空气采样滤膜中内毒素与DNA含量的分析

摘要

本文描述了对采样滤膜中大气生物颗粒物的两种互补分析方法：内毒素的提取与检测，以及DNA的提取与检测。

摘要

室外气溶胶研究通常使用滤膜采集的颗粒物。该方法可对采集到的颗粒物进行多种并行表征。本文所述方法的目的是对从滤膜提取的生物气溶胶中的内毒素和DNA含量进行高精度、高可靠性的分析。从采样滤膜中提取高分子量有机分子（如脂多糖）的过程包括将样品在无热原的水基介质中振荡。后续分析基于可利用浊度测定法检测的酶促反应。由于采样滤膜上有机物含量较高，样品中DNA的提取采用一种最初为土壤设计并经改进以提高DNA得率的商业DNA提取试剂盒。文中描述了利用定量聚合酶链式反应（q-PCR）分析检测和定量特定微生物种类的方法，并将其与其他可用方法进行了比较。

引言

使用滤膜进行空气采样是大气气溶胶研究的基本工具。¹ 采集的滤膜是开展所收集环境颗粒物多种化学、物理及生物表征的起点。^2-11 这种方法的优势在于，可对同一样品进行多种离线分析。整合所有不同分析的数据，有助于研究人员充分了解所采集颗粒物的特性，并推动解决大气科学中的复杂问题。^12,13 例如，可对同一时期采集的海洋和内陆空气样本在颗粒物毒性及生物组成方面进行比较。¹⁴ 本研究从近岸及内陆采样点采集的滤膜中提取了革兰氏阴性菌细胞壁组分脂多糖（LPS）（亦称内毒素），并采用鲎试剂变形细胞溶解物（LAL）检测法进行评估。同时，利用定量聚合酶链式反应（q-PCR）对同一样品中的细菌组分（总细菌、革兰氏阴性菌及蓝藻）进行基因组分析。LAL检测法基于向样品中加入美洲鲎变形细胞的水提取物后所形成的浊度进行测定。 Limulus polyphemus，加入含有内毒素的水溶液中。样品中内毒素浓度越高，浊度发展越快。¹⁵ q-PCR 分析基于在特异性 DNA 片段扩增过程中发出的荧光信号。¹⁶ 通过在PCR反应指数扩增阶段实时监测信号，并利用标准曲线进行校准，可定量初始DNA含量。结合其他分析方法（详见 elsewhere）的这两种分析¹⁴ 可以较好地估计样本中内毒素的水平及来源细菌的数量。

本文所述方法的目的是对从滤膜中提取的....

方案

注意：本实验方案中使用的所有材料和仪器的详细列表见材料部分。

1. 滤膜上的空气采样

1. 滤膜的制备
   1. 对于高体积采样，使用 20.3 x 25.4 cm² 的滤膜。根据研究需求选择最适合的滤膜类型以及（如适用）滤膜的截留粒径¹。此处使用石英微纤维滤膜。
   2. 对用于有机物和生物化合物采样的滤膜进行预烘烤，以去除有机残留物。预烘烤时，将滤膜 individually 用铝箔包裹，然后在实验室马弗炉中于 450 °C 下烘烤至少 5 小时。
   3. 将烘烤后的滤膜储存于 -20 °C，直至开始采样。
2. 仪器操作与空气采样
   1. 清除高体积采样器头部的残留灰尘。用洁净的纸巾擦拭各部件，并在重新连接至采样器前使其自然晾干。
   2. 用乙醇对滤膜盒进行消毒，并始终佩戴手套和实验服操作。
   3. 将预烘烤过的滤膜放入洁净的滤膜盒中，并按照高体积采样器的操作手册进行后续操作。
   4. 在铝箔上标记采样日期及任何异常天气状况（例如 降雨、沙尘暴），并将铝箔保存在洁净处，直至采样结束。
   5. 采集完成后取出滤膜，将采样面向内对折。
   6. 用原始铝箔包裹滤膜，并于 -20 °C 保存至分析前。
      注意：若采样与分析之....

结果

通常使用对采样滤膜的“离线”分析来研究大气气溶胶（见图2）。³² 对采样物质的化学分析包括有机成分（例如 蛋白质、碳氢化合物分子、糖类）和无机成分（例如 金属、盐类）。生物学分析包括可存活与不可存活微生物的含量、利用DNA方法或显微镜进行物种鉴定，以及基于DNA的定量分析。

图 2：滤膜样品分析流程图。 空气采样后的滤膜（A），滤膜的制备以用于后续分析.......

