一种用于小鼠异位整块胸壁、胸腺和心脏移植的新型显微外科模型

摘要

为了研究联合实体器官与血管化复合异体移植，我们描述了一种新的小鼠异位整块胸壁、胸腺和心脏移植模型，该模型采用颈部无缝合套管技术。

摘要

必须探索器官移植领域的新策略，以延长同种移植物的存活时间，并尽量减少长期维持性免疫抑制治疗的需求。在多种动物模型中，血管化骨髓移植以及胸腺组织共移植已显示出良好的应用前景^1-11。血管化骨髓移植可在保留供体微环境的前提下，实现供体骨髓细胞的持续迁移；而将胸腺组织与血管化骨髓联合移植，已被证明可提高T细胞嵌合水平，最终在诱导免疫调节过程中发挥支持作用。实体器官移植与血管化复合组织移植的结合，可将上述策略整合为一种全新的移植模型。小鼠模型是研究急性与慢性排斥反应、嵌合状态及免疫耐受诱导机制的理想范式，可为后续在大型动物模型及临床应用中推进更优的移植物存活策略奠定基础。本文中，我们建立了一种新型的小鼠异位整块胸壁、胸腺与心脏联合移植模型，采用颈部无缝合套管技术完成手术。本研究通过图文说明及视频补充材料，详细描述了该模型在同基因型和异基因型移植环境下的操作经验，以供未来开展更广泛的免疫学研究参考。

引言

心脏移植是终末期心力衰竭的首选治疗方法。技术进步和药物创新已推动移植早期接受率超过90%^12,13。尽管如此，移植心脏5年存活率仍停滞在60%至80%，慢性排斥反应（以移植性血管病变为特征）仍然不可避免^14-16。此外，患者需接受多次外科手术，并终身接受免疫抑制治疗，分别可能导致胸壁畸形以及药物相关的医学后遗症和毒性反应。迫切需要创新策略来延长同种移植物存活时间，减少免疫抑制剂的使用需求，并为解剖结构畸形提供重建治疗选择。

血管化复合组织异体移植为改善心脏移植的结局提供了一种独特的策略，这种策略既具有免疫学方面的优势，也具有重建外科方面的价值。¹⁷ 血管化复合移植物的独特之处在于其本身含有供体来源的造血干细胞，这些干细胞已被证明能够有效减少免疫抑制剂的使用，并诱导及维持混合嵌合状态。^1-8 此外，联合移植胸腺已被证实可延长实体器官移植和血管化复合移植物的存活时间。^2,9-11 将这些策略与心脏移植相结合，为应对上述心脏移植所面临的挑战提供了新的解决方案。¹⁸

由于存在大量可用的抗体以及明确定义的近交系和基因敲除小鼠品系，小鼠模型成为进行机制性体内研究的优秀平台。^19-21 尽管小鼠心脏移植通常采用异位腹腔内显微外科缝合移植模型进行研究^22-25，但异位颈部无缝线套管技术模型已被证明具有极高的可重复性、可靠性，并且血栓发生率更低。^19,26,27 本研究的目标是建立一种小鼠异位整块骨肌皮胸壁、胸腺及心脏联合移植技术，利用颈部无缝线套管法来研究实体器官与血管化复合组织联合移植的免疫学机制。该多器官同种移植物通过供体降主动脉与受体右侧颈总动脉、供体肺动脉与受体右侧颈外静脉的吻合实现灌注。保留内乳血管及其相关的胸腺分支对于胸壁（胸骨、肋骨、肌肉和皮肤）及胸腺的灌注至关重要。

方案

所有手术操作均按照约翰斯·霍普金斯大学以及美国农业部和公共卫生服务部的要求完成。本方案遵循约翰斯·霍普金斯大学动物护理和使用委员会（机构审查委员会）批准的指南（方案编号 M013M490）。以下所述手术的最终存活数据均已记录。 供体和受体动物均在手术前一小时接受剂量为0.1 mg/kg、皮下注射的布托啡诺进行预先镇痛；在受体动物中，移植术后以相同剂量再次给予布托啡诺，并在术后前48小时内根据需要重复给药。 

