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方法文章

空气采样滤膜中内毒素与DNA含量的分析

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⸱

DOI：

10.3791/53444

⸱

2016年3月7日

 ,  ,  , 
1Department of Earth and Planetary Sciences, Weizmann Institute of Science, 2Multiphase Chemistry Department, Max Planck Institute

本文内容

摘要

本文描述了对采样滤膜中大气生物颗粒物的两种互补分析方法：内毒素的提取与检测，以及DNA的提取与检测。

摘要

室外气溶胶研究通常使用滤膜采集的颗粒物。该方法可对采集到的颗粒物进行多种并行表征。本文所述方法的目的是对从滤膜提取的生物气溶胶中的内毒素和DNA含量进行高精度、高可靠性的分析。从采样滤膜中提取高分子量有机分子（如脂多糖）的过程包括将样品在无热原的水基介质中振荡。后续分析基于可利用浊度测定法检测的酶促反应。由于采样滤膜上有机物含量较高，样品中DNA的提取采用一种最初为土壤设计并经改进以提高DNA得率的商业DNA提取试剂盒。文中描述了利用定量聚合酶链式反应（q-PCR）分析检测和定量特定微生物种类的方法，并将其与其他可用方法进行了比较。

引言

使用滤膜进行空气采样是大气气溶胶研究的基本工具。1 采集的滤膜是开展所收集环境颗粒物多种化学、物理及生物表征的起点。2-11 这种方法的优势在于，可对同一样品进行多种离线分析。整合所有不同分析的数据，有助于研究人员充分了解所采集颗粒物的特性，并推动解决大气科学中的复杂问题。12,13 例如，可对同一时期采集的海洋和内陆空气样本在颗粒物毒性及生物组成方面进行比较。14 本研究从近岸及内陆采样点采集的滤膜中提取了革兰氏阴性菌细胞壁组分脂多糖（LPS）（亦称内毒素），并采用鲎试剂变形细胞溶解物（LAL）检测法进行评估。同时，利用定量聚合酶链式反应（q-PCR）对同一样品中的细菌组分（总细菌、革兰氏阴性菌及蓝藻）进行基因组分析。LAL检测法基于向样品中加入美洲鲎变形细胞的水提取物后所形成的浊度进行测定。 Limulus polyphemus，加入含有内毒素的水溶液中。样品中内毒素浓度越高，浊度发展越快。15 q-PCR 分析基于在特异性 DNA 片段扩增过程中发出的荧光信号。16 通过在PCR反应指数扩增阶段实时监测信号，并利用标准曲线进行校准，可定量初始DNA含量。结合其他分析方法（详见 elsewhere）的这两种分析14 可以较好地估计样本中内毒素的水平及来源细菌的数量。

本文所述方法的目的是对从滤膜中提取的生物气溶胶中的内毒素和DNA含量进行高度准确且可靠的分析。尽管气溶胶的物理和无机化学特性采样方法已广为人知，近年来也已发展出用于研究其有机成分的方法17，但针对气溶胶中生物组分的研究仍十分有限18。本方法的提出旨在弥补这一空白，详细阐述一种用于提取、分析和鉴定空气中气溶胶生物组分的可靠技术14。

本文所述方法预计将在涉及滤膜分析的室内外生物气溶胶研究项目中得到广泛应用。20-24

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方案

注意：本实验方案中使用的所有材料和仪器的详细列表见材料部分。

1. 滤膜上的空气采样

  1. 滤膜的制备
    1. 对于高体积采样，使用 20.3 x 25.4 cm2 的滤膜。根据研究需求选择最适合的滤膜类型以及（如适用）滤膜的截留粒径1。此处使用石英微纤维滤膜。
    2. 对用于有机物和生物化合物采样的滤膜进行预烘烤，以去除有机残留物。预烘烤时，将滤膜 individually 用铝箔包裹，然后在实验室马弗炉中于 450 °C 下烘烤至少 5 小时。
    3. 将烘烤后的滤膜储存于 -20 °C，直至开始采样。
  2. 仪器操作与空气采样
    1. 清除高体积采样器头部的残留灰尘。用洁净的纸巾擦拭各部件，并在重新连接至采样器前使其自然晾干。
    2. 用乙醇对滤膜盒进行消毒，并始终佩戴手套和实验服操作。
    3. 将预烘烤过的滤膜放入洁净的滤膜盒中，并按照高体积采样器的操作手册进行后续操作。
    4. 在铝箔上标记采样日期及任何异常天气状况（例如 降雨、沙尘暴），并将铝箔保存在洁净处，直至采样结束。
    5. 采集完成后取出滤膜，将采样面向内对折。
    6. 用原始铝箔包裹滤膜，并于 -20 °C 保存至分析前。
      注意：若采样与分析之间的时间间隔超过 2 个月，应将样品储存在 -80 °C，以避免有机物和生物材料降解。

