方法文章

诱发心肌细胞的使用多顺反子构建表达GATA4，MEF2C和Tbx5中的最优比率改善发电

DOI：

10.3791/53426

⸱

2015年11月13日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, McAllister Heart Institute, University of North Carolina, Chapel Hill

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们在这里描述了一种使用逆转录病毒介导的多顺反子构建体中 Gata4、Tbx5 和 Mef2c 递送生成 iCM 的方案。该方案产生相对均匀的重编程细胞群，具有更高的效率和质量，对于未来 iCM 重编程的研究很有价值。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

心脏成纤维细胞（CFS）成心肌细胞诱导直接转化（ICMS），通过治疗心脏疾病提供替代战略保持着再生医学的巨大潜力。这个转换已通过确定的因子如GATA4（G），MEF2C（M）和Tbx5中（T）的强制表达来实现。传统上，ICMS是由病毒表达这些个人因素鸡尾酒产生。然而，重新编程的效率是相对低的，大部分的体外 G，M，T转导的成纤维细胞不成为完全重新编程，使得难以研究的重编程机制它。我们最近已经表明，G，M的化学计量，T是用于有效ICM重新编程的关键。 G，M，T的具有M和低水平的G和T的通过使用我们的多顺反子MGT向量（以下称为MGT）显著增加重新编程的效率达到了较高水平的最佳化学计量学和体外改善ICM质量。在这里，我们提供用于产生ICMS与从心脏成纤维细胞MGT构建体的方法的详细描述。心脏成纤维细胞，代病毒重编程和重编程过程的评价的隔离也包括以提供有效和可再现代ICMS的一个平台。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

心血管疾病仍然是全球死亡的主要原因，每年造成 1730 万人死亡1。心肌梗死 （MI） 或进行性心力衰竭导致的心肌细胞丢失是发病率和死亡率的主要原因2。由于再生能力有限，成年哺乳动物心脏通常在受伤后会出现泵功能受损和心力衰竭3-6。因此，心肌细胞在体内和体外的高效（再）生成用于治疗心脏病和疾病建模是一个需要解决的关键问题。

直接重编程的最新发展，它直接将细胞从一种分化表型重编程到另一种分化表型，而无需通过多能状态转换，为再生医学提供了一种有前途的替代方法。哺乳动物心脏含有丰富的心脏成纤维细胞 （CF），约占心脏细胞的一半，并在受伤时大量增殖7-9。因此，如果 CF 可以直接重编程为功能性 CM，那么大量的 CF 可以作为再生治疗新 CM 的内源来源。已经表明，转录因子（如 Gata4 （G）、Mef2c （M） 和 Tbx5 （T））的组合，有或没有 microRNA 或小分子，都可以将成纤维细胞重编程为 iCM10-26。重要的是，这种转换也可以在体内诱导，并导致心肌梗死心脏的心肌功能改善和疤痕大小的减小16,27-29。这些研究表明，直接心脏重编程可能是治愈受伤心脏的潜在途径。然而，iCM 重编程的低效率已成为进一步机理研究的主要障碍。此外，心脏重编程的可重复性是该技术的另一个有争议的问题11,30,31。

最近，我们生成了一整套多顺反子构建体，这些构建体以所有可能的剪接顺序编码 G、M、T，在单个 mRNA 中具有相同的 2A 序列。这些多顺反子构建体产生不同的 G、M 和 T 蛋白表达水平，这导致重编程效率显著不同25。最有效的构建体名为 MGT，其表现出相对较高的 Mef2c 和较低的 Gata4 和 Tbx5 表达，显著提高了重编程效率，并产生大量具有 CM 标志物表达、稳健钙振荡和自发跳动的 iCM25。此外，通过使用 MGT 多顺反子构建体，我们的研究避免了使用多个载体并生成了具有 G、M、T 均一表达比的细胞，从而为心脏重编程研究提供了改进的平台。为了提高实验的可重复性，我们在这里详细描述了如何分离成纤维细胞、生产携带 MGT 盒的逆转录病毒、生成 iCM 并评估重编程效率。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里列出的协议采用新生小鼠。动物保健和实验是按照由科实验室的动物医学（DLAM）北卡罗来纳大学教堂山分校制定的准则进行。

