一种用于高密度培养多样化微生物群落的新型生物反应器

摘要

本文介绍了一种新型反应器设计，称为高密度生物反应器（HDBR），用于培养和研究高密度微生物群落。在此，HDBR成功应用于光生物反应器（PBR）构型，以研究混合高密度藻类群落的氮代谢过程。

摘要

本文介绍了一种新型反应器设计，称为高密度生物反应器（HDBR），用于培养和研究高密度的微生物群落。以往的研究已评估了该反应器在异养细菌和化能自养细菌作用下对化学需氧量（COD¹）和含氮物质^2-4的去除性能。HDBR 的设计无需额外的絮凝/沉降过程，同时仍可产生悬浮物含量较低的出水。在本研究中，HDBR 被用作光生物反应器（PBR），以表征基于藻类的光合微生物群落的脱氮特性。如先前对该 HDBR 设计的报道，反应器内形成了稳定的生物量区域，生物活性区与循环液之间界限清晰，从而实现了低悬浮固体的出水。在 HDBR 中的藻类群落被观察到可去除进水中 18.4% 的总氮物质。进水中 NH₄⁺ 和 NO₃^- 浓度的变化对 NH₄⁺ 的去除无显著影响（n=44，p=0.993 和 n=44，p=0.610，分别）；而进水中 NH₄⁺ 浓度与 NO₃^- 的去除呈负相关（n=44，p=0.000），NO₃^- 进水浓度则与 NO₃^- 的去除呈正相关（n=44，p=0.000）。在高 NH₄⁺ 负荷下，NH₄⁺ 的稳定去除以及氧化态氮物质的积累，表明该微生物群落中存在氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌。

引言

市政污水通常采用活性污泥法进行处理，以降低悬浮固体（SS）、生物需氧量（BOD）、有机和无机氮以及磷的含量^5,6。活性污泥法是一种二级污水处理方法，其过程包括在曝气池中对进入的污水与回流的异养微生物（通常称为活性污泥）形成的混合液进行有机碳的氧化反应^5-7。随后，该混合液进入一个相对较大的沉淀池（沉降池），在此污泥得以沉降，便于收集后处置或回流至曝气池，而澄清后的处理出水则可继续进行三级处理或消毒，之后排入受纳水体^5-7。在二沉池中实现处理出水与固体（污泥）的有效分离，对于污水处理系统的正常运行至关重要，因为任何随出水流出沉淀池的活性污泥都会导致出水中BOD和SS升高^5-8。

在废水二级处理中，存在多种可替代的生物处理工艺，这些工艺能够减少甚至消除对大型沉淀池的需求，包括附着生长（生物膜）反应器、膜生物反应器（MBRs）以及颗粒污泥反应器。在生物膜反应器中，微生物自然聚集并附着在固体表面形成生物膜，从而实现生物量的截留与积累，无需依赖沉淀池。生物膜反应器可分为三类：填充床反应器、流化床反应器和旋转生物接触器。填充床反应器（如滴滤池和生物塔）采用固定的固体生长表面^5,6。流化床反应器（FBRs）依赖微生物附着于颗粒物（如沙子、颗粒活性炭（GAC）或玻璃珠）表面，这些颗粒通过较高的上升流速保持悬浮状态^9,10。旋转生物反应器则利用固定在旋转轴上的介质表面形成的生物膜，使生物膜交替接触空气和待处理液体^5,6。膜生物反应器（MBRs）采用膜过滤装置，可置于生物反应器内部（浸没式构型）或通过循环设置于外部（侧流式构型）^5,11。膜的作用是实现生物量和固体颗粒与处理后液体的有效分离^11,12。颗粒污泥反应器为上流式反应器，当微生物暴露于较高的表观上向气流速度时，会形成极为致密且沉降性能良好的颗粒污泥¹³。