1. 供体异体移植物的获取

注意：移植手术的供体部分应在40分钟时开始 早于受体移植操作，以缩短受体的麻醉时间，并便于使供体操作结束时间与受体准备结束时间同步或略早于后者。

1. 使用标准的无菌显微外科器械和无菌手套进行操作。本实验室采用高压灭菌法对显微外科器械进行灭菌。
2. 使用4%异氟烷诱导蒸发器对供体小鼠（雄性）进行麻醉。使用无创机械剪毛器去除颈部、胸部和腹部区域的毛发。将动物置于仰卧位，并通过鼻罩维持1-2%异氟烷麻醉。通过定期评估脚趾夹捏回缩反射，确保整个操作过程中麻醉充分。
3. 在皮肤切口前，使用无菌棉签先涂抹聚维酮碘消毒剂，再用异丙醇广泛准备手术区域。
4. 首先，使用剪刀在颈部和腹部皮肤做横向的浅表切口。然后，沿两侧腋中线将这两个切口连接起来。
5. 使用显微外科镊子双侧解剖颈部，以6-0丝线结扎并剪断颈外静脉。随后使用电凝刀切断双侧胸锁乳突肌，暴露颈内静脉和颈总动脉。以6-0丝线分别在左侧和右侧将颈总动脉与颈内静脉一并穿过并绕线。
   注意：稍后将在步骤 1.9 中进行结扎和分割。
6. 使用剪刀锐性分离位于气管前方的带状肌及相关的疏松蜂窝组织，以松解颈部区域的剩余附着结构。
7. 使用双极电凝和锐性分离，切开胸大肌和锁骨以暴露锁骨下血管，并近端结扎（6-0 丝线）后切断。
8. 接下来，轻柔地抓住并拉出动物的阴茎。沿阴茎背侧观察阴茎背静脉，用异丙醇对该区域进行消毒。使用30 G针头，通过阴茎背静脉注射30,000单位肝素，然后让阴茎回缩至原始位置。肝素溶液可能部分渗漏至周围组织中。 
9. 使用先前放置于颈总动脉和颈内静脉周围的粗线，双侧结扎并切断这些结构。
10. 接下来使用剪刀进行横向腹腔切口。取出肠管以暴露肝下腔静脉，向肝下腔静脉注入2 ml冷Euro-Collins停跳液。通过观察肝脏变色及心跳停止，确认注射到位后，再进行下一步操作。
    注意：Euro-Collins 溶液由本实验室配制，详见特定试剂与仪器表。
11. 使用剪刀从暴露的腹部经双侧膈肌切口进入胸腔。将切口通过肋间肌和肋骨向头侧延伸。将胸壁向外翻折，暴露心脏、胸腺和大血管，同时确保沿胸壁走行的胸廓内血管得到保护。
12. 向肝上段下腔静脉注入4 ml冷Euro-Collins心脏停搏液。
13. 识别主动脉根部，并向远端追踪至降主动脉。锐性切断降主动脉（保留最大长度）。
14. 识别肺动脉干，并在其分叉点近端切断（保留最大长度）。然后使用 2 ml 冷 Euro-Collins 心肌停搏液，将软塑料头导管插入肺动脉干管腔内，冲洗肺动脉干和心脏。
15. 使用6-0丝线结扎并切断下腔静脉、肺静脉汇合处以及双侧上腔静脉的附属分支。随后小心游离心脏，从主支气管和气管附着处向头侧抬起并解剖心脏，注意避免进入气道。使用锐性分离及双极电凝仔细分离胸壁、胸腺及心脏，完全将心脏从供体小鼠中游离出来。
16. 最后，修剪同种异体胸壁 离体 沿胸骨和肋骨侧缘小心剪开，使用剪刀将其剪至较小尺寸，注意不要损伤胸内血管（图1A为减少再血管化后的出血，应沿胸骨骨肌皮瓣边缘使用双极电凝止血。
17. 将异体移植物置于 10 ml 冷（4^o 如果受体尚未准备好植入，则将同种异体移植物保存在4°C的Euro-Collins溶液中；但如果受体已准备好植入，则直接将移植物转移至受体手术区域。