1.准备缓冲区和媒体

  1. 制备成纤维细胞（FB）介质:补编500毫升的IMDM培养基用100ml胎牛血清（FBS）和6ml青霉素/链霉素。
  2. 制备ICM介质:补编400毫升DMEM培养基用100ml的M199培养基和50ml FBS中。
  3. 准备B27介质:补充490毫升RPMI1640培养基用10ml B27媒体。
  4. 制备开发平台-E培养基:补编500毫升DMEM培养基用50ml的FBS，5 ml青霉素/链霉素和5ml非必需氨基酸。
  5. 制备开发平台-E转染培养基:补编500毫升DMEM培养基用50ml的FBS和5ml非必需氨基酸。
  6. 镨epare明胶包被的24孔板:添加0.5 ml的0.1％明胶溶液至24孔板一个井，在37℃下使用前右至少10分钟，并吸出。
  7. 制备FACS标记缓冲液:补编500毫升DPBS用10ml的FBS和2ml EDTA（0.5M），以达到2mM的最终浓度。通过一个0.22微米的过滤器，并储存在4℃。
  8. 制备MACS分类缓冲器:补编500毫升的DPBS与2.5g的BSA和2ml EDTA（0.5M），以达到2mM的最终浓度。通过一个0.22微米的过滤器，并储存在4℃。
  9. 制备2×HBS缓冲液为染:补充500毫升的HEPES缓冲液（50mM）配有280 mM氯化钠（8.1816克），10毫米氯化钾（0.37275克），1.5毫的 Na 2 HPO 4（0.10647克），12毫葡萄糖（1.08096克）。加约650微升10N NaOH将pH调节至7.05-7.12。通过在4℃的0.22微米孔径过滤和储存过滤。
  10. 准备2.5M的氯化钙溶液转:添加18.376克钙Cl 2中至50ml双蒸2 O.通过在4℃的0.22微米孔径过滤和储存过滤。
  11. 准备ICC（免疫细胞化学）固定缓冲液:添加5 ml的多聚甲醛（PFA，32％）到35 ml的DPBS达到4％的最终浓度。
  12. 准备ICC透化缓冲液:添加0.1 ml的曲通至100毫升DPBS达到0.1％的最终浓度。
  13. 准备ICC封闭缓冲液:添加5克牛血清白蛋白（BSA）到100毫升DPBS达到5％的最终浓度。
  14. 准备ICC染色缓冲液:添加1克的BSA至100ml DPBS达到1％的最终浓度。