作为活性污泥法的另一种替代方案，Sales 和 Shieh（2006）设计并构建了一种新型上流式反应器系统，现称为高密度生物反应器（HDBR），用于研究在低 F/M 条件下活性污泥对合成废水中化学需氧量（COD）的去除，而低 F/M 条件已知会导致沉降性能差的污泥形成即，膨胀污泥）^1,7,14HDBR 系统采用改良的流化床反应器，通常由一个上流式反应器和一个外部循环罐组成。流化床反应器通常在循环流速足够高以保持生物膜生长基质悬浮、但又足够低以保留被生物膜覆盖的基质的条件下运行。与传统流化床反应器不同，Sales 和 Shieh（2006）所述的 HDBR 采用相对较低的循环流速，结合外部曝气，防止了反应器内形成的生物量区域受到扰动。¹后续研究表明，该反应器设计能够利用硝化/反硝化细菌有效处理多种氮通量。^3,4在所有研究中，HDBR 内稳定且致密的生物量区域的形成消除了对外部絮凝/沉降过程的需求^1-4.

正如我们在此报道的，HDBR 用于培养高密度藻类的可行性也已在光生物反应器（PBR）配置中进行了测试。我们讨论了这种新型反应器系统在藻类培养中的优势与局限性，及其在克服藻类生物燃料商业化过程中与生物量采收相关的主要障碍（即良好的固液分离i.e.，良好的固液分离^15,16）方面的潜力。以下方案概述了组装、启动、取样及维持以藻类为目标微生物群落的 HDBR 所需的步骤。同时也会提及异养型以及硝化/反硝化型菌群在启动和运行方案中的差异。最后，将重点阐述该新型反应器设计的总体优势、劣势以及尚不明确的问题。

方案

1. 反应器组装

1. 根据图1中的示意图布置反应器组件。
   1. 将反应器（R）放置在混匀平台上，并向反应器中加入搅拌子。将循环储液罐（RT）放置在搅拌平台和反应器旁边，使储液罐的出流口（顶部）朝向实验台边缘。
   2. 将废液容器（W）置于循环储液罐（RT）的出流口（顶部）正下方。将进料储液罐（FT）放置在循环储液罐（RT）旁边。
      注意：进料储液罐的总容量为 5 L。
2. 使用合适尺寸的支架和夹具固定反应器（R），防止其倾倒。同样，固定循环储液罐（RT），防止其移动。
3. 将氯丁橡胶蠕动泵管插入循环泵（Pump A）和进料泵（Pump B）的泵头中。有关泵管的其他规格，请参见材料表。使用泵驱动装置附带的螺丝将泵头安装到泵驱动装置上。
4. 将 Pump A 的泵管连接至反应器和循环储液罐的端口。将 Pump B 泵管的一端插入进料储液罐和循环储液罐中。使用泵管将反应器顶部端口与循环储液罐连接。在反应器端口处的泵管上安装夹具。
   注意：光合微生物群落可能受益于灯具提供的人工光照。

