本文描述了一种两步色谱法，用于纯化在大肠杆菌（Escherichia coli）中以包涵体形式表达的重组Shadoo蛋白，以及一种将纯化的Shadoo蛋白 fibrillate 形成淀粉样结构的实验方案。
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摘要
摘要
大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统是生产重组真核蛋白的有力工具。我们利用该系统表达Shadoo蛋白，一种属于朊病毒家族的蛋白质。本文描述了一种用于纯化以包涵体形式表达的（His）6标签重组Shadoo蛋白的层析方法。包涵体在8 M尿素中溶解后，通过结合至Ni2+负载的层析柱进行离子亲和层析。结合的蛋白质采用咪唑梯度洗脱。含有Shadoo蛋白的洗脱组分进一步进行凝胶过滤层析，以获得高纯度的蛋白。最后一步中，纯化的Shadoo蛋白经过脱盐处理，以去除盐分、尿素和咪唑。重组Shadoo蛋白是研究朊病毒病中蛋白质构象异常相关生物物理与生化特性的重要试剂。大量研究报道表明，朊病毒神经退行性疾病起源于稳定、有序的淀粉样纤维的沉积。本文提供了在酸性以及中性/碱性pH条件下将Shadoo蛋白诱导形成淀粉样纤维的样品实验方案。这些Shadoo蛋白的表达与纤维化方法可促进从事朊病毒病研究的实验室开展相关工作，因其能够快速、低成本地大量生产该蛋白。
引言
朊病毒神经退行性疾病包括牛海绵状脑病（牛）、羊瘙痒病（羊）以及人类克雅氏病，这些疾病具有致命性且目前无法治愈。朊病毒疾病的主要特征是细胞型朊蛋白发生构象改变，该蛋白原本主要由α-螺旋构成，转变为富含交叉β-折叠结构的淀粉样构象1,2。交叉β-结构包含紧密堆积且高度有序、类似晶体的β-折叠片层，通过氢键稳定维持3,4。由于朊病毒淀粉样结构在生长边缘处的β-链可作为模板，招募并转化单体蛋白，因而具备自我复制能力。
根据 "仅蛋白质" 假设朊病毒蛋白的淀粉样构象是唯一的感染性因子。然而，也有研究提出其他一些生物分子对朊病毒疾病的发生至关重要。例如，细胞膜被认为是构象转换发生的场所，而某些带负电荷的脂质已被证明可促进这一转换过程 5,6此外，某些蛋白质可能也与朊病毒病理学有关。具体而言，朊病毒蛋白家族中还有另外两个成员：Doppel 和 Shadoo 7,8Doppel 具有相对刚性的结构，由二硫键桥稳定，无法自发多聚化并聚集形成淀粉样纤维。 9相比之下，Shadoo 与朊病毒蛋白类似，能够形成富含β-折叠的结构，并自缔合成淀粉样纤维结构。研究表明，Shadoo 在天然条件下或与带负电荷的膜结合时均可发生纤维化。 10,11Shadoo 转化为类淀粉样纤维可能与病理过程相关。事实上，类淀粉样结构致病的机制目前尚不明确。
Shadoo 含有一个疏水区（HD）和一系列串联的精氨酸/甘氨酸重复序列，类似于朊病毒蛋白的N端区域（图1A）。与朊病毒蛋白的N端区域相似，Shadoo 带有强烈的正电荷，表现为一种天然未折叠蛋白11,12。Shadoo 似乎与朊病毒疾病功能相关，因为它能够直接结合朊病毒蛋白。此外，在朊病毒病理过程中，Shadoo 的表达水平会下调13,14。然而，Shadoo 在朊病毒疾病中的具体作用尚未明确。
我们构建了一个携带小鼠Shadoo基因编码序列的质粒。该质粒被用于转化 E. coli 用于N端His的生产6 融合Shadoo蛋白。该表达系统已在本实验室建立完善，并广泛应用于我们正在进行的项目中。 6,15,16表达Shadoo时的一个重要问题是Shadoo的表达载体选择 E. coli 菌株。尽管BL21感受态菌株常用于重组蛋白的表达，但Shadoo蛋白仅在转化后的SoluBL21菌株中成功表达并纯化。SoluBL21感受态 E. coli 是BL21宿主菌株的一种改良突变体，专为表达在原始BL21菌株中无法产生可检测到的可溶性产物的蛋白质而开发。Shadoo在SoluBL21中的高效表达 E. coli 导致蛋白质在包涵体中积累。通常情况下，当非天然蛋白在高水平表达时 E. coli该蛋白倾向于在不溶性包涵体中积累。Shadoo 可能通过非共价的疏水作用或离子相互作用（或二者兼有）聚集，形成由不同程度折叠的蛋白高度富集而成的动态结构。因此，其纯化过程至少包括两个步骤：（i）在变性条件下选择性地将目标蛋白与其他生物分子分离；（ii）对纯化后的蛋白进行复性处理，采用 体外 折叠技术