2.代新生小鼠心肌成纤维细胞

  1. 生成块培养方法心脏成纤维细胞
    1. 清洁新生儿αMHC-GFP转基因小鼠（P1到P2）用75％的乙醇。用无菌剪刀剪了头。然后，让来自在一个腋下到另一水平切口。使用无菌钝弯曲钳解剖出心脏，并将其放置在含冰冷的PBS缓冲液的24孔板的一个孔。
      1. 另外，横向切开后挤出的心脏。
    2. 通过荧光显微镜检查心脏GFP表达。由于GFP的表达是由αMHC启动子是一种心脏特异性启动子驱动，从转基因小鼠的心脏应该在绿15，而负心脏是暗淡的，在任何荧光。
    3. 需要3-4 GFP阳性的心成60毫米中心孔培养皿并剁碎成小块尺寸小于1毫米3通过无菌剪刀和镊子。
    4. 将3-4碎的心，1个10 cm培养皿用2毫升FB媒体。让组织安顿下来3小时。
    5. 慢慢加入8毫升预热FB媒体包含心脏组织的菜肴。请勿打扰组织了三天。
    6. 更换介质每三天。
    7. 第7天，aspir吃了培养液，洗涤细胞用DPBS。加入3 ml的0.05％胰蛋白酶，以每块板和消化在37℃下5分钟。
    8. 添加5毫升FB媒体解渴胰蛋白酶。轻轻分离细胞与细胞刮刀。吸取媒体上下进一步机械分离组织。
    9. 收集细胞，并通过40微米的细胞滤网过滤，以避免心脏组织碎片的污染，然后通过在200×g离心纺丝5分钟沉淀细胞。
    10. 洗涤细胞一旦与MACS缓冲液和细胞准备进行排序。
  2. 生成的酶消化法心脏成纤维细胞
    1. 收获GFP阳性的心为2.1.1。转移了所有的心情到10cm皿用10毫升冰冷的DPBS。
    2. 挤心室用无菌镊子以除去血液并用冰冷的DPBS中冲洗一次。
    3. 修剪的心是自由的其他组织和脂肪。
    4. 横切心脏成仍松散连接的约4个。
    5. 如果小于20心中，调心入15ml锥形管中以8毫升温的0.05％胰蛋白酶-EDTA，并在37℃下进行15分钟。
      1. 如果有20-30心中，转移心中到50ml锥形管中，用10毫升温的0.05％胰蛋白酶-EDTA，并在37℃下进行15分钟。
    6. 丢弃胰蛋白酶，并添加5毫升（对于小于20的心）或10毫升（20-30心）温暖的II型胶原酶（0.5毫克/毫升）在HBSS。
    7. 涡旋上涡旋管为在约4至6的速度级1分钟（如果液体不起床到盖，则速度为细）。
    8. 孵育管中37℃水浴3-5分钟。
    9. 涡管1分钟。
    10. 沉积物用于通过重力1分钟，直到组织碎片沉淀下来，收集液态到含有5毫升冷的FB培养基的新管中。
    11. 重复步骤2.2.6-2.2.10 3-5倍。
    12. 通过40微米的细胞过滤过滤把所有的收藏品使单细胞悬浮液。
    13. 离心机在200×g离心5分钟，在4℃。
    14. 悬浮细胞在10ml MACS缓冲液中，离心，在200×g离心5分钟，在4℃。
    15. 可选:如果有很多血细胞，重悬细胞与1ml RBC裂解缓冲液（150mM的氯化铵 ，10毫KHCO 3和0.1mM EDTA）中，保持在冰上1分钟，然后稀释用10ml MACS缓冲液和离心机在200×g离心5分钟。洗一次用MACS缓冲。
  3. Thy1.2 +成纤维细胞通过MACS分离（磁性激活细胞分选）
    1. 通过台盼蓝染色测定存活细胞数。
      1. 取10微升的细胞从10 mL细胞悬液步骤2.2.14。用10微升0.4％台盼蓝溶液混合。
      2. 该混合物添加到血球。允许它静置3-5分钟，然后在显微镜下立即检查。死细胞被染成蓝色，活细胞是未染色。
        3. 计数的所有活细胞中的血细胞计数仪的四个1毫米角落正方形。确定活细胞数:每平方×2（稀释因子）平均计数×10 4×10（细胞悬浮液的总体积）。
    2. 为小于1×10 7个细胞，重悬细胞，在90微升10微升Thy1.2微珠冷冻的MACS缓冲液中。添加更多的珠按比例，如果有大于1×10 7个细胞。拌匀，孵育在冰箱中（2-8°C）30分钟。
    3. 加入10 mL的MACS缓冲液和自旋样品在200×g离心5分钟;用10ml MACS缓冲液，再离心洗一次。
    4. 带来的体积至2ml在MACS缓冲液中。
    5. 设置一个MACS机在油烟机。插入一个LS柱到分离器。应用3 ml的MACS缓冲液向柱平衡它。
    6. 通过平衡LS列通过细胞悬液。
    7. 洗3次，用2ml MACS每次缓冲。
    8. 就拿LS列关闭t他分离器和洗脱3次用2ml MACS缓冲液到一个新的50ml管中。
    9. 旋转，在200×g离心5分钟。
    10. 悬浮细胞在10毫升FB媒体，计数细胞和种子成板在适当的密度。用于从外植体培养方法产生的成纤维细胞，所述种子细胞密度可以是约2-3×10 4个细胞/孔的24孔板中。从酶消化的方法产生的成纤维细胞，将细胞密度可能约为4-5×10 4个细胞/孔的24孔板中。

