优化平行分段流动柱并实现多重检测

摘要

本文介绍了一种用于操作和优化并行分段流动色谱柱以实现多重检测的实验方案。

摘要

主动流技术（AFT）是一种新型的色谱柱技术，旨在克服流动不均一性，从而在分离效率和灵敏度方面提升分离性能，并实现多重检测。这种形式的 AFT 采用平行分段流（PSF）色谱柱。PSF 色谱柱出口端接头包含 2 个或 4 个端口，可通过多路复用连接至最多 4 个检测器。PSF 色谱柱不仅为多重检测提供了平台，还可同时组合使用破坏性和非破坏性检测器，且无需额外的死体积管路。通过压力管理，还可调节每个端口的流速，以满足特定检测器的需求。为了利用 PSF 色谱柱实现多重检测，可通过控制多个参数来确保最佳的分离性能和结果质量，这些参数包括各端口的管路尺寸、不同类型检测器所用端口的选择以及流速调节。本实验方案旨在展示如何使用并优化处于多重检测模式下的 PSF 色谱柱。

引言

主动流技术色谱柱

活性流技术（AFT）色谱柱最近被开发出来，旨在克服由于流动不均一性引起的分离效率低下问题^1-6，并实现多重检测。本文具体阐述了具有多重检测功能的平行分段流（PSF）色谱柱的操作过程。PSF色谱柱的关键功能优势包括：（1）将色谱柱床径向中心区域的流动与外围或壁面区域的流动隔离开来；（2）减少检测源需要处理的流动相体积；（3）可对检测源进行多重化，以扩展样品信息，而无需在每次检测过程中引入检测延迟，也无需后续对柱后流路进行分流^7,8。PSF色谱柱设计中实现多重检测优势的关键结构是其新颖的出口接头和烧结组件。图1展示了AFT色谱柱与传统色谱柱的实物照片。需要明确的是，通过平行分段流色谱柱实现的分流过程不同于柱后流路分流。在柱后流路分流中，整个样品带从前沿到尾部末端被均等地取样（即沿轴向），因此每条流路在效率和灵敏度方面均相同，其灵敏度的大小按分流数量等比例降低。然而，在PSF中，分流过程是径向取样，而非轴向取样。因此，中心端口采集的是峰顶——即色谱峰中浓度最高的区域。由于未受到扩散拖尾区域的稀释，此处的灵敏度最高。从外围端口流出的样品在效率上不如中心区域高，但由于是径向取样而非轴向取样，所得峰宽比沿轴向分割峰的取样方式（即柱后分流）更窄。因此，使用浓度型检测器时，灵敏度不会降低。

在PSF色谱柱中，出口接头包含多个出口端口，该端头接头内部装有一个环形烧结片。该环形烧结片的内侧部分通过径向中心出口端口引导流动相流出色谱柱，而出口烧结片的外侧径向部分则通过周边或柱壁区域的出口流路端口引导流动相流出。出口烧结片的内侧与外侧部分由一个不透流体的屏障隔开，以防止这两个流路区域之间的交叉流动²。由于这种设计，通过柱床的中心径向流路与柱内壁区域的流路实现了分离。通过压力调控，可将近似任意比例的流量分配至这两个区域，从而优化色谱柱技术的各项功能特性，例如分离效率或检测灵敏度。本质上，该设计在较大规格的色谱柱内部有效形成了一个具有更小内径的“虚拟”色谱柱，因此该色谱柱可作为真正的无壁柱运行，克服了柱床非均一性及壁效应问题^9,10。

PSF色谱柱的主要优势在于提高柱效、减少检测源的溶剂处理量，并实现多重检测。然而，另一个附加优势是，由于任何色谱峰的拖尾和前延区域均被从整体洗脱曲线中去除，因此在洗脱或检测时，溶质的浓度高于在传统色谱柱上相同进样量和浓度负载下所观察到的浓度，具体提升程度取决于所采用的分流比。因此，在PSF色谱柱上进行分离时，通常可观察到信号强度的增强²。事实上，如果调节分流比，使25%的流动相从四个出口端口中的每一个流出，则使用紫外（UV）检测所观察到的信号强度实际上与在传统色谱柱上分析全部（100%）流动相时所呈现的信号强度几乎完全相同⁷。此外，通过精细调节中心流与壁面流区域之间的出口比例，可以优化色谱柱的柱效。AFT色谱柱所观察到的柱效提升无法用单一数值表示，因为这些效率增益是三个因素的函数：（1）流速，（2）分流比，以及（3）溶质保留因子。尽管如此，与传统色谱柱相比，几乎总能观察到效率的提升，有时理论塔板数的增益甚至超过100%^1,2。调节分流比的能力使分析人员能够有效定制“虚拟”色谱柱的直径，这在检测过程中是一个重要因素。例如，当从径向中心出口端口流出的流动相占21%时，可从物理内径为4.6 mm的色谱柱建立一个虚拟的2.1 mm内径（i.d.）色谱柱。在此条件下，该虚拟2.1 mm i.d.色谱柱的柱效可能比传统的2.1 mm i.d.色谱柱高出70%以上，具体提升程度取决于流速和溶质保留因子¹⁰。