在含有8M尿素（或替代使用6M盐酸胍）的缓冲溶液中可实现Shadoo的选择性分离。去除尿素并使蛋白复性可通过多种方案进行：（i）在酸性pH溶液中复性，以获得无结构的单体Shadoo蛋白；或（ii）在pH≥7的溶液中复性，以获得聚合为具有特征性交叉β-折叠结构的稳定淀粉样纤维的Shadoo蛋白。
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方案
1. 质粒构建与Shadoo蛋白表达
注意：编码小鼠Shadoo蛋白（Shadoo25-122）的基因已亚克隆至表达载体pET-28中11。该克隆被转化至大肠杆菌SoluBL21菌株（E. coli SoluBL21），以表达带有N端六组氨酸标签的Shadoo蛋白（HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG），具体方法见先前文献11。质粒可向作者申请获取。根据其氨基酸序列计算，Shadoo蛋白的分子量为12,243.2 Da。
注意：所有细菌操作均须在层流罩内或靠近本生灯火焰处进行。
- 采用标准热激方法，将 pET-28-His6-Shadoo 质粒转化至感受态 SoluBL21 菌株中。具体操作为：在含有 50 µl 细菌的离心管中加入 1 至 5 µl 质粒（通常为 10 pg 至 100 ng），混匀后于 42 °C 处理 45 秒。
- 在补充 40 mg/ml 卡那霉素的 LB 培养基中，于 37 °C 培养转化后的细菌，直至 A600 达到 0.5–0.7（图 1B）。
- 加入 240 µg/ml 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导 Shadoo 蛋白过夜表达。在 37 °C、150 rpm 振荡条件下培养细菌。注意：通常细菌培养物过夜后 A600 可达 3。
注意：转化后的细菌可用于后续蛋白表达，可于 -80 °C 保存。保存方法为：向菌液 aliquot 中加入 10%–50%（v/v）无菌甘油，混匀后于 -80 °C 冻存。
图1. Shadoo表达载体构建、细菌转化及Shadoo表达诱导示意图（见步骤1描述）。（A）Shadoo的表达载体编码一个六组氨酸标签，融合于蛋白N端（Nt）。示意图显示Shadoo蛋白包含碱性精氨酸/甘氨酸重复序列（绿色圆柱）、一个疏水结构域（HD）和一个N-糖基化位点（CHO），其后为C末端（Ct）。（B）将pET-28-His6-Shadoo质粒通过热激法（42 °C，45秒）转化至SoluBL21细菌中。转化后的细菌接种于含40 µg/ml卡那霉素的筛选琼脂平板上。挑取单菌落接种至1,000–3,000 ml摇瓶中进行培养。加入1 mM IPTG诱导重组蛋白表达。请点击此处查看该图的高清版本。
2. 低压液相色谱法（LPLC）纯化Shadoo蛋白
- 细胞裂解及包涵体的制备
- 收集细菌悬液，并转移至离心管中（图2）。
- 在4 °C条件下，以2,500 × g离心20分钟。倾去上清液，并将每份来自500 ml培养液的菌体沉淀重悬于15 ml缓冲液（50 mM Tris，10 mM EDTA，pH 8，含蛋白酶抑制剂混合物）中。
注意：重悬后的菌体沉淀可于-20 °C冷冻保存数天。冷冻有助于细菌细胞的裂解。 - 通过SDS-PAGE分析和考马斯亮蓝染色，检测重组蛋白在粗提细菌沉淀中的过表达情况。
- 为此，取1 ml细菌培养物离心收集菌体。向菌体沉淀中加入100 µl Laemmli变性液（277.8 mM Tris-HCl，pH 6.8，4.4% SDS，44.4% w/v 甘油，0.02% 溴酚蓝），于100 °C加热5分钟。
- 取10 µl样品上样至12%丙烯酰胺凝胶，进行SDS-PAGE电泳，并通过考马斯亮蓝染色观察分离的蛋白质。
- 向2.1.2步骤中完全重悬的菌体沉淀中加入Triton X-100，使其终浓度为0.5%。
- 将悬液置于37 °C水浴中孵育30分钟。
- 在冰水中进行超声处理，峰-峰值振幅为6–12微米，持续5分钟，以裂解细菌细胞。
