一种用于水样中小分子污染物免疫学分析的自动化固相萃取简易方法

摘要

介绍了一种利用自动化微型系统从水样中提取和预浓缩雌二醇的方案。

摘要

提出了一种用于环境水样固相萃取（SPE）的新方法。所开发的原型装置成本低、操作简便，能够实现快速、自动化且简单的固相萃取。富集后的溶液有机溶剂含量低，适用于免疫分析。文中描述了从100 ml水样中萃取和富集天然激素17β-雌二醇的方法。采用十八烷基键合硅胶吸附剂进行反相固相萃取，以200 µl体积分数为50%的甲醇进行洗脱。通过加入去离子水稀释洗脱液，以降低甲醇含量。固相萃取柱经手动制备后，整个流程可在1小时内自动完成。实验结束后，采用商用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定雌二醇浓度。该方法实现了100倍的富集倍数，洗脱液中甲醇体积分数仅为10%。在添加浓度为1 ng/L的去离子水和合成海水样品中，目标分子的回收率均达到完全。

引言

样品制备是任何分析过程中的关键步骤。特别是为了获得精确的结果并达到较低的检测限，消除基质效应、减少干扰以及富集待测物是必要的。内分泌干扰物（EDCs）尤其值得关注，因为即使在环境中浓度极低，它们也会对生物体产生作用。天然激素17β-雌二醇已被列入欧盟水污染监测清单，并可能被加入《欧洲水框架指令》所规定的优先控制物质清单中。固相萃取（SPE）常用于水中微量污染物的分析，可结合化学^1-5（色谱、质谱）和免疫学^6-9检测方法使用。近年来，免疫学方法在环境监测领域受到关注，因为免疫分析具有多种检测形式，对目标待测物具有高度特异性，并且能够达到较低的检测限^{6, 7, 10, 11}。目前市面上已有多种酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，可在多孔板上同时分析多个样品。该方法包括一系列连续的反应步骤，整个过程可能耗时数小时。最终反应产物可通过光学手段检测，依据标准曲线确定目标分子的浓度。

传统的固相萃取（SPE）步骤包括吸附剂预处理、样品提取、洗涤、洗脱以及通过蒸发洗脱液进行浓缩。用于稀释该提取物的溶剂需根据检测方法进行选择。对于免疫学方法，有机溶剂的含量会显著影响方法的灵敏度。¹²

除了回收率和富集性能外，该方法还需具备操作简便和成本低廉的特点。自动化操作有助于减少人为误差。在我们之前的研究¹³中，我们介绍了用于自动固相萃取（SPE）的原型装置，并将该方法应用于海水中天然激素17β-雌二醇的分析。通过本视频，我们旨在突出本方法相较于传统离线和在线SPE在技术上的优势，以及其与免疫反应检测技术特别良好的兼容性。我们详细描述了用于水中17β-雌二醇检测的实验方案。固相萃取采用十八烷基键合硅胶（C18）作为吸附剂，洗脱则使用稀释的甲醇进行。

方案

注意：以下方案描述了使用C18固相萃取柱对100 ml水样进行固相萃取，并以50%（v/v）甲醇洗脱的操作流程。富集后的样品需稀释至甲醇终浓度为10%（v/v），再用于酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒分析。

1. 准备试剂

1. 准备水样
   1. 在进行其他任何步骤之前，使用孔径为 0.2 µm 的滤膜对每份 100 ml 水样进行过滤。
   2. 通过将适量的标准溶液稀释至一定体积的水中，使样品中目标物质达到所需浓度。例如，将 3.3 µl 浓度为 300 µg/L 的 E2 标准溶液稀释至 100 ml 水中，制备含 100 ng/L E2 的水样；再将该溶液稀释 10 倍，得到含 10 ng/L E2 的加标样品；进一步将后者再稀释 10 倍，获得 100 ml 含 1 ng/L E2 的样品。
   3. 将过滤后的样品（未修饰或加标）置于带有 GL45 螺纹的玻璃瓶中。样品应在同一天内使用。取少量样品用于 ELISA 分析，以测定初始浓度。
2. 在密封管中将甲醇与去离子水按体积比 50% 稀释，配制 300 µl 洗脱液。