2. 储备液、进水/培养液和藻类接种物的制备

1. 配制矿物储备液。向一个1 L的容量瓶中加入500 ml去离子水，然后依次加入以下成分：200 g碳酸氢钠、40 g一碱式磷酸钾、4 g硫酸镁、4 g氯化铁、4 g氯化钙、1 g氯化铜、1 g六水合氯化钴、1 g六水合氯化镍、1 g七水合硫酸锌。再加入400 ml去离子水。用力振荡以促进盐类溶解。待盐类完全溶解后，用去离子水定容至1 L。
2. 配制氨储备液。在1 L容量瓶中，将38.214 g氯化铵溶解于约900 ml去离子水中。溶解后，用去离子水定容至1,000 ml。
   注：1 ml储备液稀释至1 L后，可得到10 mg L^-1 NH₄⁺-N溶液。
3. 配制硝酸盐储备液。在1 L容量瓶中，将72.413 g硝酸钾溶解于约900 ml去离子水中。溶解后，用去离子水定容至1,000 ml。
   注：1 ml储备液稀释至1 L后，可得到10 mg L^-1 NO₃^--N溶液。
4. 配制进料/进水溶液。为配制含有20 mg L^-1 NH₄⁺-N和20 mg L^-1 NO₃^--N的进料溶液，取2 ml氨储备液和2 ml硝酸盐储备液，用去离子水稀释至总体积1 L。在稀释前，每升待配溶液中加入0.5 ml矿物储备液。启动反应器时，共需配制5 L进水溶液。
5. 制备藻类接种物。
   1. 从含有藻类的水体（如溪流或池塘）中采集大量水样（至少10 L）。将水样静置24小时，使藻类自然沉降。
   2. 倾去并弃除上层澄清（不含藻类）的水，保留样品瓶中的浓缩藻类悬液。将所有样品中的藻类悬液合并至一个容器中，并重复沉降和倾析步骤。
   3. 测定浓缩样品中的生物量。
      1. 将一张纸制真空滤膜（0.45 µm MCE真空滤膜）和一个铝制称量舟在103 °C的烘箱中过夜干燥。冷却30分钟（室温下置于干燥器中）后，称量滤膜与称量舟的总质量。
      2. 用真空抽滤装置过滤20 ml浓缩藻类悬液，然后将滤膜和称量舟放回烘箱中过夜干燥。
      3. 再次称量滤膜与称量舟的总质量，计算浓缩样品中的生物量密度。
         注：研究人员所需采集的水样总体积取决于水源水体的具体情况。

3. 接种与启动反应器

1. 向反应器中加入 750 ml 培养液。用 500 ml 培养液填充循环罐。
2. 使用长移液管将含有 1.5 g 藻类的接种悬浮液轻轻加入反应器底部附近。让接种物沉降到反应器底部，并通过目视观察确认沉降完成，然后再进行下一步操作。
3. 待细胞沉降后，移除管夹并启动泵 A，设置为低流速（10 转 min^-1/38 ml min^-1）。管路中截留的空气将被排入反应器。
   注意：向反应器中加入 750 ml 培养液可防止泵运行时扰动的生物量离开反应器。挤压管路以确保所有空气均已排出。
4. 随着溶液被泵入反应器，逐渐向循环罐中补充培养液。持续添加，直至反应器和循环罐均达到满载状态，出流液开始从循环罐顶部端口溢出。
   注意：需加入循环罐的培养液体积会因加入反应器的接种物体积不同而有所变化。
5. 将剩余的培养液倒入进料罐中。
6. 将循环泵（泵 A）设置为 19 转 min^-1，建立 72.5 ml min^-1 的循环流速。观察藻类开始从反应器底部上浮。利用反应器上的刻度标记确定藻类生物量区域的高度。在进入下一步前，确保该高度保持稳定。
7. 以极低速度启动搅拌板；初始设置为 1 或 2 较为合适。搅拌棒有助于进一步提升生物量，但剧烈搅拌会导致藻类离开反应器，进入循环罐，并随出流液流失。调节搅拌速度，使反应器内形成清晰的藻类界面（图 2A）；藻类生物量区高度应约为 10–15 cm。
8. 在观察到藻团与反应器液体之间形成清晰界面后，启动进料泵。将泵速设为 25 转 min^-1，建立 1.5 ml min^-1 的流速。观察反应器液体因重力作用及进水水流的置换作用从出流口排出。

4. 样本采集与分析

1. 在对反应器系统进行维护之前，先完成样品采集工作。每天采集20 ml的出水和进水样品。出水样品从循环储罐内采集，进水样品直接从进料储罐中采集。
2. 在储存和分析前，对样品进行真空过滤以去除悬浮固体。
3. 将进水和出水样品储存在-20 °C条件下，直至进一步分析。尽量减少样品经历的冻融循环次数。如需要，可将样品分装成若干等份，以保持样品完整性。
4. 采用标准方法对硝酸盐、亚硝酸盐和氨进行样品分析¹⁷。
   注意：作者采用离子色谱法（IC）获得本文所示结果。具体参数请参见材料表。