3.逆转录病毒生成的ICM重新编程

注意:执行在无菌条件下在一个BSL2生物安全柜以下步骤。妥善处置转染的细胞，吸头和管道的建议，以避免对环境和健康危害的风险。

  1. 保持开发平台-E细胞在开发平台-E的介质补充有1μg/ ml的嘌呤霉素和10μg/ ml的b在37℃下lasticidin用5％ 的 CO 2。
  2. 第2天，更换，由缺乏嘌呤和稻瘟开发平台-E培养基中。
  3. 在第0天，拆分开发平台-E细胞成10厘米的转染前一天以大约每盘4-5×10 6个细胞的菜肴。细胞应为〜上转染当天80-90％汇合。
  4. 在第1天，改变培养基，以转染培养基上在1小时内转染前细胞。转染程序如下:
    1. 使用商业试剂盒转染
      1. 混合20微升转染试剂（例如脂质体）和500微升减少血清的培养基（例如，的Opti-MEM）。加10微克的逆转录病毒质粒的另一个500微升减少血清的培养基。在室温下孵育（RT）下各混合物5分钟。
      2. 慢慢加入该质粒混合物转染混合物。这一步可能需要15-30秒。孵育20分钟后，混合物在RT（溶液可以出现混浊）。
      3. 添加混合物滴加至所述细胞。
      4. 在37℃培养箱中孵育过夜。
    2. 转用磷酸钙。
      1. 混合40微升2.5M的氯化钙和440微升双蒸2 O，然后加入20微克的逆转录病毒质粒（调整DDH 2 O的量，使总量为500微升）。
      2. 加入500微升2×HBS到一个15毫升的锥形管中。
      3. VORTEX哈佛商学院，同时添加钙DNA混合物到哈佛商学院滴加。此步骤需要约30秒，每个样品。因此，最大限度地同时做3-4个样品。
      4. 在室温下孵育3分钟孵育较长时间导致更大的沉淀和更少的细胞会占用沉淀物。
      5. 添加该混合物滴加至细胞和20X显微镜下观察。精细沉淀（很多小的是好的，但一些大的是不好的）应该可以看到。
      6. 孵育过夜，在37℃培养箱中。
  5. 第2天，对细胞用8ml预热培养基更换培养基。孵育24小时。
  6. 在第3天及4天，通过使用10毫升无菌一次性注射器，通过0.45μm孔径的醋酸纤维素过滤器过滤它，并转移到50毫升管收集从碗碟培养上清。加入2毫升逆转录病毒沉淀溶液到每8毫升含有病毒的上清液。轻轻地混合，并孵育过夜，4℃。
  7. 在第5天，在1500×g下旋转该病毒混合物在4℃下30分钟。病毒颗粒应在管的底部出现白色沉淀。
  8. 弃去上清液。降速离心残余溶液在1500×g下5分钟。吸卸下流体的所有痕迹时，注意不要打扰沉淀的逆转录病毒颗粒的沉淀。
  9. 重悬逆转录病毒颗粒与每8毫升病毒上清100微升DPBS缓冲。分装冰上病毒。立即使用或储存在-80℃。

4.重编程心脏成纤维细胞

  1. 加入4微升10毫克/毫升聚凝胺溶液放入10毫升ICM介质，并通过上下抽吸轻轻混匀。聚凝胺的最终浓度为4微克/毫升。
  2. 添加含有凝聚胺500微升ICM媒体的24孔板每孔接种成纤维细胞。
  3. 添加10微升反转录病毒到每孔含有任2-3×10 4个，从外植体培养物或4-5×10 4个细胞的酶消化法的细胞。病毒的量应成比例地增加在不同的培养板或菜肴增加的细胞数量。把板在37℃的培养箱中24-48小时，以使病毒感染。心脏重新编程时间线示于图1。
  4. 病毒转导后，用500微升常规ICM媒体替换包含媒体的病毒。
  5. 更换介质每2-3天。阳性筛选病毒转导的细胞，在2微克/毫升添加补充有嘌呤ICM媒体到靶细胞。保持三天。在此之后，保持嘌呤霉素在ICM介质以1微克/毫升的浓度。
  6. 病毒感染后三天，取板从培养箱并把它的倒置荧光显微镜（20X）下观察GFP表达。
    注意:病毒感染后10天，细胞可以收获FACS分析和ICC分析，以确定重编程效率（在步骤5和6）。
  7. 病毒感染后14天，B27媒体取代ICM媒体。更换介质每三天。自发跳动的细胞位点可能会出现三个（细胞酶消化法）或病毒转导后四（细胞外植体培养方法）周。