目前用于多重检测的PSF色谱柱设计采用四端口出口接头，但该色谱柱也可装配双端口端接头，不过这会将检测限制为仅能连接两个检测器。然而，这些色谱柱的基本操作原理相同，区别仅在于四端口出口PSF色谱柱可同时连接四个检测器，从而扩展了多重检测的应用范围。除了色谱柱前后的连接管路外，操作PSF色谱柱所需的其他附加条件仅为可连接至外围出口端口的管路，以及一种用于测量流经每根管路的流动相体积的方法，通常为质量测定或体积测定。为了便于调节，所有出口流路管的内径应保持一致。外围出口端口与径向中心出口端口之间的流速比例可通过压力调控进行调整，方法是改变外围出口接头上的管路长度，或改变径向中心出口端口检测器后管路的长度。

使用 PSF 柱进行多重检测

PSF 柱的一个重要优势在于，每个出口端口均可直接连接至检测源，从而实现多重检测。在设计良好的检测系统中，一次采用多重检测的分析即可提供关于样品中各组分性质的大量信息。重要的是，破坏性和非破坏性检测可同时进行，且无检测延迟。这使得能够绝对指认某些组分，例如利用 DPPH^• 试剂鉴定抗氧化剂，同时通过紫外（UV）和/或质谱（MS）检测信号观察到相应组分的洗脱行为^7,11。因此，可通过四个出口端口将流动相适当分配至各检测器，使四个独立的检测器同时运行。由于通过各端口的流速易于调节，因此可调整到达任一检测器的溶质量，以匹配特定检测源的灵敏度。然而需要注意的是，溶质通过径向中心出口端口时的迁移效率最高。各个外围端口具有相当的分离效率，当每个端口分配 25% 流量时，其效率仅略低于常规色谱柱。因此，定量检测器应设置为分析来自径向中心出口端口的样品。

在建立用于多重检测的PSF柱时，为获得高效且高质量的结果，需考虑多个因素：各端口的管路尺寸、不同类型检测器所用端口的选择以及流速调节。

各端口的管路尺寸

在色谱分析中，柱后管路的长度对分离效率和性能起着至关重要的作用。若从色谱柱出口到检测器之间的管路过长或内径过大，导致死体积过大，将引起柱效、分辨率和灵敏度的下降。因此，在搭建PSF色谱柱系统时，必须选用合适的管路尺寸，以充分发挥其高效分离能力，同时实现多重检测的优势。

端口至检测器

图2 展示了多重检测（紫外-可见光（U-Vis）、质谱仪（MS）和2,2-二苯基-1-苦肼基（DPPH^•）检测）的一个示例装置示意图。图中显示，中心端口连接至MS检测器，而DPPH^•和UV-Vis检测器则连接至外周端口。由于MS是这三种检测器中灵敏度最高的，因此将其流路连接至中心出口端口。DPPH^•检测仅对抗氧化剂的存在具有选择性，且灵敏度最低但对谱带展宽的耐受性最强，因此将其流路连接至一个外周端口。UV-Vis作为次级“通用型”检测器，其流路则连接至第二个外周端口。

流速调节

将适当的管路从一个端口连接至检测器后，可调节每个检测器出口的流出量至所需数值。一种简单测量各检测器流出量的方法是称量在特定时间内从每个端口流出的流动相的重量。由此可确定流出的百分比流量，并通过相应地缩短或延长连接至检测器出口管线的管路，调节流量比例，以满足所选检测器的要求。不同检测器对流量的要求各不相同。例如，荧光检测器（FLD）的流通池不受流速限制，但需注意避免流通池过压。因此，通常通过调节其他检测器上的压降来控制流经FLD的流量，剩余流量则通过FLD。对输送流量敏感的检测器是质谱（MS）。通常，目前高端的质谱仪可轻松处理约1至1.5 ml/min的中等含水流动相。超过此流速可能导致离子源 flooding，使质谱仪无法正常工作。然而，大多数质谱仪的检测灵敏度在较低流速下更佳，因此在涉及质谱检测的应用中，PSF的分流能力极为有用。尽管可使用高柱体积流速，但输送至质谱检测器的体积流量较低。然而，对质谱检测器的流量调节必须在质谱检测器之前（而非之后）通过调节压降来实现。此时，使用窄内径管路（0.1 mm内径）非常有效，因为可在不引入不必要死体积的情况下轻松调节压力。

