内毒素和DNA含量的空气采样滤波器分析

在过滤器上空气采样是在大气气溶胶研究的基本工具^。1所述的取样过滤器可用于各种化学，物理和所收集的环境粒子的生物表征的起点^。2-11这种方法的优点是，各种分析可离线对同一样品执行的。编译来自所有不同分析的数据使研究者获得的收集的颗粒和助剂的特性很好地理解在解决在大气科学的复杂问题^。12,13例如，在相同的拍摄海洋和内陆空气采样期间可相对于所采样的颗粒的毒性和生物组合物^。14本研究进行比较，脂多糖（LPS），对革兰氏阴性细菌细胞壁，也被称为内毒素组分，从过滤器中提取的采样在岸和在内陆部位，并使用该评价鲎变形细胞溶解物（LAL）测试。并行地，细菌含量的基因组的评估（总菌，革兰氏阴性，和蓝藻）是使用定量聚合酶链反应（Q-PCR）对同一样品执行的。在LAL试验是基于形成的加成从鲎， 美洲鲎阿米巴细胞的含水提取物之后，向含有内毒素的水溶液浊度的测量。样品在较高的内毒素浓度，更快浊度开发¹⁵的Q-PCR分析是基于发射作为特定的DNA片段被扩增荧光信号¹⁶由信号的实时监测在PCR指数期反应和校准用标准曲线，初始的DNA量进行量化。这两种的组合与他人一起分析，如别处详述^，14可提供的内毒素和水平的良好估计样品中的源的细菌量。

这里提出的方法的目的是获得从过滤器中提取的生物气溶胶的内毒素和DNA含量的高度准确和可靠的分析。而用于采样气溶胶的物理和无机化学特性的方法是，最近，已开发了探讨其有机质成分众所周知^，17一直存在很少研究气溶胶的生物成分上¹⁸为当前的理方法是通过在详细介绍，用于提取，分析和确定空气气溶胶的生物分数一个可靠的方法来解决这个间隙¹⁴中

这里详述的方法可望找到在涉及过滤分析生物的室内和室外的气溶胶研究项目广泛使用^。20-24

注:在材料部分显示的所有材料，并在该协议中使用仪器的详细清单。

1.空气采样过滤器上

1. 过滤器的研制
   1. 对于高流量采样，使用20.3点¯x25.4厘米²过滤器。选择，具体类型的过滤器是最适合的研究需要，以及在滤波器的截止大小，如果适用^。1在此，使用石英微纤维过滤器。
   2. 用于有机和生物化合物采样预烘焙滤波器破坏有机残基。到预先烘烤的过滤器，在铝箔单独包装它们，然后在450℃烘烤他们在实验室炉中至少5小时。
   3. 在-20℃，直到采样存储烘烤滤波器。
2. 仪器处理和空气取样
   1. 从高流量采样器的头部清洁残留粉尘。擦拭干净的湿巾纸的部件并将它们允许风干befo他们再重新连接到采样器。
   2. 消毒过滤器盒用乙醇和手套和在任何时候都白大褂的工作。
   3. 放置清洁过滤器盒内部的预烘焙滤波器，并根据该高容量采样手册进行。
   4. 标注日期和任何不寻常的天气情况，如果适用（ 比如下雨，沙尘暴）的铝套，并在一个干净的地方保存，直到取样完成。
   5. 收集采样滤波器和对折，用采样面朝向内。
   6. 包裹在原铝箔和存储的过滤器在-20℃直至分析。
      注意:如果取样和分析之间的时间间隔是大于2个月​​的时间，存储该样品在-80℃，以避免有机和生物材料的降解。

2.内毒素分析

注意:消毒用70％乙醇的工作表面用无热原管，只有技巧和试剂研发工作。如果玻璃器皿的使用，需要预先加热在250℃进行30分钟，或200℃60分钟^。25，准备所有试剂在II级生物安全柜并用手套，并在任何时候都白大褂工作。