2. 内毒素分析

注意：使用70%乙醇对工作台面进行消毒，并仅使用无热原的离心管、枪头和试剂。若使用玻璃器皿，需在250 °C预加热30分钟，或在200 °C加热60分钟25。所有试剂均需在II级生物安全柜中配制，并始终佩戴手套和实验服进行操作。

  1. 试剂准备
    1. 按照鲎试剂（LAL）试剂盒生产商的说明书，在使用前短时间内重新溶解冻干粉。26 轻轻敲击小瓶，使附着在瓶壁上的鲎试剂脱落。轻轻提起瓶塞以打破真空。使用带针头的注射器，向瓶中加入5 ml无热原水（PFW），以完全溶解瓶内所有鲎试剂内容物，并轻轻混匀以避免产生泡沫。
    2. 不使用时，用塑料石蜡膜密封小瓶，并在4 °C下保存最多两天。剩余未使用的鲎试剂可在-20 °C下保存最多三个月。
      注意：该试剂仅可冷冻一次。
    3. 根据生产商说明书，对含有0.5 µg E. coli 的对照标准内毒素（CSE）进行重溶。27 通过访问生产商网站28，输入试剂盒包装上标明的批号，查询CSE小瓶所需加入的准确水量。小瓶中E. coli的最终浓度以内毒素单位（EU）表示（其中10 EU = 1 ng）。将此小瓶标记为Ed0。
    4. 不使用时，用塑料石蜡膜密封CSE小瓶，并在4 °C下保存最多4周。
  2. 标准曲线与加标滤膜的制备
    1. 在II级生物安全柜中，准备22个无热原的2 ml离心管，分别加入递减量的CSE（管Ed1–Ed11）或不加CSE（仅含PFW的空白管），以制备重复的内毒素梯度稀释系列，如表1所示。
    2. 在具有环形气流的生物安全柜中，使用已消毒的直径为1.12 cm的打孔器，从洁净且预先烘烤过的滤膜上切割出22个圆形滤膜片。
    3. 将成对的滤膜放入无菌培养皿中。
    4. 从内毒素稀释系列Ed2–Ed11及空白管中各取50 µl，分别滴加到对应的滤膜对上。
    5. 将含有加标滤膜的培养皿在生物安全柜中敞口放置，干燥30分钟。
    6. 将每片滤膜放入一个无热原的2 ml离心管中。
试管最终内毒素浓度 (EU ml-1)标准内毒素体积 (ml)无热原水体积 (ml)总体积 (ml)
Ed02,500stock solution*5
Ed11,00080 (来自 Ed0)120200
Ed210020 (来自 Ed1)180200
Ed35010 (来自 Ed1)190200
Ed4255 (来自 Ed1)195200
Ed512.52.5 (来自 Ed1)197.5200
Ed66.251.25 (来自 Ed1)198.75200
Ed73.1256.25 (来自 Ed2)193.75200
Ed81.5636.25 (来自 Ed3)193.75200
Ed90.7816.25 (来自 Ed4)193.75200
Ed100.3916.25 (来自 Ed5)193.75200
Ed110.1956.25 (来自 Ed6)193.75200
空白00200200
* 按照生产商说明书配制储备液。