2. 受体准备

注意：为尽量缩短受体麻醉时间，应在另一个手术操作台开始受体准备工作，时间约为40分钟 在供体异体移植物采集完成之前。

1. 为该手术操作准备一套独立的无菌显微外科器械和无菌手套。
2. 使用4%异氟烷诱导麻醉器对受体小鼠（雄性或雌性）进行麻醉。使用无创机械剪毛器去除右侧颈部及胸部区域的毛发。
3. 将小鼠置于仰卧位，并将右上肢轻微向下倾斜，使头部与右上肢之间形成约110度的角度。通过鼻罩持续给予1–2%异氟烷以维持麻醉状态。
4. 使用棉签将凡士林眼膏涂抹于小鼠眼睛表面。在皮肤切口前，使用聚维酮碘消毒剂广泛消毒手术区域，随后用异丙醇脱碘。
5. 使用剪刀从正中线沿下颌右下缘做皮肤切口，并向右下外侧延伸至胸部区域。使用显微血管钳进行钝性分离，将颈外静脉从周围软组织和外膜中完整游离。使用电凝切断所有分支，并通过锐性分离结合电凝切除下颌下腺右叶，为移植组织腾出空间。
6. 确保颈外静脉有足够的长度以翻转套入套管，先用6-0丝线结扎颈外静脉。将静脉穿过预切好的聚酰亚胺套管腔，使用微型血管夹固定血管-套管复合体。然后用剪刀在近端切断颈外静脉，将其翻转套在套管上，并用10-0尼龙线固定。（图1B）
7. 使用双极电凝切断右侧胸锁乳突肌，暴露颈总动脉。向头侧游离动脉，直至达到颈部区域最远端的位置。此步骤通过使用镊子进行钝性分离，去除血管周围的软组织和外膜完成。
8. 使用6-0丝线结扎并切断颈总动脉。将动脉穿过预切好的聚酰亚胺套管腔，并尽可能靠近胸廓入口处用微型血管夹固定。远端切断血管后，使用显微外科扩张器轻柔扩张血管，将其翻转套在套管上，并用10-0尼龙线固定。（图1B）
   注意：具体的显微外科扩张器详见特定试剂与仪器表格中的描述。

3. 异体移植物植入

1. 使用标准的无菌器械和无菌手套，将同种异体移植物以倒置且斜向的位置植入受体颈区。
2. 接着，将供体降主动脉管腔套入受体的动脉套环结构上，并用10-0尼龙缝线固定（图1C和1D）。
3. 在供体肺动脉与受体小鼠翻转的外颈静脉-套环结构之间，采用与步骤3.2相同的方式进行吻合（图1C和1D）。
4. 首先移除静脉微血管夹（外颈静脉夹），然后松开动脉夹（颈总动脉夹）。在动脉再灌注过程中，全面检查移植物以排除任何出血。若发现出血，应重新夹闭动脉夹以减少失血，并使用双极电凝止血处理出血部位。
5. 检查移植物并确保止血完全。松开并完全移除动脉微血管夹。观察心脏是否出现再灌注征象，表现为心腔迅速充盈扩张，且通常在0.5–1分钟内开始搏动。使用温盐水（35°C）湿润心脏。
6. 将胸壁复位至解剖位置，避免对吻合口造成扭曲或张力。使用6-0连续尼龙缝线缝合手术切口皮肤（图1E）。