2. SPE 柱的制备

1. 通过先加入1,600 µl甲醇，再加入400 µl去离子水至40 mg反相固相萃取吸附剂中，制备20 mg/ml的十八烷基硅胶吸附剂悬浮液。盖紧瓶盖后，用涡旋振荡器振荡混匀。
2. 在柱中安装底部膜
   1. 选取一片孔径为11 µm的尼龙膜，将其放置在双层防尘纸巾上。使用直径为3 mm的打孔器，在膜上切下两个小片。
   2. 用平头镊子夹取其中一片小膜，并将其放置在柱的一端。
   3. 将平底接头与管路连接并拧紧。此时膜已固定到位，可安全加入吸附剂。在柱体上画一个箭头，指向放置膜的一端。
3. 制备填充吸附剂柱
   1. 将柱固定在支架上，使箭头朝向下方。柱体应尽可能保持垂直。
   2. 使用鲁尔锁接头，将一个空的10 ml一次性注射器连接到柱的管路末端。
   3. 准备一支带有20–200 µl吸头的微量移液器，并将体积设定为100 µl。该移液器吸头规格适用于待制备的吸附剂柱尺寸；若使用更大的移液器吸头（如1 ml移液器所用吸头），操作将更加困难。
   4. 用涡旋振荡器充分振荡吸附剂悬浮液，迅速吸取100 µl并加至柱中心位置。在注入的同时，用另一只手操作注射器，轻柔地将全部移液后的溶液通过膜吸出。此时注射器内收集的溶液应无颗粒，且可在柱内观察到颗粒层的形成。
   5. 在每次移液前均需重新振荡原液悬浮液以确保颗粒均匀分散，重复此过程再进行两次。最终柱内含有6 mg吸附剂。
   6. 当300 µl悬浮液全部上样并通过注射器抽吸干燥后，保持注射器连接状态，用另一只手使用镊子将第二片尼龙膜放置在柱顶部。
   7. 拧紧第二个带管接头，并移除注射器。固相萃取柱现已准备就绪，可供使用。

3. 系统准备

1. 使用鲁尔锁紧接头将固相萃取柱固定在装置上，箭头方向必须与装置上所示方向一致。
2. 将装有样品的瓶子通过提供的GL45安全盖旋紧连接至装置。
3. 在“洗脱液”储液池中加入200 µl洗脱液。
4. 在“稀释液”储液池中加入800 µl去离子水。
5. 在废液出口处放置一个容器，用于收集萃取过程中产生的废液。容器规格不限，但体积必须足够大，以适应样品体积。
6. 在传感器出口处放置一个最小容量为1.5 ml的小瓶。若最大体积仅为1 ml则过小，因为在收集富集洗脱液和稀释缓冲液时该出口处会产生气泡。
7. 手动逆时针旋转压力调节阀至无法继续转动，确认其处于关闭位置。

4. 使用原型进行固相萃取

1. 按下背面的按钮以启动原型机。
2. 准备用户界面并选择程序
   1. 打开用户界面。从列表中选择设备所连接计算机的通信端口，然后点击“下一步”按钮。
   2. 输入数值 580 用于 pset 和 30 用于 dpset泵在运行时将自动调节，以维持加压系统和储液罐的压力在580 ± 30 mbar。
   3. 选择自动模式。
   4. 在自动模式区域，于“配置文件路径”框中加载程序文件。
3. 调节压力调节器
   1. 启动泵。
   2. 手动调节压力调节器，直至读取的数值达到所需值 妊娠 低于但接近 320 mbar。
   3. 停止泵。
4. 开始固相萃取（SPE）程序
   1. 在自动模式角落点击“开始”。泵将自动启动，随后提取、洗脱和稀释步骤将依次自动进行。整个100 ml样品的处理过程耗时50分钟。
   2. 验证 preg 的数值。在提取步骤中，其值必须处于 320 - 350 mbar 范围内，以确保最佳流速。
   3. 盖紧小瓶，避光保存于4-5 °C，直至分析。应在接下来的30小时内完成分析，以防止待测物降解。
   4. 处理后的水应妥善处置。
5. 清洗系统
   注意：每次提取步骤后，需对系统进行清洗，以防止交叉污染。
   1. 在GL 45玻璃瓶中配制10 ml体积分数为70%的甲醇溶液。
   2. 拔下固相萃取柱，并使用接头堵住管路。
   3. 在自动模式下，选择“cleaning”文件，并使用相同的压力设置启动。