结果

在进水总氮含量保持为40 mg–N L^-1的条件下，利用HDBR培养藻类，并考察了不同进水氨氮与硝酸盐浓度比例的影响。每天采集进水和出水样品；在每种工况开始和结束时采集生物量密度样品。反应器在工况改变后平均需要3–5天达到稳态平衡。在广泛的进水条件下，均形成了明显的生物量区域，这与先前研究中观察到的现象一致（图2）。研究发现，HDBR中的藻类培养物平均去除了进水中18.4%的总氮物种（n=44）。在生物量区域内，整个研究过程中总藻类生物量和生物量密度保持稳定。

NH₄⁺ 和 NO₃^- 的去除率分别与 NH₄⁺ 和 NO₃^- 的进料组成的关系如图3所示。采用简单的线性回归模型评估氮物种去除率与进料组成之间关系的显著性^18-20。在所有测试的 NH₄⁺ 和 N...

讨论

本部分将首先讨论为应对可能的操作问题以及使用不同微生物群落时所需的方案变异。将探讨该反应器设计的优势，包括能够调控氧气通量以及在反应器内形成高密度絮体的能力。同时也会提及当前面临的挑战及可能的研究方向。

操作方案的细微差别与变体
使用 HDBR 培养不同类型的培养物时，需根据所研究的物种对操作方案进行轻微调整。必须充分混合并扩展藻类生物量区，以增加所有絮体对光的暴露，促进光合作用。反应器内藻类生物量的悬浮状态由反应器循环速率和搅拌棒转速共同驱动。在选择这两项操作参数时应谨慎，确保生物活性藻类生物量区与反应器顶部端口之间保持足够的距离，因为任何离开反应器容器的生物量都可能通过循环罐顶部端口随出水流失。若观察到生物量随出水排出，可在循环罐的顶部端口加装过滤器。可使用一团玻璃棉作为过滤器。随着过滤器上生物量的积累，需定期更换。若使用过滤器，则除在循环罐内采集反应器液体样品外，还必须在过滤器下游采集悬浮固体样品，以获得准确的质量平衡；过滤器中积累的生物量也必须计入。在某些操作条件下，即使藻类和酵母群落处于健康状态，生物量区并不总是导致液体澄清。在这些情况下，可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
曝气石	Alita	AS-3015C
曝气器	Top Fin	Air-1000
氯化铵	Sigma Aldrich	A9434
阴离子分析柱	Shodex	IC SI-52 4E
烧杯（600 ml）	Corning Pyrex	1000-600	用作混合容器（MV）。在底部和500 ml刻度处安装接头。接头外径为3/8"。
氯化钙	Sigma Aldrich	C5670
阳离子分析柱	Shodex	IC YS-50
六水合氯化钴	Sigma Aldrich	C8661
氯化铜	Sigma Aldrich	222011
氯化铁	Sigma Aldrich	157740
滤器（真空式）	Fisherbrand	09-719-2E	0.45 μm 膜滤器，MCE材质，直径47 mm
量筒（1,000 ml）	Corning Pyrex	3025-1L	用作反应容器（R）。在底部、500 ml和1 L刻度处安装接头。接头外径为3/8"。
HPLC/IC	Shimadzu	Prominence
硫酸镁	Sigma Aldrich	M2643
Masterflex L/S 可调速驱动器	Masterflex	07553-50	用于循环泵和进料泵的驱动器（需2台）
六水合氯化镍	Sigma Aldrich	N6136
硝酸钾	Sigma Aldrich	P8291
磷酸二氢钾	Sigma Aldrich	P5655
泵头	Masterflex	07018-20	循环泵泵头
泵头	Masterflex	07013-20	进料泵泵头
泵管	Masterflex	6404-18	循环泵泵管
泵管	Masterflex	6404-13	进料泵泵管
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S5761
七水合硫酸锌	Sigma Aldrich	Z0251