表1：内毒素标准曲线。 针对标准曲线中的每个稀释管，列出了内毒素浓度、需加入的标准内毒素体积和无热原水体积，以及最终获得的总体积。

  1. 从实验用滤膜及加标滤膜中提取内毒素
    1. 在具有环形气流的生物安全柜中，使用已消毒的直径为1.12 cm的打孔器将样本滤膜（来自步骤1.2）切割成圆形小片，并与加标标准滤膜（来自步骤2.2）一同置于无热原的2 ml离心管中即， 样品管）
    2. 向试管中加入1 ml PFW，使用实验室摇床在室温下振荡60 min。
    3. 将样品管在微量离心机中以375 × g离心10分钟。29
    4. 将含有内毒素的上清液转移至新的无热原2 ml离心管中。
  2. 鲎试剂（LAL）检测
    1. 在无热原的平底带盖96孔微孔板中进行鲎试剂（LAL）试验，测定样品中的内毒素浓度。
    2. 提前规划好孔板排列方式，如图所示 图1每次运行的酶标板中均需包含由内毒素标准溶液Ed2-Ed11直接配制的标准曲线（浓度范围为100-0.195 EU/ml，参见第2.2节）。标准曲线应占据酶标板A行和B行的第1至第10号孔。将这两行的第11和第12号孔预留作为空白样品孔（共四个空白孔）。
    3. 打开酶标仪，并设置为动力学反应程序，包括在微孔板孵育期间的监测 37 °C 每5分钟振荡一次，随后在405 nm处测定吸光度，共重复18次，持续1.5小时。
    4. 确定从样品滤膜中提取内毒素的效率（即通过将计算得到的内毒素量除以初始添加的内毒素量，计算加标标准滤膜所获样品的回收率。
    5. 开始实验，将 50 µl 标准内毒素溶液（来自步骤2.4.2）、加标滤膜提取液及其空白对照（来自第2.3节）或实验样品及其空白对照（同样来自第2.3节）的测定，按照预定的微孔板排列方案进行图1）并盖上盖子。
    6. 向每个孔中快速加入 50 µl 加入LAL溶液后，将酶标板置于桌面上，轻轻水平振荡，然后放入酶标仪中读数。
    7. 将培养板放入酶标仪中，启动实验运行。

微量滴定板布局图；标准曲线、待测样品、加标和空白对照。
图1：内毒素检测阵列板。 96孔微量滴定板中内毒素分析阵列的一个示例。

3. 基因组分析

注意：进行DNA提取时，需使用70%乙醇对工作台面进行消毒，并仅使用无菌离心管、枪头和试剂。进行DNA的q-PCR分析时，需使用表面DNA去污染剂对工作台面进行消毒。所有试剂均应在II级生物安全柜中配制，并始终佩戴手套和实验服操作。