5. 使用 ELISA 检测雌二醇浓度

1. 根据所用ELISA试剂盒提供的说明书，配制相应浓度的校准样品。准备一组与样品基质相同的校准样品，另准备一组含10% v/v甲醇的校准样品。
2. 按照试剂盒生产商的说明，将所需量的样品加入微孔板的孔中。使用未经修饰的校准样品、经过滤但未经过固相萃取（SPE）处理的加标水样，以及含10% v/v甲醇的富集样品。每个样品使用三个孔，以减少检测过程中的误差。
3. 按照试剂盒说明书中的指示，依次加入反应试剂，控制孵育时间，并进行洗涤及后续的酶促反应。
4. 使用酶标仪按照试剂盒生产商的说明读取各孔的光信号，并收集数据。
5. 利用酶标仪配套软件拟合校准曲线，测定与原始样品基质相同的样品以及含10% v/v甲醇的富集样品中E2的浓度。

结果

通过将移液的吸附剂转移至玻璃小瓶中干燥并称重，评估吸附剂填充的重复性，结果如图1所示。对100 ml样品进行了进样时间重复性的测试，如图2所示。初始样品及加标预浓缩样品中的浓度采用商用17β-雌二醇ELISA试剂盒测定，结果如图3所示。

本方案需要用户参与制备吸附剂相（图1）。吸附剂颗粒被夹在两层膜之间以提供机械稳定性，并在将悬浮液移液至色谱柱时通过注射器施加压力使其紧密填充。所得色谱柱中含有优化量的6 mg选定吸附剂，误差仅为6%。此步骤同时也起到吸附剂活化的作用，因为悬浮液是在适当的溶剂条件下制备的。

在完成固相萃取柱的制备并将其安装到系统上，以及将溶液加载至相应的储液槽后，富集前处理过程完全自...

讨论

提出了一种用于水样制备并结合免疫分析的新方法。该仪器能够以自动化且用户友好的方式完成固相萃取。

在将水样注入系统之前进行过滤至关重要。溶液中若残留任何颗粒物，均可能导致流体网络堵塞并阻碍固相萃取（SPE）柱的正常运行。另一个关键步骤是SPE柱的制备。柱内填料颗粒的数量对于实现最佳性能至关重要。在配制吸附剂颗粒悬浮液时需格外小心，以避免颗粒发生团聚。为此，应先将溶剂部分加入干燥的吸附剂中，然后再加入去离子水部分。随后，在装柱过程中，使用移液器吸取100 µl悬浮液时，必须充分混匀悬浮液。SPE步骤结束后，对系统进行彻底清洗十分关键：一方面可防止处理不同样品时发生交叉污染，另一方面可在仪器闲置时避免生物污染的风险。

如引言中所述，免疫检测方法在环境中小分子污染物分析中的应用正在不断扩展。这些方法的检测限可达低 ng/L 水平^{7, 11}，且具有高度特异性的优势。此类方法通常与化学分析方法联用，主要是质谱相关技术^{14, 15}。后者对有机溶剂的使用限制较少，并可借助自动固相萃取（SPE）系统实...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
孔径 0.2 μm 的滤膜	Merck Millipore	GNWP04700	用于样品过滤
孔径 11 μm 的尼龙膜	Merck Millipore	NY1104700	用于固相萃取柱
一次性活检打孔器 5 mm	Medical Budget	39302439
Nucleodur C18 ec	Macherey Nagel	713550.01	颗粒直径 50 μm
合成海水	Sigma Aldrich	SSWS500-500ML
甲醇	VWR
17β-雌二醇标准品	Enzo Life Science		300 ng/ml
17β-雌二醇 ELISA 试剂盒	Enzo Life Science	ADI-900-008	96 孔，检测范围 30 - 3,000 ng/L