本文介绍了一种用于操作和优化并行分段流动色谱柱以实现多重检测的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
主动流技术（AFT）是一种新型的色谱柱技术，旨在克服流动不均一性，从而在分离效率和灵敏度方面提升分离性能，并实现多重检测。这种形式的 AFT 采用平行分段流（PSF）色谱柱。PSF 色谱柱出口端接头包含 2 个或 4 个端口，可通过多路复用连接至最多 4 个检测器。PSF 色谱柱不仅为多重检测提供了平台，还可同时组合使用破坏性和非破坏性检测器，且无需额外的死体积管路。通过压力管理，还可调节每个端口的流速，以满足特定检测器的需求。为了利用 PSF 色谱柱实现多重检测，可通过控制多个参数来确保最佳的分离性能和结果质量，这些参数包括各端口的管路尺寸、不同类型检测器所用端口的选择以及流速调节。本实验方案旨在展示如何使用并优化处于多重检测模式下的 PSF 色谱柱。
引言
主动流技术色谱柱
活性流技术（AFT）色谱柱最近被开发出来，旨在克服由于流动不均一性引起的分离效率低下问题1-6，并实现多重检测。本文具体阐述了具有多重检测功能的平行分段流（PSF）色谱柱的操作过程。PSF色谱柱的关键功能优势包括：（1）将色谱柱床径向中心区域的流动与外围或壁面区域的流动隔离开来；（2）减少检测源需要处理的流动相体积；（3）可对检测源进行多重化，以扩展样品信息，而无需在每次检测过程中引入检测延迟，也无需后续对柱后流路进行分流7,8。PSF色谱柱设计中实现多重检测优势的关键结构是其新颖的出口接头和烧结组件。图1展示了AFT色谱柱与传统色谱柱的实物照片。需要明确的是，通过平行分段流色谱柱实现的分流过程不同于柱后流路分流。在柱后流路分流中，整个样品带从前沿到尾部末端被均等地取样（即沿轴向），因此每条流路在效率和灵敏度方面均相同，其灵敏度的大小按分流数量等比例降低。然而，在PSF中，分流过程是径向取样，而非轴向取样。因此，中心端口采集的是峰顶——即色谱峰中浓度最高的区域。由于未受到扩散拖尾区域的稀释，此处的灵敏度最高。从外围端口流出的样品在效率上不如中心区域高，但由于是径向取样而非轴向取样，所得峰宽比沿轴向分割峰的取样方式（即柱后分流）更窄。因此，使用浓度型检测器时，灵敏度不会降低。
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方案
注意：本方案包含如何在配备多种检测器的高效液相色谱（HPLC）系统上使用PSF色谱柱进行多重检测的操作说明。编写本方案时假定读者已具备色谱技术及多种HPLC检测方法的基本知识与实践经验。
注意：请在使用所有材料和试剂前查阅其材料安全数据表（MSDS）即， 甲醇的安全数据表（MSDS）。处理溶剂和高效液相色谱（HPLC）流动相时，应遵守所有适当的安全操作规程。确保正确使用HPLC的工程控制装置、分析天平和检测器仪器，并佩戴适当的个人防护装备（安全眼镜、手套、实验服、长裤和封闭式鞋履）。
1. 高效液相色谱仪的设置
- 使用超纯水准备高效液相色谱仪（HPLC）仪器（例如，A相使用100%超纯水，B相使用100%甲醇作为流动相，并根据仪器制造商要求对泵进行 purge。若使用质谱检测器（如本实验），需在流动相A和B中均添加0.1%甲酸。
- 设置高效液相色谱仪的仪器组件和检测器，如图所示 图2这要求检测器相对于色谱柱的位置应便于安装，以尽量减少检测器与色谱柱之间的死体积。高效液相色谱系统配置的灵活性是可取的。
2. 紫外-可见光和质谱检测器的设置
- 根据目标样品设定紫外-可见光检测器至所需的波长（例如， 280 n....
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结果
采用AFT色谱柱在PSF模式下进行多通道HPLC分析（图1），装置设置如图2所示。该配置可同时利用紫外-可见光谱（UV-Vis）、DPPH•和质谱总离子流（MS-TIC）模式对咖啡样品进行分析。由于色谱图是同步记录的，因此可通过保留时间的对齐，将咖啡样品中对DPPH•有响应的化合物与UV-Vis及MS-TIC的响应信号轻松匹配，如图3所示。当MS-TIC检测器出现正响应时，记录相应峰的分子质量。表1列出了DPPH•峰的保留时间及其在UV-Vis和/或MS检测器中的响应情况，从而提供相应的分子质量。不同检测方法之间峰的匹配简便，使得对咖啡等复杂样品的筛选与表征更加迅速且高效。
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讨论
本研究采用带有平行分段流（PSF）色谱柱的多通道检测高效液相色谱法（HPLC），对咖啡进行表征与分析。利用PSF色谱柱进行多通道HPLC分析，可在显著减少样品数据复杂性的同时，在远短于传统多检测方法所需的时间内，获得更丰富的分子特异性信息，从而实现关键化学成分的表征与鉴定。PSF色谱柱不仅为多通道检测提供了平台，还可无需额外死体积和管路，直接组合使用破坏性和非破坏性检测器。本研究将DPPH•、紫外-可见光谱（UV-Vis）和质谱（总离子流图，TIC）三种检测方法进行多通道联用，用于意式浓缩咖啡的分析。
采用4通道PSF色谱柱，结合三种不同的检测器，对咖啡样品进行多重分析。PSF色谱柱出口的中心端口连接至质谱（MS）检测器，三个外周端口中的两个分别连接至DPPH•检测系统或紫外-可见（UV-Vis）检测器。第三个可用的外周端口未被使用，因此用色谱柱堵头封闭；但该端口也可用于样品收集或其他检测器。该多重检测系统的调谐过程针对各检测器分别进行，其中分段流动的测量在UV-Vis和DPPH•检测系统之后进行。由于质谱为破坏性检.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由西悉尼大学（UWS）和赛默飞世尔科技公司（ThermoFisher Scientific）资助。其中一位作者（DK）感谢获得澳大利亚研究生奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高效液相色谱仪 | 可选择多种检测器以实现多重检测。所选检测器可能需要额外的仪器设备，例如泵。 | ||
| 并行分段流高效液相色谱柱 | Thermo Fisher Scientific | 未定义 | 即将商业化 |
| 甲醇 | 任意品牌 | 色谱纯 | |
| PEEK 管路 | 任意品牌 | 多种长度和内径 | |
| 色谱柱堵头 | 任意品牌 | 用于封闭未使用的侧端口 | |
| PEEK 管切割器 | 任意品牌 | ||
| 分析天平 | 任意品牌 | ||
| 秒表 | 任意品牌 | ||
| 洗脱液收集容器 | 任意品牌 | 可使用 1–2 ml 样品瓶作为洗脱液收集容器 |
参考文献
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technol....
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