讨论

本研究描述了从滤膜上采集的气溶胶样品中提取和检测内毒素及DNA以进行定量的实验方法。这些方法需要精确的操作流程，只要实验人员遵循本文所述的若干关键且重要的要点，即可轻松完成。

在内毒素检测步骤中，需注意裂解液黏度较高，移液时容易产生气泡。这些气泡难以去除，并会导致酶标仪读数发生变化。因此，应先将样品加入到微孔板中，待确认所有气泡完全消失后，再继续加入裂解液。为减少此步骤中气泡的形成，建议使用移液器时动作缓慢，在将裂解液排入微孔时不要完全压下移液器按钮。由于裂解液一旦加入内毒素提取物中反应即刻开始，因此必须尽快启动读数程序。为缩短裂解液添加时间，可使用多通道移液器。请注意，某些试剂盒和实验方案中，在样品加入微孔板后，还需在37 °C下预孵育10分钟²⁹，之后才能加入裂解液。

环境样品中内毒素提取的一个重要问题是样品中可能存在抑制物例如 在高污染空气样本中，稀释变得至关重要，可防止未稀释样本中通常出现的假性增强现象。³⁸

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
滤膜采样
HiVol 3000 - 高流量空气采样器	Ecotech
石英微纤维滤膜	Whatman	1851-865	203 mm × 254 mm
ELF - 实验室高温炉	Carbolite	ELF 11系列
铝箔	Opal
名称	公司	目录编号	备注
内毒素
乙醇	Sigma Aldrich	16368	实验室试剂，96%
Airstream Class II 生物安全柜 AC-4E1	ESCO	10011712
Pyrotell-T	Associates of Cape Cod, Inc.	T0051
标准内毒素对照品	Associates of Cape Cod, Inc.	E0005-1	Escherichia coli O113:H10，0.5 µg/瓶，1 包
LAL 试剂用水	Associates of Cape Cod, Inc.	W0051
10 ml 无菌注射器，带鲁尔锁接头	Becton-Dickinson & Co.	309605
BD Precisionglide 注射器针头	Becton-Dickinson & Co.	305129	无菌
Parafilm-M 封口膜	Parafilm	P7543	Sigma 目录编号
微量离心管	Axigen	MCT-200-C	2 ml，无热原
1.12 cm 直径打孔器	Boekel Scientific	1601 BD 系列 - 钢制	打孔器套装的一部分，包含多种直径的打孔器。
50 mm 培养皿	Miniplast Ein-Shemer	72050-01	无菌
Vortex Genie 2	Scientific Industries, inc.	SI-0297
微型离心机 5415 D	Eppendorf	22621408
TC MicroWell 96 F SI 带盖板	Nunc	167008	平底孔（带盖，单独包装），无菌，无热原
Synergy HT 多功能微孔板读板仪	Biotek	7091000
名称	公司	目录编号	备注
DNA
DNA away	Sigma Aldrich	7010
目标微生物物种的标准 DNA	ATCC 或其他菌种保藏中心		用于 DNA 提取的相应微生物菌株或已提取的 DNA
改进型 Neubauer 计数板	Marienfeld	640030	血细胞计数板
TE 缓冲液，低 EDTA	Life Technologies	12090-015	10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA
无核酸酶 PCR 级水	Sigma Aldrich	3315959001
PCR 引物	Sigma Aldrich		靶向目标微生物物种
双标记探针	Sigma Aldrich		靶向目标微生物物种
螺口管	Axigen	ST-200-SS	2 ml
PowerSoil DNA 提取试剂盒	Mo Bio Laboratories	12888-100
玻璃珠，酸洗处理，425–600 µm	Sigma Aldrich	G8772-100G
玻璃珠，酸洗处理，<106 µm	Sigma Aldrich	G4649-100G
PowerSoil Solution C1	Mo Bio Laboratories	12888-100-1	细胞裂解缓冲液，PowerSoil 试剂盒组分
Magic Touch 冰桶	Bel-Art	18848-4001
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	607EUR
StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统	Applied Biosystems	4376600
Fast SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	4385612
TaqMan 基因表达 Master Mix	Applied Biosystems	4370048
MicroAmp 快速光学 96 孔反应板（带条形码，0.1 ml）	Applied Biosystems	4346906
MicroAmp 防溅 96 孔底座	Applied Biosystems	4312063
MicroAmp 光学粘性封膜	Applied Biosystems	4311971
离心机 5810 R	Eppendorf	5811 000.010	配备 MTP 桶的 A-4-62 转子