4. 术后护理

1. 术后立即给予0.3 ml生理盐水腹腔内液体推注，以进行液体补充。
2. 随后皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg）和恩诺沙星（5 mg/kg），分别用于镇痛和预防感染。
3. 将动物置于加热灯下，直至从麻醉中苏醒并恢复胸卧位。在恢复期间，检查颈部以观察异体移植物的心跳颤动，确保移植物灌注充分。
4. 一旦动物清醒并处于卧位，将其放回单独的笼子（不与其他小鼠同笼），使其可自由进食和饮水。由于右前肢可能存在暂时性轻微活动受限，在笼底放置凝胶状食物来源。
5. 术后观察受体小鼠1小时，然后将其送回饲养设施，在术后最初24小时内自由进食饮水，并每日检查三次活动情况和营养摄入。监测小鼠疼痛和痛苦迹象，必要时在术后前72小时内每天两次皮下追加布托啡诺（0.1 mg/kg）。此后每日观察动物，并每周称重一次。
6. 若任何小鼠出现疼痛、痛苦或摄食减少的迹象，应咨询兽医工作人员。考虑提前实施安乐死（本方案中采用7分钟的CO₂过量暴露，随后进行颈椎脱位）。
7. 异体心脏停搏被定义为特定的实验终点，提示需对小鼠实施安乐死。

结果

同系C57BL/6移植实现了长期存活。从动物存活率及持续评估移植物存活能力的角度来看，同种异体移植物的设计（图1）被证明是成功的。这通过覆盖皮肤保持活力、移植物持续活跃的毛发生长，以及通过肉眼观察和手指触诊可检测到的心跳得到证实。图2展示了同系移植小鼠的存活数据。平均存活时间超过109天。根据存活数据可以合理推断，该移植技术的设计能够使整个胸壁、胸腺和心脏得到充分灌注。此外，同系动物实现长期存活的能力进一步表明，该小鼠模型不仅可行，而且具有可重复性。这一概念验证性的整块胸壁、胸腺和心脏移植验证了小鼠模型可用于研究联合实体器官与血管化复合组织同种异体移植。

图1. 术中照片。 (A) 胸壁、胸腺及心脏同种异体移植物已成功获取、修整并可视化 离体 从后方进行操作，保留双侧胸廓内血管。 （B）

讨论

异体移植免疫学研究涉及多种现象，包括但不限于急性与慢性排斥反应机制、直接与间接抗原提呈、受者致敏以及混合嵌合体的诱导¹⁹。动物模型已成为移植免疫学研究的金标准，其中小鼠模型因其成本低、可获得转基因和基因敲除小鼠、商业化单克隆抗体丰富、兽医护理和饲养要求相对较低以及实验可重复性强而被广泛应用。迄今为止，已有多种心脏移植模型被设计用于实体器官移植的研究^19,22-27。类似地，已有大量小鼠模型被开发用于血管化复合组织异体移植的研究²⁸。然而，针对实体器官与血管化复合组织联合移植的研究仍十分有限，相关技术在小鼠中尚未建立。本文所介绍的整块胸壁、胸腺与心脏联合移植小鼠模型，是一种可靠且可重复的研究实体器官与血管化复合组织联合移植效应及其免疫学机制的工具。

为了进一步推动移植领域的发展，必须探索通过新型治疗手段延长同种移植物存活时间并减少免疫抑制剂使用的前景。其中一种方法是诱导混合嵌合体状态（即供体造血细胞在受体体内部分植入），这种状态可导致无需使用免疫抑制剂的供体特异性耐受，即使在某些情况下嵌合状态未能长期维持。^2...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
欧洲柯林斯溶液			该溶液不通过商业途径购买，而是在实验室中自行配制。配制500 ml溶液时，将下述成分加入330 ml双蒸水中，充分混匀，然后补加170 ml双蒸水至终体积为500 ml。 成分：1.02 g KH2PO4、3.66 g K2HPO4、0.56 g KCl、0.42 g NaHCO3 和 17.52 g 葡萄糖。
缝合线	Ethilon	MWI 72667	6-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - 兽用耗材)
聚酰亚胺套管静脉导管（21G）	Vention Medical	141-0043	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
聚酰亚胺套管动脉导管（24G）	Vention Medical	141-0027	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
软头塑料导管	Terumo	SR*OX2419CA	24G x 3/4"
显微外科扩张器	S&T	D-5a.1	扩张器，11 cm，FH，0.1 mm AT10d