  1. DNA引物和探针的制备
    1. 在DNA提取之前，可选择订购 commercially-available 的引物和探针（若采用水解探针法），或使用引物设计的计算工具设计新的一套引物和探针。30
    2. 根据制造商的说明，使用10 mM Tris-0.1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）（TE缓冲液）或PCR级水重新溶解引物。
      注意：建议将初始的PCR引物储备液溶解于低EDTA（0.1%）的TE缓冲液中，以防止长期保存时引物降解。后续稀释应使用PCR级水，以减少可能抑制PCR反应的EDTA含量。
    3. 制备分装样品 50 µl 或 100 µl 引物和探针置于无菌的0.5 ml离心管中，于-20 °C保存20 °C 直至分析前
  2. DNA提取前的标准细胞浓度评估
    1. 在适当大小的离心管中，制备目标微生物物种的标准细胞溶液（管 Od0， 表 2A用小口径移液器在管中上下吹打细胞悬液7-10次，混匀。
    2. 如果细胞有颜色（例如 某些真菌孢子）无需进行染色处理。若需要对细胞进行染色，可将细胞悬液用适当的染料稀释，以便在显微镜下检测目标细胞。31
    3. 用乙醇清洁盖玻片和血细胞计数板。润湿盖玻片并将其固定到血细胞计数板上。
    4. 加载约 8 µl 用移液枪尖小心接触盖玻片边缘，通过毛细作用将细胞悬液加入血细胞计数板的两个计数室中。切勿过度或不足填充计数室。
    5. 在400倍放大倍数（物镜40倍，目镜10倍）下通过显微镜观察，确定细胞数量。九个边长为1 mm的方格2 并排列成3×3的网格，应能看到网格结构。将显微镜聚焦于网格四个角之一的方格上（可使用较高倍数的放大倍率）。1×1 mm2 正方形应包含16个较小的正方形。
    6. 计数四个 1 x 1 mm 区域内的所有细胞2 角上的方格以及 3 x 3 网格中央的方格。如果细胞数量过多或过少难以计数，应重复操作，根据需要适当浓缩或稀释原始细胞悬液（每个 1 mm 单一方格应覆盖 15–50 个细胞）2 区域）。
    7. 计算细胞浓度（细胞数/ml）-1) 根据五个计数方格中细胞数量的平均值，计算标准细胞悬液 Od0 的每毫升细胞数如下：细胞数 ml-1 平均细胞计数方格-1 稀释倍数 104.
  3. DNA提取效率的评估
    1. 根据以下步骤准备九个无菌的 0.5 ml 离心管 表 2A.
    2. 将标准细胞溶液（Od0）稀释至浓度约为107 细胞/毫升-1 在总体积为 20 µl (Od1)
    3. 添加 18 µl 向试管 Od2-Od8 中加入无菌无核酸酶的 PCR 级水（NFW） 20 µl 到空白试管，Od9。
    4. 转移 2 µl 将细胞悬液从Od1转移至Od2。轻轻吹打混匀并转移 2 µl 从Od2管到Od3管。以相同方式继续在各管中依次稀释细胞，直至并包括Od8管，以获得10倍梯度稀释7-100 细胞/毫升-1.
    5. 在具有环形气流的生物安全柜中，使用已消毒的直径为1.12 cm的打孔器，从洁净且预先烘烤过的滤纸上切割出18个圆形滤纸片。将滤纸片成对放置于无菌培养皿中。
    6. 刺突蛋白 10 µl 从稀释液 Od1 至 Od8 以及空白管 Od9 中分别向每对滤膜上加样，使每一对滤膜对应一个标准细胞浓度。
    7. 将培养皿在超净台内敞口放置，晾干30分钟。
    8. 将每个滤膜小片放入无菌的螺旋盖2 ml离心管中，并按照第3.4节所述步骤提取DNA。
  4. 实验滤膜与加标滤膜的DNA提取
    注意：从滤膜中提取DNA时，应使用专为土壤DNA提取设计的商业试剂盒，并按照生产商提供的方案进行操作，但需做以下修改。
    1. 为每个滤膜样品（Od1-Od8），在一支0.5 ml无菌离心管中加入经酸洗处理的玻璃珠混合物。使用直径为425-600 µm 和直径≤0.3 g的珠子106 µm.
    2. 在具有环形气流的生物安全柜中，使用已消毒的直径为1.12 cm的打孔器，从每个滤膜样品的随机位置切取三个圆形小片，并将其放入带螺口盖的2 ml离心管中。
    3. 将玻璃珠混合物加入试管中。
    4. 在生物安全柜中，向每支试管加入提取试剂盒提供的细胞裂解缓冲液，体积按照生产商说明书中的指示量添加。
    5. 准备一桶冰，使用珠磨机对细胞进行机械破碎。
    6. 将珠子振荡1分钟，然后置于冰上1分钟。重复五次。
    7. 按照试剂盒供应商提供的方案，从裂解后的步骤开始操作。
    8. 使用提供的洗脱缓冲液（含10 mM Tris缓冲液）或无核酸酶水洗脱后，将洗脱液重新加载到柱子中再次过柱，以提高DNA得率。
      注意：若未在DNA提取当天进行分析，样品可保存于-20 °C 直至分析前。
A- 标准细胞稀释系列的制备
试管最终细胞浓度（细胞 ml-1）标准细胞体积（ml）无核酸酶水体积（ml）总体积（ml）
Od0使用血细胞计数板确定
Od1应稀释至 107 细胞 ml-1 范围20
Od210-1 Od12 份 Od11820
Od310-2 Od12 份 Od21820
Od410-3 Od12 份 Od31820
Od510-4 Od12 份 Od41820
Od610-5 Od12 份 Od51820
Od710-6 Od12 份 Od61820
Od810-7 Od12 份 Od71820
空白002020
B- DNA 标准曲线的制备
试管最终 DNA 浓度（mg ml-1）标准 DNA 体积（ml）无核酸酶水体积（ml）总体积（ml）
Dd0使用 NanoDrop 测定
Dd1应稀释至 101 mg ml-1 范围20
Dd210-1 Dd12 份 Dd11820
Dd310-2 Dd12 份 Dd21820
Dd410-3 Dd12 份 Dd31820
Dd510-4 Dd12 份 Dd41820
Dd610-5 Dd12 份 Dd51820
Dd710-6 Dd12 份 Dd61820
Dd810-7 Dd12 份 Dd71820
空白002020

表2：DNA标准曲线。 标准微生物细胞稀释系列（A），列出了各稀释管中标准细胞体积、无核酸酶水（NFW）体积及总体积的详细信息。DNA标准曲线制备（B），列出了各稀释管中标准DNA体积、无核酸酶水（NFW）体积及总体积的详细信息。