根据检测器类型的不同，分割比的调整可以在检测器之前或之后进行。如果使用紫外-可见光（UV-Vis）等非破坏性检测器，则在检测器之后测量并调节流速百分比。如果在多通道系统中使用单一破坏性检测器，则需根据其他端口的流速百分比反向计算得出该检测器的流速百分比。如果使用基于试剂的检测器（例如DPPH^•），则在不添加试剂的情况下于检测器后测量流速百分比；而当使用两个或更多破坏性检测器时，流速比应在检测器前进行测量。某些可能需要附加仪器的检测系统（如DPPH^•）会引入额外的系统压力，一旦连接到检测系统，可能会改变流速百分比。因此，在检测器前调节流速百分比时，应特别注意破坏性检测器所带来的系统压力变化。无论通过任何端口设定的流速比如何，定量信息都应通过适当的标准化方法获得。然而，一旦流速比设定完成，其值即具有良好的稳定性，即使在梯度洗脱条件下也不会发生变化⁷。

本论文附带的详细视频方案旨在展示如何使用和调节以多重检测模式运行的PSF柱。

方案

注意：本方案包含如何在配备多种检测器的高效液相色谱（HPLC）系统上使用PSF色谱柱进行多重检测的操作说明。编写本方案时假定读者已具备色谱技术及多种HPLC检测方法的基本知识与实践经验。

注意：请在使用所有材料和试剂前查阅其材料安全数据表（MSDS）即， 甲醇的安全数据表（MSDS）。处理溶剂和高效液相色谱（HPLC）流动相时，应遵守所有适当的安全操作规程。确保正确使用HPLC的工程控制装置、分析天平和检测器仪器，并佩戴适当的个人防护装备（安全眼镜、手套、实验服、长裤和封闭式鞋履）。

1. 高效液相色谱仪的设置

1. 使用超纯水准备高效液相色谱仪（HPLC）仪器（例如，A相使用100%超纯水，B相使用100%甲醇作为流动相，并根据仪器制造商要求对泵进行 purge。若使用质谱检测器（如本实验），需在流动相A和B中均添加0.1%甲酸。
2. 设置高效液相色谱仪的仪器组件和检测器，如图所示 图2这要求检测器相对于色谱柱的位置应便于安装，以尽量减少检测器与色谱柱之间的死体积。高效液相色谱系统配置的灵活性是可取的。

2. 紫外-可见光和质谱检测器的设置

1. 根据目标样品设定紫外-可见光检测器至所需的波长（例如， 280 nm
2. 将质谱检测器设置为正离子模式，采用全扫描检测法进行总离子流（TIC）分析。同时相应调整以下质谱参数：汽化器温度 500 °C，毛细管温度 350 °C，鞘气流速 60 单位，辅助气体流速 40，吹扫气体流速 5 单位，喷雾电压 3.5 kV。这些参数可根据所分析样品的具体用户需求在后续进行调整。

3. 2,2-二苯基-1-苦肼基自由基（DPPH^•）试剂的制备及DPPH^•体系检测器的设置

1. 称取25 mg DPPH^•，置于容量瓶中，加入250 ml甲醇溶解。
2. 向DPPH^•试剂中加入250 µl甲酸。用铝箔包裹容量瓶，避免光照。
3. 将含有DPPH^•试剂的容量瓶超声处理10分钟。
4. 按照制造商要求，用配制好的DPPH^•试剂冲洗DPPH^•泵。
5. 根据图2组装DPPH^•系统，将泵管连接至T型接头的入口。
6. 将一根100 µl反应圈连接至T型接头的出口，并将反应圈的另一端连接至检测器。
7. 将反应圈置于柱温箱中，并将柱温箱温度设定为60 °C。
8. 将DPPH^•紫外-可见检测器设置为520 nm。

4. PSF 柱的设置

1. 将PSF色谱柱的入口连接至高效液相色谱仪。
2. 使用一段长度为15 cm、内径为0.13 mm的管路，将中心端口连接至质谱检测器。
3. 使用一段长度为15 cm、内径为0.13 mm的管路，将一个外周端口连接至紫外-可见光检测器。
4. 使用一段长度为15 cm、内径为0.13 mm的管路，将另一个外周端口连接至DPPH^•检测系统的T型接头。
5. 使用色谱柱堵头封闭未使用的外周端口。
6. 将高效液相色谱泵的流速调节至1 ml min^-1，流动相为100% B相——100%甲醇（含0.1%甲酸）。
7. 使用100%甲醇流动相对色谱柱进行20分钟的平衡，适用于内径4.6 mm、长度250 mm的色谱柱。若使用其他尺寸的色谱柱，平衡时间应根据其尺寸相应调整。