1. 试剂准备
   1. 轻轻按照LAL试剂盒生产商的协议，在即将使用前补充水分的裂解液^。26轻按小瓶撞出LAL剩余瓶壁上。轻轻抬起挡打破真空。用注射器针刺加5毫升无热原水（PFW）的小瓶再水化所有的溶液内容，轻轻混匀，以避免形成泡沫。
   2. 密封用塑料薄膜石蜡小瓶在不使用时，并储存在4°C至两天。储存在-20℃的任何剩余的溶胞产物长达三个月。
      注意:此试剂可以仅一次冻结。
   3. 补充水分控制标准内毒素（CSE），其中包含0.5μ克E.大肠杆菌 ，按照制造商的方案²⁷确定要通过输入批号为其中网站中指定的试剂盒被添加到CSE小瓶从制造商的网站²⁸的水的特定量。 大肠杆菌的最终浓度大肠杆菌在小瓶中，内毒素单位测量（EU;其中10 EU = 1纳克）。标签此瓶ED0。
   4. 用塑料薄膜石蜡密封小瓶CSE在不使用时，并储存在4°C至4周。
2. 标准曲线和尖刺过滤准备
   1. 在II级生物安全柜，制备含有CSE（管ED1-Ed11）或无CSE（仅含PFW管坯）的下降量，以产生一复制内毒素稀释系列22无热原-2-毫升离心管中，如表1。
   2. 在循环流动的生物柜，用消毒1.1切割22清洁，预焙过滤器环形件直径2厘米的软木螟。
   3. 将过滤器对进入无菌培养皿中。
   4. 穗从内毒素稀释系列ED2-Ed11的每个成员，并从管坯50微升到一对相应的过滤器。
   5. 离开包含在引擎盖下开放干燥30分钟加标滤波器培养皿。
   6. 放置在一无热原-2毫升管的每个过滤器片。

表1:内毒素标准曲线内毒素浓度，加入的无热原水的标准内毒素和体积，以及所获得的总体积是在校正曲线每种稀释液管详细。

3. 从实验和尖刺过滤器内毒素提取
   1. 在用循环流动的生物柜，使用消毒1.12厘米直径打孔器，并把它们连同尖刺标准过滤器（来自步骤2.2）切取试样的过滤器（来自步骤1.2）成环形件，在2无热原毫升管（ 即样品管）。
   2. 加入1ml PFW到管和动摇他们在室温下60分钟，使用实验室摇动器。
   3. 离心样品管在375 XG 10分钟微量^。29
   4. 转让日ê上清液，其中包含内毒素，进入一个新的无热原-2毫升管。
4. 鲎试剂（LAL）测试
   1. 通过在无热原的96孔微具有平坦底部和盖进行鲎试验测定样品中的内毒素浓度。
   2. 规划片阵列提前， 如图1。包括在每一个运行的板直接从内毒素标准溶液ED2-Ed11（因而覆盖100-0.195 EU / ml的（见2.2节）的浓度范围）中制备的标准曲线。标准曲线应该占据井行A的1-10和平板乙。抛开11-12井在这些行的空白样品（即总共四个空格）。
   3. 打开酶标仪和在37℃下，涉及该微板的温育和振荡，每5分钟，接着通过吸收测量在405nm的动力学反应编程。重复18次1.5小时。
   4. 确定efficienCY与该内毒素从样品过滤萃取（ 即 ，从加标标准过滤器中获得的样品），通过计算出的内毒素量除以原始量掺入。
   5. 通过将50微升的标准内毒素溶液（来自步骤2.4.2）或加标滤波器提取物及其坯料（从2.3节）开始试验，或试验样品和其空白（也从第2.3节）的，按照计划的板阵列（ 图1），盖上盖子。
   6. 每个孔中，迅速加入50微升LAL的解决方案，虽然它被提起到读者面前摆放在桌子上轻轻地水平摇晃板。
   7. 放置在板读数器板并开始实验运行。

图1:内毒素阵列板的前充足的96孔微量的内毒素分析阵列。

3.基因组分析

注意:对于DNA提取，消毒用70％乙醇的工作表面，并用无菌管，只提示和试剂工作。对于DNA的Q-PCR分析，消毒与表面的DNA去污剂的工作表面上。准备所有试剂在II级生物安全柜和手套，在任何时候都白大褂的工作。