- 将超声处理后的悬液转移至洁净的50 ml离心管中。
- 在4 °C条件下，以15,000 × g离心15分钟。
- 倾去上清液，每管加入5 ml结合缓冲液（20 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.4，0.5 M NaCl，8 M 尿素，5 mM 咪唑）。
- 将离心管置于旋转仪上过夜旋转，以充分溶解包涵体中的蛋白。
图 2. 包涵体纯化流程示意图（见步骤 2.1 的描述）。通过离心收集表达Shadoo蛋白的转化细菌，并将其重悬于裂解缓冲液中。悬浮液在37 °C孵育30分钟，随后进行超声处理以机械破碎细菌细胞。超声过程在冰上进行，以防止样品过热。破碎后的细胞通过离心收集，并重悬于含8 M尿素的缓冲液中，以溶解包涵体中的蛋白。请点击此处查看该图的高清版本。
- Ni 2+-亲和层析
注意：层析在FPLC系统上进行，使用已负载Ni2+的5 ml Sepharose螯合柱（图3A）。所有溶液均以1 ml/min的流速上样至柱中。- 将10 ml 0.2 M NiSO4水溶液注入Sepharose柱，以使柱子负载Ni2+离子。
- 通过注入30–50 ml含有低浓度咪唑的结合缓冲液（20 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.4，0.5 M NaCl，8 M 尿素，5 mM 咪唑），平衡已负载Ni2+离子的柱子。
- 使用50 ml进样环将尿素溶解的蛋白质上样。
- 用10 ml低咪唑结合缓冲液（20 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.4，0.5 M NaCl，8 M 尿素，5 mM 咪唑）充分洗涤柱子，回收流穿组分，以最大限度去除未结合的蛋白质。
- 用50–100 ml洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.5 M NaCl，8 M 尿素，80 mM 咪唑）洗涤柱子，洗脱非特异性结合的蛋白质。
- 在含20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、0.5 M NaCl和8 M 尿素的缓冲液中施加80–800 mM 咪唑的15分钟线性梯度洗脱。在梯度洗脱过程中收集每管1 ml的组分。注意：带His标签的蛋白质通过含咪唑缓冲液的梯度洗脱（咪唑作为竞争剂）。
- 从每管组分中取8 µl等分试样，加入4 µl 4x Laemmli变性溶液（见2.1.3.1）。将溶液在100 °C加热5分钟。
- 将10 µl蛋白质分子量标记物和每份样品各10 µl上样至12%丙烯酰胺凝胶，进行SDS-PAGE电泳，并通过考马斯亮蓝染色观察分离的蛋白质。注意：根据Shadoo氨基酸序列计算的分子量为12,243.2 Da。
- 合并所有含有Shadoo的组分。
图3. 蛋白质纯化流程（如步骤2.2–2.4所述）。(A) Ni2+离子可与组氨酸残基配位，从而实现对多聚组氨酸标签蛋白的选择性纯化。通过加入咪唑进行洗脱，因其可与Ni2+离子配位并置换已结合的蛋白质。(B) 在Ni2+柱上保留的不同流体动力学半径的蛋白质随后在尺寸排阻柱上实现分离，洗脱顺序从大到小。(C) 使用前，合并含有Shadoo的组分并进行脱盐处理，以去除尿素、咪唑和盐分。质量控制检测包括SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色和Western blotting。纯化的Shadoo可进行冷冻干燥。冻干后的Shadoo在-20 °C保存时可稳定数月。请点击此处查看该图的高清版本。
- 尺寸排阻色谱
注意：第二步纯化采用尺寸排阻色谱法，可将Shadoo蛋白与第一步纯化过程中共同洗脱的其他蛋白分离开。 (图3B).- 用20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4，含0.5 M NaCl和8 M尿素）以1.5 ml/min的流速进样250 ml，平衡总体积为120 ml的Superdex柱。