5. 多重检测中PSF柱的调节

1. 使用分析天平称量至少两个空的收集容器的质量（一个用于连接紫外-可见光检测器的出口，另一个用于DPPH^• 检测器）。
2. 将来自紫外-可见光检测器和DPPH^• 检测器出口的流动相分别收集到两个预先称重的收集容器中（5.1）。记录收集时间。每个容器中至少收集500 mg溶剂。
3. 称量收集容器，确定流动相的质量。已知甲醇的密度为0.791 g ml^-1，计算从每个出口收集的流动相体积。
4. 通过差值法，即泵设定的总流速减去通过DPPH^• 检测器和紫外-可见光检测器流路的流速，计算流向质谱检测器的流速。将各路流速表示为总流速的百分比。
   注意：理想情况下，各路流速占比应为：质谱检测器占总流速的18%，紫外-可见光检测器占22%，DPPH^•检测器占60%。
5. 如果不符合上述比例，可通过调节紫外-可见光检测器的背压来调整各路流速比例。例如，若流向紫外-可见光检测器的流速过高，可在其出口处增加一段15 cm长、内径为0.13 mm的管路以降低该支路的比例。然后重复步骤5.1至5.5。

6. 最终设置条件

1. 将DPPH^•试剂泵的流速设置为与连接至DPPH^•检测器的出口端口流出的流速相同。
   注意：现已准备好用于分析的与紫外-可见光谱（UV-Vis）、DPPH^•和质谱（MS）联用的PSF色谱柱。

结果

采用AFT色谱柱在PSF模式下进行多通道HPLC分析（图1），装置设置如图2所示。该配置可同时利用紫外-可见光谱（UV-Vis）、DPPH^•和质谱总离子流（MS-TIC）模式对咖啡样品进行分析。由于色谱图是同步记录的，因此可通过保留时间的对齐，将咖啡样品中对DPPH^•有响应的化合物与UV-Vis及MS-TIC的响应信号轻松匹配，如图3所示。当MS-TIC检测器出现正响应时，记录相应峰的分子质量。表1列出了DPPH^•峰的保留时间及其在UV-Vis和/或MS检测器中的响应情况，从而提供相应的分子质量。不同检测方法之间峰的匹配简便，使得对咖啡等复杂样品的筛选与表征更加迅速且高效。

讨论

本研究采用带有平行分段流（PSF）色谱柱的多通道检测高效液相色谱法（HPLC），对咖啡进行表征与分析。利用PSF色谱柱进行多通道HPLC分析，可在显著减少样品数据复杂性的同时，在远短于传统多检测方法所需的时间内，获得更丰富的分子特异性信息，从而实现关键化学成分的表征与鉴定。PSF色谱柱不仅为多通道检测提供了平台，还可无需额外死体积和管路，直接组合使用破坏性和非破坏性检测器。本研究将DPPH^•、紫外-可见光谱（UV-Vis）和质谱（总离子流图，TIC）三种检测方法进行多通道联用，用于意式浓缩咖啡的分析。

采用4通道PSF色谱柱，结合三种不同的检测器，对咖啡样品进行多重分析。PSF色谱柱出口的中心端口连接至质谱（MS）检测器，三个外周端口中的两个分别连接至DPPH^•检测系统或紫外-可见（UV-Vis）检测器。第三个可用的外周端口未被使用，因此用色谱柱堵头封闭；但该端口也可用于样品收集或其他检测器。该多重检测系统的调谐过程针对各检测器分别进行，其中分段流动的测量在UV-Vis和DPPH^•检测系统之后进行。由于质谱为破坏性检...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高效液相色谱仪			可选择多种检测器以实现多重检测。所选检测器可能需要额外的仪器设备，例如泵。
并行分段流高效液相色谱柱	Thermo Fisher Scientific	未定义	即将商业化
甲醇	任意品牌		色谱纯
PEEK 管路	任意品牌		多种长度和内径
色谱柱堵头	任意品牌		用于封闭未使用的侧端口
PEEK 管切割器	任意品牌
分析天平	任意品牌
秒表	任意品牌
洗脱液收集容器	任意品牌		可使用 1–2 ml 样品瓶作为洗脱液收集容器