1. 该DNA引物和探针的制备
   1. 之前DNA提取，要么顺序市售的组引物和探针（如果施加的水解探针法），或者设计一组新的引物和使用引物设计的计算工具的探针^。30
   2. 根据使用任一的10mM Tris-0.1mM的乙二胺四乙酸（EDTA）（TE缓冲液）或PCR级水生产商的方案再水合的引物。
      注:建议以溶解初始PCR引物ST玉珠在低乙二胺四乙酸（0.1％），因为它防止引物降解保持较长时间时的TE缓冲液中。使用的PCR级水用于随后的稀释，以减少可能抑制PCR反应的EDTA的量。
   3. 在-20℃下直到分析制备50微升的等分或无菌0.5毫升管100微升引物和探针的和存储。
2. 标准单元集中评估之前提取DNA
   1. 在一个适当大小的离心管中，制备感兴趣的微生物物种（管OD0， 表2A）的一个标准的细胞溶液。用移液管以小的孔在所述管吹打它向上和向下混合细胞悬浮液的7-10倍。
   2. 如果细胞着色（ 如某些真菌孢子），不执行染色程序。如果需要细胞染色，稀释细胞悬浮液在针对感兴趣的单元的微观检测的合适染料^。31
   3. 清洁盖玻片hemocytom用乙醇ETER。滋润并加盖盖玻片的血球。
   4. 通过仔细触摸用吸管的尖端盖玻片的边缘，通过毛细管作用填充所述腔室装载约8微升的细胞悬液到两个血球腔室。不要过/欠填充腔室。
   5. 通过在放大400倍（40X在目镜物镜和10X），在显微镜下观察它们确定细胞的数量。九个正方形测量1×1 ^平方毫米和布置成3×3的网格，应看到。着眼于网格的四个角区之一的显微镜（较高的倍率可以使用）。 1×1毫米²平方米应该包含16个小方格。
   6. 算中的四个1×1毫米²角的正方形的所有细胞中，以及在3×3网格的中间正方形。如果有太多或太少的细胞计数，重复该过程，无论是集中或稀释原始细胞悬液适当（1550个细胞应该覆盖挑出一个1mm ²中的区域）。
   7. 计算在从细胞的标准细胞悬液OD0的细胞（细胞毫升^-1）的浓度计数在五个计数平方平均如下:细胞计数毫升^-1 =平均细胞数平方^-1稀释因子10 ^4。
3. DNA提取效率评价
   1. 根据表2A准备9无菌0.5毫升管。
   2. 稀释的标准细胞溶液（OD0）含有在20微升（OD1）的总体积为约10 ⁷个细胞毫升^-1。
   3. 加入18微升无菌无核酸PCR级水（NFW）到铝管OD2-Od8和20微升空白管，Od9。
   4. 转移2微升从OD1细胞溶液进入OD2的。吸管轻轻地混合和管OD2转移2微升至OD3。继续在沿管子的相同方式稀释所述细胞直至并包括管Od8邻btain的10 ⁷ -10 ⁰细胞ml的系列稀释液^-1。
   5. 在循环流动的生物柜，切圆18清洁，预焙滤波器件，使用消毒1.12厘米直径木塞。将过滤器在对进入无菌培养皿中。
   6. 穗从稀释OD1 10微升至Od8并从管坯Od9到每个成对的过滤器，使得存在对应于每个标准细胞浓度一个过滤器对。
   7. 离开培养皿引擎盖下开放，让他们干30分钟。
   8. 放置在无菌的螺杆前2毫升管每个滤波器块，并根据在部分3.4中详述的过程中提取的DNA。
4. 从实验和尖刺过滤器提取DNA
   注意:对于从过滤器提取DNA，使用根据制造商的进行了以下修改协议设计用于从土壤提取DNA的商业试剂盒。
   1. 对于每一个FIL之三样（OD1-Od8），准备在0.5毫升无菌管酸洗玻璃珠的混合物。使用具有直径为直径为≤106微米425-600微米和0.3克珠0.1克珠。
   2. 在用循环流动的生物柜，使用消毒1.12厘米直径打孔器切从每个过滤器样品随机选择的位置的三个圆形片，并将其放置在螺杆顶端2​​ml管。
   3. 玻璃珠混合物加入到管中。
   4. 与提取试剂盒提供的细胞裂解缓冲液加入到每个管中的生物柜中，具有在制造商的协议所指示的量。
   5. 制备冰桶和机械使用珠打浆机破坏细胞。
   6. 打珠1分钟，然后将它们放置在冰上1分钟。重复五次。
   7. 从裂解后的步骤，试剂盒供应商的协议进行。
   8. 使用附带的洗脱缓冲液洗脱后（含10毫米的Tris buffer）或NFW，通过柱再次重新加载洗脱出来的样本，以提高DNA产量。
      注意:如果在同一天的DNA提取没有分析，样品可以储存在-20℃直至分析。

表2:DNA标准曲线的标准微生物细胞稀释系列（A）的详细的标准细胞体积，NFW体积，并且在每个稀释管中的总体积。 DNA的标准曲线制备（B）中，详细的标准DNA量，NFW体积，并且在每个稀释管中的总体积。