- 将2.2.9步骤中收集的含Shadoo的混合组分上样至已平衡的柱子中。以之前所述缓冲液保持恒定流速，待40 ml柱体积空管后，收集每管1 ml的洗脱组分。
- 取一个 10 µl 取各组分等分试样，按上述方法进行SDS-PAGE分析及考马斯亮蓝染色，以确定含有Shadoo的组分。
- 含有Shadoo的组分混合液
- 脱盐
注意：脱盐步骤可去除盐、咪唑和尿素，从而获得适用于进一步生物物理和生化研究的缓冲液中的重组Shadoo蛋白图3C）。通过将样品对缓冲液进行透析，也可获得相同的结果。- 用150 ml pH 5的10 mM醋酸铵缓冲液以5 ml/min的流速平衡53 ml脱盐柱。
- 将汇集的Shadoo组分上样至柱中。当注入乙酸铵缓冲液后，手动收集紫外检测器在280 nm处信号升高的洗脱组分。
- 冻干脱盐后的Shadoo，并于-80℃保存20 °C.
- 使用前，将冻干的Shadoo溶解于适当的缓冲液中，例如10 mM醋酸钠缓冲液（pH 5）。
注意：聚组氨酸标签可通过肠激酶切除。
3. 体外 生理pH条件下Shadoo蛋白向淀粉样纤维的组装
注意：Shadoo 蛋白在 pH ≥ 7 时会发生聚集并自发形成纤维 11。
图 4. Shadoo 重折叠形成淀粉样纤维的示意图（见步骤 3 的描述）。纯化的 Shadoo 在 pH ≥ 7 的缓冲液中溶解时会自发转化为淀粉样纤维。在酸性溶液中，Shadoo 需在 1 M Gdn-HCl 中振荡孵育后转化为淀粉样纤维。质量控制检测包括电子显微镜观察和硫磺素 T（ThT）染色。请点击此处查看该图的高清版本。
- 将Shadoo用20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）稀释至终浓度为2 µM。通过测定溶液在280 nm处的光密度，并结合基于Shadoo氨基酸组成推导出的消光系数20,970，来测定其浓度。
- 取500 µl该溶液置于锥形塑料管中，在4 °C下孵育数周，以诱导蛋白质自发转化为淀粉样结构（图4）。
- 向100 µl Shadoo溶液的等分试样中加入新配制的硫黄素T（ThT），使其终浓度为10 µM。在室温下孵育5分钟。使用435 nm激发波长，测定460至520 nm范围内的荧光发射，以验证淀粉样结构的存在17。
4. 体外 Shadoo 在酸性 pH 条件下组装形成淀粉样纤维
- 将Shadoo稀释于1 M GdnHCl、20 mM Na-醋酸盐缓冲液（pH 5）中，使其终浓度为2 µM。
- 取500 µl该溶液置于锥形管中，在37 °C下持续振荡孵育3–7天。
- 通过向该溶液的等分试样中加入ThT，检测淀粉样纤维的存在，操作同3.3步骤。
- 将所得悬液对10 mM Na-醋酸盐缓冲液（pH 5.0）进行透析，以纯化Shadoo淀粉样纤维。
- 将纯化后的纤维在+4 °C下保存。
图5. 代表性结果。 对从Ni2+负载的螯合柱（A）和凝胶过滤柱（B）洗脱的蛋白质组分进行SDS-PAGE分析并用考马斯亮蓝染色。使用SPRN抗Shadoo抗体鉴定纯化的Shadoo蛋白（C）。请点击此处查看该图的放大版本。
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结果
每升细菌培养物可获得约 5-10 mg 纯化的 Shadoo 蛋白。为获得高纯度的重组 Shadoo 蛋白，需进行两步纯化。第一步采用 Ni2+ 螯合柱亲和层析，保留带有 His 标签的蛋白。收集的洗脱组分通过 SDS-PAGE 电泳并用考马斯亮蓝染色分析（图 5A）。含有 Shadoo 蛋白的组分合并后，进一步通过凝胶过滤层析进行第二步纯化，该方法根据蛋白分子大小进行分离（Shadoo 分子量约为 12 kDa）。洗脱后收集的各组分通过 SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色分析进行检测（图 5B）。此外，使用特异性抗 Shadoo 抗体 SPRN 进行 Western 印迹分析，可确认 Shadoo 蛋白的存在，该抗体识别位于蛋白 C 末端区域第 76-105 位氨基酸之间的敏感表位（图 5C）。
通过ThT染色（图6A）和负染电镜（图6B）验证了Shadoo重折叠形成淀粉样纤维。ThT是一种荧...