  1. DNA标准曲线制备
    1. 使用与步骤3.4中实验滤膜相同的方法，直接从目标微生物的标准样品（Dd0）中提取DNA。
    2. 使用分光光度计在260 nm处测定标准DNA样品（Dd0）的DNA浓度。
    3. 准备九个无菌的0.5 ml离心管，用于制备DNA标准曲线，具体如表2B所示。
    4. 如有必要，将标准DNA溶液Dd0用NFW稀释至浓度范围为1–10 µg ml-1，加入第一管（Dd1）中，总体积为20 µl。
    5. 向Dd2–Dd8管中各加入18 µl NFW，向空白管中加入20 µl NFW。
    6. 从Dd1中转移2 µl标准DNA溶液至Dd2中，轻轻吹打混匀，然后从Dd2中转移2 µl至Dd3。以此方式依次进行稀释，使Dd2–Dd8各管形成100–10-7的系列稀释液，并设一仅含NFW的空白对照管。
      注意：若未在提取当天进行分析，需将样品储存于-20 °C直至分析。
  2. 定量PCR分析
    1. 提前开启q-PCR仪器，使其预热。
    2. 在新的程序文件中，根据表3中的详细信息，在仪器操作软件中输入q-PCR运行参数。
      注意：不同仪器在每个热循环步骤中的最佳时间可能不同，具体参数请参考仪器说明书。
    3. 使用表面DNA去污染剂对工作台面进行消毒，并仅使用无菌离心管、枪头和试剂进行操作。
    4. 在工作台旁准备一桶冰，将Taq聚合酶混合液置于冰上保存。
    5. 计算q-PCR板中将占用的反应孔总数。理论上额外预留5%的反应量，将增加后的反应数乘以每反应体积，计算出总反应体积。
    6. 从NFW、引物、探针，最后到Taq聚合酶混合液的顺序，配制反应混合液池。反应混合液配制体积示例见表4。
    7. 将反应混合液避光并置于冰上保存，直至使用。
    8. 在q-PCR微孔板的各孔中，分别加入1 µl标准DNA、样品DNA或NFW（作为阴性对照），每个样本设三个重复孔。
    9. 确保将板置于板架中，避免其接触工作台面，以保持清洁。
    10. 向每个反应孔中加入9 µl反应混合液（表4）。
    11. 用光学粘性封膜覆盖板，并从四周紧密密封。
    12. 将板放入带有板架的离心机中，在1,000 × g下离心1分钟，然后放入q-PCR仪中。
    13. 将板放入仪器中，并启动运行程序。
参数详细信息备注
检测方法 定量水解探针
热循环条件 
初始变性与酶活化 95 °C 下 10 分钟
变性 95 °C 下 15 秒重复 45 次
退火与延伸60 °C 下 60 秒
板阵列
标准曲线Dd1 - Dd8每个稀释度在顶部 3 行的第 1–8 孔中重复 3 次
无模板对照（NTC）无核酸酶水（NFW）在顶部 3 行的第 9th 孔中重复 3 次
待分析样品从滤膜提取的 DNA每个样品在其余孔中重复 3 次
引物组每孔一个
样品体积10 ml

表3：q-PCR操作软件的设置详情。 需输入至q-PCR程序文件中的分析参数详情。

试剂每反应体积 (ml)反应数误差余量 (5%)总混合液体积 (ml)
Taq 聚合酶混合液55052.5262.5
F 引物 (10 mM)0.55052.526.25
R 引物 (10 mM)0.55052.526.25
无核酸酶水35052.5157.5
DNA — 1 ml 将直接加入 96 孔板中的目标孔内。

表4：定量PCR反应体系配制计算。 列出了每个反应的体积、反应数量、误差余量以及每种试剂需加入反应体系的总体积。

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结果

通常使用对采样滤膜的“离线”分析来研究大气气溶胶（见图2）。32 对采样物质的化学分析包括有机成分（例如 蛋白质、碳氢化合物分子、糖类）和无机成分（例如 金属、盐类）。生物学分析包括可存活与不可存活微生物的含量、利用DNA方法或显微镜进行物种鉴定，以及基于DNA的定量分析。

颗粒物分析；提取示意图；滤膜、离子、内毒素、DNA 检测流程。
图 2：滤膜样品分析流程图。 空气采样后的滤膜（A），滤膜的制备以用于后续分析...