重编程效率5.免疫细胞化学分析

  1. 冲洗细胞用冰冷的PBS三次;去除多余的解决方案。
  2. 添加0.5 ml的IC卡的固定缓冲液至24孔板各孔中。固定细胞在RT 15-20分钟。
  3. 冲洗细胞，用PBS三次。
  4. 添加0.5 ml的IC卡透化缓冲液到24孔板的每个孔中。透化的细胞在室温15分钟。
  5. 冲洗细胞，用PBS三次。
  6. 添加0.5 ml的IC卡封闭缓冲到24孔板各孔中，在室温下孵育1小时。
  7. 稀释的主要抗体与ICC染色缓冲液。加入200μl抗体溶液，每孔孵育过夜，在4℃。抗体的稀释因素中列出的材料。
  8. 在第二天，用PBS洗涤细胞三次。
  9. 加入200μl次级抗体溶液至细胞，并孵育1小时，在室温在暗处。
  10. 用PBS三次洗涤细胞。
  11. 添加150微升安装含有DAPI到各孔溶液中。允许染色细胞核1分钟。然后圆形的玻璃盖片以及覆盖各个轻轻按压在底面防滑用钳去除气泡。
  12. 吸出多余的溶液，样品准备用于成像。的代表图像表示重编程的细胞表达心脏标志物cTnT和αActinin在D14示于图2B。

重编程效率的6流式细胞仪分析

  1. 彻底DPBS洗一次细胞。加0.3 ml胰蛋白酶（0.05％），以每孔并在37℃下5分钟。
  2. 轻轻敲击板以方便吊装细胞。检查显微镜下细胞脱离。加入1毫升FACS缓冲液到每个孔中，当大多数细胞被离解。移液器上下进一步机械解离的细胞。
  3. 在24孔板孔转移细胞到96孔深孔板中，以良好。旋，在200×g离心5分钟，在4℃下以收集细胞。
  4. 洗涤细胞一次，流式细胞仪缓冲。
  5. 加入100微升固定/透化溶液重悬细胞进行20分钟，在4℃。
  6. 用1X洗涤液，颗粒洗涤细胞两次，并去除上清。
  7. 制备在1×洗涤缓冲液中对GFP和肌钙蛋白初级抗体溶液。彻底重悬用50μl抗体溶液各样品，孵育在4℃下30分钟。
  8. 在1X洗涤液，颗粒一次洗涤细胞，并去除上清液。
  9. 添加包含的Alexa Fluor 488缀合的驴抗兔IgG和Alexa Fluor 647缀合的驴抗小鼠IgG向每个样品加入50μl次级抗体溶液。孵育在4℃下，在黑暗中30分钟。
  10. 在1X洗涤液，颗粒一次洗涤细胞，并去除上清液。
  11. 悬浮细胞于400μl固定缓冲液（DPBS用1％PFA）。细胞转移到FACS管与细胞滤网盖。样品是准备流式细胞仪检测。重新编程efficienc代表FACS分析只有使用Y pMxs-嘌呤霉素MGT构造具有或不具有嘌呤选择示于图2A。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

重新编程步骤在图1中总结的示意图。MGT转导后，在重新编程的细胞的GFP表达可以早在第3天嘌呤选择转导的细胞的从第3天开始，并在头两个星期保持检测如果PMX-普罗-MGT构建体被使用。在第10天至14天，心肌标记物像cTnT和αActinin的表达可以由两个IC卡（图2B，步骤5）和FACS（图2A，步骤6）被检测到，这表明起始成纤维细胞正在经历重编程朝向心脏细胞命运。

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图1:直接心脏重编程过程的示意图程序在每个时间点在黑盒子中描述。培养基为每个阶段示于下面的时间彩色框线。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对于成功的ICM代使用此协议时，存在具有对整体效率产生影响的几个重要因素。尤其在开始成纤维细胞的条件和逆转录病毒编码MGT的质量可以极大地影响重编程效率。

产生的成纤维细胞作为新鲜健康尽可能是重要的。外植体培养方法，成纤维细胞可用于前外植七天后铺于菜肴。酶消化法，成纤维细胞，可以早在隔离的次日使用。冻结或传代的成纤维细胞进行重新编程，不推荐。成纤维细胞的这些额外的治疗将显著减少重编程效率。接种密度是影响重编程效率的另一重要因素。如果细胞是人烟稀少种子，他们往往会变得不健康与不规则的细胞形态和在大尺寸。很少合作ULD那些细胞被转化成ICMS。如果细胞接种过于密集时，MOI（感染复数）为病毒感染降低。未感染的成纤维细胞过度生长显著稀释了重新编程的事件从而导致ICMS低百分比。我们也注意到小细胞的鹅卵石样形态的出现，如果更多的细胞接种进行重新编程。它们几乎不能被重新编程，从而导致降低的重编程效率。当修改协议的组织培养皿不同大小，则建议接种的细胞数目成比例地调整到培养皿的表面积。

