对水样的自动固相萃取小污染物的免疫学分析的简单方法

Summary

提出了一种使用自动化和小型化系统从水样中提取和预浓缩雌二醇的方案。

Abstract

对环境水样的固相萃取（SPE）的新方法。所开发的原型是成本效益和用户友好的，并能进行快速，自动化和简单的SPE。预浓缩的溶液与通过免疫测定分析兼容，具有低的有机溶剂含量。一种方法被描述为天然激素17β雌二醇在100ml水样提取和预浓缩。反相SPE执行与十八烷基二氧化硅吸附剂和洗脱用200μl甲醇50％体积/体积的完成。洗脱剂是通过将二 - 水，以降低甲醇的量稀释。手动制备SPE柱后，整体过程1小时内自动执行。在该过程结束时，雌二醇浓度通过使用市售酶联免疫吸附测定（ELISA）进行测定。 100倍预浓缩得以实现，在只有10％体积/体积的甲醇含量。完全恢复的分子用1ng得以实现/升掺入去离子和合成海水样品。

Introduction

样品制备是在任何分析过程中的重要一步。特别是，除去基体效应，干扰的缩减，且分析物的富集是必要的，以获得精确的结果，并达到检测的低限。内分泌干​​扰化合物（内分泌干扰物）是特别值得关注的，因为它们对活的生物体的动作，即使在环境中存在的非常低的水平。天然激素17β雌二醇存在于欧盟水污染的收藏和容易被加入到根据欧洲水框架指令调节优先物质清单。固相萃取（SPE）通常适用于小的污染物在水中的分析，与两个化学^1-5（色谱，质谱）和免疫^6-9检测方法。后者积累了环境监测领域的兴趣，如免疫测定法是在大量的各种格式提供，特定于たrget分析物，和达到低检测极限^{。6，7，10，11}的各种酶联免疫吸附测定（ELISA）是可商购，并使得能够分析多个样品同时上的多孔板。该过程包括在连续的反应步骤，可能需要几个小时。反应的最终产物，可以检测光学来确定基于校准曲线对目标分子的浓度。

经典的SPE程序包括吸附剂预调节，样品萃取，清洗，洗脱，浓缩由洗脱液蒸发。用于稀释该提取物的溶剂选自根据检测方法。对于免疫学方法中，有机溶剂的影响强烈的方法的灵敏度的量^。12

除了回收和预浓缩的表演中，该方法也需要简单和成本效益。在再修改的自动化Ë有助于减少人类相关的错误。在我们以前的工作¹³我们推出了样机的自动固相萃取，而我们的方法适用于天然激素17β雌二醇海水....

Protocol

注意:下面的协议说明了SPE 100毫升的水样品与C18的吸附剂和洗脱用50％体积/体积甲醇进行。富集的样品稀释分析用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒的酶之前达到10％体积/体积甲醇。

1.准备试剂

1. 制备水样
   1. 之前的任何其它步骤，筛选各100毫升的水样品与0.2μm孔径的过滤器。
   2. 通过稀释的参考溶液适当体积入水体积穗与期望浓度的样品。例如，制备100毫升的水样品与E2的100纳克/升的稀释3.3微升的E2参考溶液在300微克/升的浓度。稀释此溶液十次以获得一个样品掺入10纳克/升的E2。稀释后者另一个十倍，得到100ml的样品与1纳克/升的E2。
   3. 放置过滤后的样品（未修饰的或加标）在玻璃瓶中以GL45线程。使用示例在同一天。取一小部分，以与ELISA法进行分析，来估计初始浓度。
2. 通过在去离子（二 - ）水在紧管稀释甲醇至50％体积/体积制备300μl的洗脱液。

2.制备固相萃取柱的

1. 通过加入第一1600微升甲醇中，然后加入400μl的二 - 水至40mg反相吸附剂的制备20毫克/毫升悬浮十八烷基二氧化硅吸附剂颗粒。盖紧盖子，搅拌用旋涡。
2. 安装在塔底部的膜
   1. 选择一个尼龙膜孔径为11微米，将其放置在防尘组织构成的双层。用3毫米直径冲头，切断在膜2的小零....

Results

吸附剂填料的再现性通过干燥评价和加权在玻璃小瓶的移液吸附剂，结果示于图1。重复性的喷射时100ml中的样品进行了测试，如在初始和预如图 2所示。浓度浓缩加标样品通过使用商业ELISA试剂盒17β雌二醇测定，并示于图3。

所提出的方法包括在制备吸附剂相（ 图1）的用户。吸附剂颗粒被两膜之间保持机械稳定性，并且密集通过施加与注射器而吹打悬浮液在塔中的压力。所得列包含所选择的吸附剂6毫克，只有6％的误差在此值的优化量。此步骤还充当作为吸附剂调节，在悬浮液中拨溶剂条件制备。

制备和系统上安装SPE柱，和装载在适当的水库解决方案之后，在预浓缩.......

Discussion

提出了水样然后分析使用免疫的制备新方法。该仪器能够以自动化和用户友好的方式进行固相萃取。

水样其注射之前到系统的过滤是非常关键的。溶液中存在的任何微粒仍然会潜在地引起流体网络的堵塞和阻碍SPE柱。另一个重要步骤是在SPE柱的制备。在列颗粒的量是至关重要的，以达到最佳的性能成为可能。制备吸附剂颗粒的悬浮液时，避免了粒子的附聚特必须小心​​。这是通过添加第一溶剂部分到干吸附剂，然后将二 - 水部分来实现的。然后，在包装工序中，以混合悬浮液以及同时吸取100μl的用吸管是很重要的。在SPE亲的结束cedure，正确清洗系统是至关重要的。首先，它可以防止交叉污染具有不同样品时，其次它避免了当不使用生物污染仪器的风险。

正如在介绍中所讨论的，使用的免疫检测方法的小分子污染物的环境中的分析正在扩大。这些方法达到的检测中的低纳克/升的水平^7,11限制和有被非常具体的优点。这样的方法结合使用的化学方法，大多质谱相关技术^{。14，15，}后者不限制使能达到所需的高预浓缩因子使用有机溶剂和效益的从自动化固相.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
滤膜 0.2 &μ;m 孔径	Merck Millipore	GNWP04700	用于样品过滤
尼龙膜 11 μm 孔径	Merck Millipore	NY1104700	用于 SPE 柱
一次性活检打孔器 5 mm	医疗预算	39302439
Nucleodur C18 ec	马赫里内格尔	713550.01	50 μm 粒径
合成海水	Sigma Aldrich	SSWS500-500ML
甲醇	VWR
17β-雌二醇 标准	Enzo 生命科学		300 ng/ml
17β-雌二醇 ELISA 试剂盒	Enzo 生命科学	ADI-900-008	96 孔，范围 30 - 3,000 ng/L