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讨论

本研究描述了从滤膜上采集的气溶胶样品中提取和检测内毒素及DNA以进行定量的实验方法。这些方法需要精确的操作流程，只要实验人员遵循本文所述的若干关键且重要的要点，即可轻松完成。

在内毒素检测步骤中，需注意裂解液黏度较高，移液时容易产生气泡。这些气泡难以去除，并会导致酶标仪读数发生变化。因此，应先将样品加入到微孔板中，待确认所有气泡完全消失后，再继续加入裂解液。为减少此步骤中气泡的形成，建议使用移液器时动作缓慢，在将裂解液排入微孔时不要完全压下移液器按钮。由于裂解液一旦加入内毒素提取物中反应即刻开始，因此必须尽快启动读数程序。为缩短裂解液添加时间，可使用多通道移液器。请注意，某些试剂盒和实验方案中，在样品加入微孔板后，还需在37 °C下预孵育10分钟29，之后才能加入裂解液。

环境样品中内毒素提取的一个重要问题是样品中可能存在抑制物例如 在高污染空气样本中，稀释变得至关重要，可防止未稀释样本中通常出现的假性增强现象。38

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢魏茨曼科学研究所化学系的 Yoav Barak 博士提供的支持与建议。本研究由以色列科学基金会（资助号 #913/12）以及由德国联邦教育与研究部提供资金的明娜瓦基金会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
滤膜采样
HiVol 3000 - 高流量空气采样器Ecotech
石英微纤维滤膜Whatman1851-865203 mm × 254 mm
ELF - 实验室高温炉CarboliteELF 11系列
铝箔Opal
名称公司目录编号备注
内毒素
乙醇Sigma Aldrich16368 实验室试剂，96%
Airstream Class II 生物安全柜 AC-4E1ESCO10011712
Pyrotell-TAssociates of Cape Cod, Inc.T0051
标准内毒素对照品Associates of Cape Cod, Inc.E0005-1Escherichia coli O113:H10，0.5 µg/瓶，1 包
LAL 试剂用水Associates of Cape Cod, Inc.W0051
10 ml 无菌注射器，带鲁尔锁接头Becton-Dickinson & Co.309605
BD Precisionglide 注射器针头Becton-Dickinson & Co.305129无菌 
Parafilm-M 封口膜ParafilmP7543Sigma 目录编号
微量离心管AxigenMCT-200-C2 ml，无热原
1.12 cm 直径打孔器Boekel Scientific1601 BD 系列 - 钢制打孔器套装的一部分，包含多种直径的打孔器。 
50 mm 培养皿Miniplast Ein-Shemer72050-01无菌
Vortex Genie 2 Scientific Industries, inc.SI-0297
微型离心机 5415 DEppendorf22621408
TC MicroWell 96 F SI 带盖板Nunc167008平底孔（带盖，单独包装），无菌，无热原
Synergy HT 多功能微孔板读板仪Biotek7091000
名称公司目录编号备注
DNA
DNA awaySigma Aldrich7010
目标微生物物种的标准 DNAATCC 或其他菌种保藏中心用于 DNA 提取的相应微生物菌株或已提取的 DNA
改进型 Neubauer 计数板Marienfeld640030血细胞计数板
TE 缓冲液，低 EDTALife Technologies12090-01510 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA 
无核酸酶 PCR 级水 Sigma Aldrich3315959001
PCR 引物Sigma Aldrich靶向目标微生物物种
双标记探针Sigma Aldrich靶向目标微生物物种
螺口管AxigenST-200-SS2 ml 
PowerSoil DNA 提取试剂盒 Mo Bio Laboratories12888-100
玻璃珠，酸洗处理，425–600 µmSigma AldrichG8772-100G
玻璃珠，酸洗处理，<106 µmSigma AldrichG4649-100G
PowerSoil Solution C1Mo Bio Laboratories12888-100-1细胞裂解缓冲液，PowerSoil 试剂盒组分
Magic Touch 冰桶Bel-Art18848-4001
Mini-Beadbeater-16BioSpec607EUR
StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统Applied Biosystems4376600
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385612
TaqMan 基因表达 Master MixApplied Biosystems4370048
MicroAmp 快速光学 96 孔反应板（带条形码，0.1 ml）Applied Biosystems4346906
MicroAmp 防溅 96 孔底座Applied Biosystems4312063
MicroAmp 光学粘性封膜Applied Biosystems4311971
离心机 5810 REppendorf5811 000.010配备 MTP 桶的 A-4-62 转子 

参考文献

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