5. DNA标准曲线准备直接从感兴趣使用如步骤3.4实验筛选所述的相同方法的微生物（DD0）的标准试样中提取的DNA。
6. 使用分光光度计在260nm处确定的标准DNA样品（DD0）的DNA的浓度。
7. 制备9无菌0.5毫升管从中制备的DNA的标准曲线，示于表2B中 。
8. 如果需要的话，在20微升的总体积稀释的标准DNA溶液DD0到1-10微克毫升^-1在第一管（DD1）的浓度范围内。
9. 加入18微升NFW对铝管DD2-DD8和20微升空白管。
10. 转移2微升从DD1标准DNA溶液进入DD2的。吸管轻轻拌匀，然后从DD2转移2微升到DD3。继续以相同的方式稀释的DNA沿管，以与管坯containi达到10 ⁰ -10系列稀释^-7管DD2-DD8一起NG只NFW。
    注意:如果不在-20℃直至分析对提取的同一天进行了分析，存储样本。

表3:用于Q-PCR操作软件详细分析参数的详细信息以输入到Q-PCR程序文件。

表4:定量PCR反应混合物计算每个反应体积，反应的人数，津贴错误，总体积计算要添加到每个试剂的反应混合物是详细。

它是常见使用"离线"采样滤波器的分析来研究大气气溶胶（参见图2）。取样物质包括有机（ 例如蛋白质，烃类分子，糖类）和无机（ 例如金属，盐）含量的32化学分析。生物分析包括存活和非存活的微生物含量，使用DNA的方法或显微镜物种鉴定，以及基于DNA的定量。

图2: 文件管理器试样分析 流程图空气采样（A）的后过滤，制备的过滤器下游分析（B）和样品组分（C）的分析。

E ="1">对于内毒素的提取，滤波子样本（1.12 平方厘米）的1ml PFW摇动，在室温下60分钟。然后将样品离心在375×g下10分钟。不同离心速度可导致不同的萃取效率，如在图3A中表示。

对提取效率的初步试验应进行选择的特定的过滤器和协议进行。在图3B中 ，较高的萃取效率从与采样石英滤波器相比扣球干净获得，并且这两个效率都比通过直接检测标准溶液的实现低。如其他地方所讨论的，在过滤器上采样的环境气溶胶的性质也可以影响内毒素提取效率。14,33

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图 3: 内毒素提取效率离心速度（A）和过滤器的负载（B）的内毒素提取效率的影响。误差线表示标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于内毒素检测的反应包括一个1:LAL试剂的到内毒素标准，样本提取内毒素，或坯件1的比例。它建议使用一式三份试样分析。然而，对于标准曲线，重复就足够了。当的吸收读数（在405nm处）完成后，将所得的光密度（OD）是出口它到用于数据的进一步分析的数据分析的电子表格程序后进行分析。

如内毒素提取，它的具体的实验条件下进行的DNA的提取效率的初步分析是很重要的。这是通过掺加标准生物体细胞溶液已知量上从过滤器切下一块，按照以上描述的DNA提取协议完成。

从采样的气溶胶提取靶微生物的浓度是用Q-PCR确定的。这里水解探针技术被使用，其具有因为结合于模板DNA的额外探针的高特异性的优势，35的SYBR绿方法也可以适用于该目的。

校准曲线从从感兴趣的选择的生物体中提取DNA来源，使用上述的提取方法。反应的化合物的混合池，不包括DNA样品，标准或对照，制备和保持在黑暗中，并在冰上直至需要。然后，将混合池的等分试样在96微孔光学板加入到每个孔中。该DNA标准样品，或控制是根据片阵列的反应混合物后加入。之后所有的试剂已经被插入到板，它是海导致用光学粘接膜并旋转以收集所有的液滴在孔的底部。该板比插入的q PCR仪进行热循环扩增和信号检测。

输出数据由PCR的Ct值，其被定义为在该扩增的DNA量到达阈值电平的周期数目。使用校准曲线值，能够得到目标DNA的浓度（参见图4）。36的微生物的细胞浓度可以从与标准生物体溶液的血球计数相比，提取效率的Ct值来计算。37

图 4: 定量PCR扩增曲线 （A）和校准。离子曲线范围为代表的革兰阴性细菌的DNA进行2-4之间×10 -2×10 2（B）。 请点击此处查看该图的放大版本。

作者没有什么可透露的。