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讨论
本文介绍了一种简便高效的重组小鼠Shadoo蛋白的表达与纯化方案，可获得大量目标蛋白。该方法能够成功实现（His6）标签重组Shadoo蛋白的溶解与纯化。如标题所述，Shadoo在原核生物大肠杆菌（E. coli）中表达时会形成包涵体，这一点至关重要。在进行Shadoo纯化前，需使用含Triton X-100的缓冲液通过超声处理裂解细菌。随后，包涵体可在8 M尿素变性溶液中溶解。由于Shadoo易于发生聚合与聚集，整个纯化过程必须在8 M尿素缓冲液中进行。包涵体溶解并澄清后，含有变性蛋白的上清液需经过两步纯化：亲和层析和尺寸排阻层析。亲和层析步骤利用（His6）标签将Shadoo结合至Ni2+螯合柱上。在8 M尿素溶液中，蛋白质处于变性状态，其组氨酸残基暴露于表面。此外，尿素可通过抑制可能存在的污染性蛋白酶的活性，从而维持Shadoo的结构完整性。在第二步纯化中，用咪唑梯度洗脱的Shadoo需进一步进行尺寸排阻层析，以去除杂质蛋白。在此步骤中，大分子蛋白因无法进入基质孔隙而直接通过层析柱，率先被洗脱；而较小的蛋白（如Shadoo）可进入孔隙，路径更曲折，...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨向阿尔伯塔大学的 Natalie Doude 和 David Westerway 致谢，感谢他们提供 Sho cDNA；向法国国家农业科学研究院（INRA）的 Christophe Chevalier 致谢，感谢其协助质粒构建；向法国国家农业科学研究院（INRA）的 Michel Brémont 致谢，感谢其提供 BL21Sol 菌株；向法国国家农业科学研究院（INRA）的 Christine Longin 致谢，感谢其在透射电子显微镜（TEM）方面的技术支持；并向法国国家农业科学研究院（INRA）的 Edith Pajot-Augy 致谢，感谢其提出的修改意见以及对文稿的校对。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AKTA FPLC | GE, Amersham | # 1363 | |
| HiLoad 16/60 Superdex | GE Healthcare | 17-1069-01 | |
| HiTrap IMAC | GE Healthcare | GE17-0920-05 | |
| HiPrep 26/10 脱盐柱 | GE Healthcare | GE17-5087-01 | |
| SoluBL21 感受态 E. coli | Genlantis | C700200 | |
| pET-28b+ | Novogen | 69865-3 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LB 培养基 | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Eppendorf Biophotometer | Eppendorf | 550507804 | |
| 吐温 X-100 | Life Technologies | 85111 | |
| NiSO₄ | Sigma-Aldrich | 656895 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T | |
| 蛋白酶抑制剂混合片剂 | Roche | 4693116001 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| 咪唑 | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Gdn-HCl | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| 蛋白分子量标记物 | Thermo Fisher Scientific | 26620 |
参考文献
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