成纤维细胞的纯度为重编程的关键。成纤维细胞的高纯度既可...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们非常感谢 UNC 流式细胞术核心和 UNC 显微镜核心的专家技术援助。我们感谢 Qian 实验室和 Liu 实验室的成员对手稿的有益讨论和批判性审查。这项研究得到了 NIH/NHLBI R00 HL109079 对刘博士的资助和美国心脏协会 （AHA） 科学家发展资助 13SDG17060010 和埃里森医学基金会 （EMF） 新学者资助 AG-NS-1064-13 对钱博士的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗心肌肌钙蛋白TThermo ScientificMS-295-PO1：200 用于 FACS 和 1：400
抗 GFPLife TechnologiesA111221：500 用于 FACS 和 ICC
抗肌动蛋白Sigma-AldrichA78111：500 用于 FACS 和 ICC
抗连接蛋白 43Sigma-AldrichC62191：500 用于 ICC
anit-Mef2cAbcamab646441：1,000 ICC 
抗 Gata4Santa Cruz Biotechnologysc-12371：200 用于 ICC
抗 Tbx5Santa Cruz Biotechnologysc-178661：200 用于 ICC
Alexa Fluor 488–偶联驴抗兔 IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521：500 用于 FACS 和 ICC
Alexa Fluor 647–偶联驴抗小鼠 IgGJackson ImmunoResearch Inc715-605-1501：500 用于 FACS 和 ICC
用于细胞内染色的 Cytofix/Cytoperm 试剂盒BD Biosciences554722
Rhod-3 钙成像试剂盒Life TechnologiesR10145
Thy1.2 微珠Miltenyi Biotec130-049-101
含 DAPI的 Vectashield 溶液Vector labsH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
胰蛋白酶-EDTA （0.05%）康宁25-052
PRMI1640 中等Life Technologies11875-093
B27 补充剂Life Technologies17504-044
IMDMLife Technologies12440-053
Opti-MEM低血清 中等Life Technologies31985-070
M199 中等Life Technologies10-060
DMEM，高葡萄糖Life Technologies10-013
青霉素-链霉素康宁30-002
非必需氨基酸Life Technologies11130-050
Lipofectamine 2000Life Technologies11668500
杀稻瘟菌素Life TechnologiesA11139-03
嘌呤霉素Life TechnologiesA11138-03
胶原酶 IIWorthingtonLS004176
聚凝胺MilliporeTR-1003-G
Triton X-100FisherBP151-100
CaCl2Sigma-AldrichC7902
HEPESSigma-AldrichH4034
NaClSigma-AldrichBP358-212
KClSigma-AldrichPX1405
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
葡萄糖Sigma-AldrichG6152
牛血清白蛋白Fisher9048-46-8
多聚甲醛EMS15714
逆转录病毒沉淀溶液ALSTEMVC-200
0.4% 台盼蓝溶液Sigma-AldrichT8154
明胶Sigma-AldrichG1393
不含CaCl的Dulbecco's PBS2< / sub>和MgCl2< / sub>（D-PBS，1x）Sigma-AldrichD8537
HBSS（Hanks平衡盐溶液）康宁21022
LS色谱柱Miltenyi Biotec130-042-401
0.45 &μ;M 醋酸纤维素过滤器 Thermo Scientific190-2545
24 孔板Corning3524
10 cm 组织培养皿 Thermo Scientific172958
60 mm 中心孔培养皿  康宁3260
96 孔透明 V 型底 2 ml 聚丙烯深孔板Denville ScientificP9639
聚苯乙烯圆底管，带细胞过滤器盖 BD Biosciences352235
离心机Eppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL 自动细胞成像系统Life TechnologiesAMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MidiMACS 分离器Miltenyi Biotec130-042-302
圆形玻璃盖玻片Electron Microscopy Sciences72195-15

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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