛（图1G).
9. 将解剖出的小脑移入预冷的HBSS溶液中。

2. e14 小脑的脑片培养

1. 使用刮勺或剪去尖端以扩大开口的3 ml巴斯德吸管，将整个小脑转移至组织切片机的无菌平台上。用移液器吸除多余液体。
2. 使用组织切片机，以最大切割速度的50%将整个小脑按所需方向切成300 µm厚度的切片。组织完整性在矢状面切片中最易保持；然而，取向对于细胞分析同样重要（浦肯野细胞树突呈矢状排列，而颗粒细胞轴突则横向走行，垂直于浦肯野细胞树突的平面）。
3. 使用 3 ml 巴斯德吸管，将冰冷的 HBSS 覆盖在切好的小脑组织上。
4. 使用剪去尖端的3 ml巴斯德吸管，将HBSS中的切片转移至含有冰上预冷的新鲜HBSS的60 mm培养皿中。
5. 在光纤光源照明的解剖显微镜下，使用钟表镊确保分离各个脑片。根据脑片的组织完整性和内侧-外侧位置，确定需要进行电穿孔的脑片。
   注意：每个胚胎从解剖到在培养基中孵育切片的过程大约需要10–20分钟，具体时间取决于操作者的经验。每次仅进行一个样本的解剖，以确保小脑从断头到后续处理之间的间隔时间最短。 离体 培养。

3. 脑片电穿孔

1. 使用绝缘胶带将电穿孔仪的阳极固定在60 mm培养皿底部，构建电穿孔腔。加入约1 ml HBSS溶液以覆盖电极。
2. 将0.4 µm的培养小室置于被HBSS覆盖的电极上方。让培养小室自然放置在电极上，确保小室与电极始终保持接触。
   注意：在此装置中，带有脑片的培养小室将浮于溶液表面，既维持电路导通，又可实现对阴极的空间靶向定位。
3. 使用切去尖端的3 ml巴斯德移液管，将已识别的脑片（每个培养小室最多五片）转移至培养小室上，并分开放置，使其以矢状方向自然沉降。
4. 用移液器吸除多余的HBSS，使脑片不再浸泡在溶液中。
5. 使用P10移液器吸头，将DNA（浓度为1 µg/µl）与20%快绿染料混合后的溶液滴加至脑片目标区域表面。20%快绿可增加DNA溶液黏度，防止DNA过度扩散。每片脑片约加入5 µl DNA/快绿混合液（图2B）。
6. 将阴极置于目标组织上方，以3次10 V、每次10毫秒的脉冲进行电穿孔。避免阴极直接接触组织，应利用液体表面张力维持导电性（将阴极尽可能靠近组织，但不实际接触）。
7. 根据需要，在每张小脑脑片的外颗粒层（EGL）多个区域重复进行DNA递送和电穿孔操作。
8. 电穿孔完成后，将培养小室转移至30 mm培养皿中。
9. 向每个培养体系中，在培养小室下方加入1 ml预热的培养基（基础MEM培养基，含0.5% (w/v) D-(+)-葡萄糖、1% B27添加剂、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素），使培养小室与培养基接触，但脑片不浸泡在培养基中。
10. 将培养物置于37 °C、6% CO₂条件下培养最多3天。每隔24小时更换全部培养基，使用新鲜预热的培养基。
11. 培养结束后，在新的30 mm培养皿中（无培养基），用4%多聚甲醛固定培养小室上的脑片1小时（或在4 °C过夜）。

4. 小脑切片成像

1. 固定后，用 PBS 洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
2. 使用剃须刀片沿切片周围切割，将每个电转并培养的小脑切片及其所黏附的插入膜区域一起从培养插件上分离下来。切勿尝试将切片从培养插件表面剥离。
3. 将切片置于约 1 ml 含 DAPI（如需要）的封片剂中，加盖盖玻片，注意避免产生气泡，并使用激光共聚焦扫描显微镜进行成像。
   注意：成像参数可根据电转的构建体及使用者的具体需求进行调整。

结果

本部分展示了使用孵化第14天鸡胚小脑进行脑片电穿孔及培养所能获得的结果示例。小脑解剖过程如图1所示，电穿孔腔室的组装如图2所示。我们证明了可以对小脑脑片进行电穿孔并成功进行体外培养，脑片在体外仍能保持其组织结构和细胞形态（in vitro）（图3A）。可轻松实现对单个叶片（folia）的靶向电穿孔（图3B）。我们成功将多种不同的质粒电穿孔转入外颗粒层（EGL）细胞中，并证明了以下可能性：i）利用报告基因构建体标记细胞以观察其行为（图3C）；ii）检测基因组特定区域在小脑细胞中的功能活性（图3D）；以及iii）通过过表达目的蛋白对EGL细胞进行遗传操作（图3E）。此外，还可对电穿孔后的脑片进行药理学处理（结果未显示）。培养后可进一步进行组织分析，如免疫组织化学染色或增殖检测（图3F）。我们...

讨论

本文报道的方案描述了一种对鸡胚第14天小脑进行切片、电穿孔和培养的方法。该方案能够将电穿孔靶向至外颗粒层（EGL）的微小局灶区域，包括单独靶向单个小脑叶。与现有的啮齿类动物技术相比，该方法可在高分辨率、操作便捷且低成本的条件下实现遗传学分析和成像^43-47。由于发育时间较长、小鼠中缺乏针对EGL的特异性遗传靶向手段，以及菱唇与EGL之间存在普遍的分子机制重叠，导致影响EGL生物学过程的改变往往无法被单独分析——因为这些改变通常同时影响菱唇的神经发生并阻碍EGL的形成，因此目前在活体（in vivo）条件下尚无法实现此类分析⁴⁹。因此，我们的系统在特异性靶向EGL进行遗传修饰方面代表了重要进展，并且我们预计该方法还可适用于其他具有比较研究价值的物种，例如非模式哺乳动物和爬行动物。

在进行脑片培养电穿孔技术操作时，需重点考虑若干技术因素。首先，脑片在培养过程中必须具备足够的存活能力，既要避免发生广泛的细胞死亡，又要维持其结构完整性，因此在本实验条件下，脑片厚度限制在300 µm。第二个重要考虑因素是DNA溶液的黏度，该特性可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
McIlwain 组织切碎机	Mickle Laboratory Engineering Ltd		切割厚度设为 300 μm 可获得最佳效果。
基础伊格尔培养基（Gibco）	Life Technologies	41010-026
L-谷氨酰胺	Sigma	G7513
青霉素/链霉素	Sigma	P4333
0.4 μm 培养小室插入物	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne 电穿孔仪	Intracel	01-916-02	电穿孔时使用 3 次 10 V、10 毫秒的脉冲。