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方法文章

小鼠经口灌胃益生酵母的转化及其从胃肠道免疫组织中的回收

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DOI：

10.3791/53453

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2016年2月8日

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1Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Biochemistry, Emory University School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一套统一的方法，可用于开发、转化、施用和检测益生酵母Saccharomyces boulardii的异源蛋白表达。

摘要

开发重组口服疗法可更直接地靶向黏膜免疫系统，增强对抗胃肠道疾病的能力。尤其将益生酵母改造用于此策略具有多项优势。这些菌株不仅能够合成多种复杂的异源蛋白，还能在通过肠道的过程中存活并保护这些蛋白。然而，该策略需要掌握多种通常不常联合使用的实验室技术。此外，尽管常用实验室菌株的酵母转化单个实验方案已有充分表征，但本文重点在于替代性方法，并强调针对特征尚不明确的益生酵母菌株优化转化条件的重要性。详述这些方法将有助于推动关于如何最佳测试益生酵母作为口服药物递送载体的讨论，并促进这一新型胃肠道治疗策略的发展。

引言

益生菌微生物是一种颇具前景的、可高效且经济地将异源蛋白递送至胃肠道的潜在手段。这类微生物能够耐受胃肠道的通过环境，但不会在其内定植1，从而实现可控剂量给药，并限制机体对所表达药物的暴露。此外，这些微生物易于进行遗传改造，可大规模生产异源蛋白，使其成为合成递送颗粒的一种经济替代方案。然而，此类方法的开发——正如近期利用益生酵母Saccharomyces boulardii的营养缺陷型菌株所展示的那样2——需要掌握通常不在同一研究中结合使用的多种实验技术，涵盖从酵母与分子生物学到动物操作技术及免疫学方法等多个领域。因此，尽管本文所述各项具体操作本身并非新颖的实验方案，但本论文的目标是系统性地介绍以小鼠胃肠道为靶点、评估益生酵母作为药物递送载体时所需的关键实验技术。本文提供了一套核心实验流程，包括：1）构建易于遗传操作的酵母营养缺陷型突变菌株；2）转化酵母以表达异源蛋白；3）通过口服灌胃将重组酵母递送至小鼠肠道；以及4）从小鼠肠道中回收具有活性的重组益生酵母，并检测其异源蛋白的表达水平。

首先，尽管目前存在多种用于酵母菌种操作的正向和负向筛选方法，但使用营养缺陷型标记等负向筛选方法能够显著提高酵母转化和筛选的效率与便捷性。相比之下，利用抗生素进行转化子的正向筛选会大幅增加酵母操作的成本。此外，在含抗生素的固体培养基上筛选酵母时，相较于在缺乏必需营养成分的合成限定固体培养基上筛选营养缺陷型酵母，未转化的背景菌落生长可能更为明显（未发表观察结果）。营养缺陷型酵母是指缺乏合成必需氨基酸或尿嘧啶关键酶的菌株。这类酵母只有在补充了缺失的代谢物或代谢基因时才能生长，因此当将其接种于缺乏该必需代谢物的合成限定培养基上时，便可实现负向筛选。事实上，许多常用的Saccharomyces cerevisiae实验室菌株本身就是营养缺陷型突变株3。然而，工业、临床及益生菌用途的酵母菌株通常为原养型，能够自行合成所有必需营养物质。为了更高效地对这类酵母进行遗传操作，可选择性地靶向营养缺陷型基因，从而构建出无需使用抗生素即可筛选的菌株。对营养缺陷型标记基因的特异性靶向可通过基于同源重组的PCR介导基因敲除实现，或近年来更为常用的CRISPR/Cas9靶向技术4-6。另一种方法是采用紫外线（UV）诱变，该方法可快速产生营养缺陷型突变株，即使对于难以通过多个质粒进行转化的酵母菌株也同样适用7。尽管PCR靶向和CRISPR/Cas9技术已在其他文献中被广泛描述，本文第一部分提供了一项详细的实验方案，介绍利用UV诱变法构建营养缺陷型菌株的技术流程，从而实现对酵母转化子的负向筛选，而非依赖抗生素的正向筛选。

将此类营养缺陷型菌株用于口服递送异源蛋白的下一个必要步骤，是通过质粒DNA对酵母进行转化。自1978年首次成功报道对Saccharomyces cerevisiae酵母原生质体进行转化以来8，已有大量改进方法被建立，以提高酵母物种遗传修饰的效率和操作便利性。1985年首次描述了利用电穿孔法成功将DNA导入S. cerevisiae9，此后通过添加1 M山梨醇进行孵育以提供渗透保护，进一步优化了该方法10。此外，电穿孔效率已被证明依赖于酵母物种与菌株、细胞数量与生长阶段、电穿孔体积、电场强度以及特定缓冲液11。醋酸锂（LiOAc）转化法最初由Ito et al.12描述，是目前最常用的转化方案之一，因其无需特殊设备。进一步研究表明，当细胞在对数中期收集，并在聚乙二醇（PEG）和DNA存在条件下于42 °C进行热激时，LiOAc酵母转化效率显著提高12。用PEG孵育完整酵母细胞对于实现高效转化至关重要，可能通过促进DNA与细胞膜的结合以及其他对膜的作用来实现13。锂离子本身也可增加完整细胞的通透性14。尽管大多数实验室使用的S. cerevisiae菌株均可通过LiOAc法轻松转化3，但其他酵母物种可能更适合采用替代方案进行转化。Pichia pastoris即为一例，其通过电穿孔法转化的效率明显高于LiOAc法13。因此，在尝试对尚未表征的酵母菌株进行遗传修饰时，至关重要的是测试多种转化方法，并优化孵育时间与试剂浓度。本文因此描述了LiOAc转化法和电穿孔法两种技术，用于转化营养缺陷型突变体及野生型S. boulardii。感兴趣的读者可参考近期综述，以获取有关酵母转化技术发展历程、替代方案及潜在作用机制的详细讨论13,15。为便于后续检测，使用编码易于检测蛋白的质粒对酵母进行转化，对于确保异源蛋白的正确表达与功能也至关重要。可根据治疗研究的最终目的以及可用于免疫印迹、ELISA等检测技术的抗体，选择多种不同的目标蛋白。这些检测技术的实验方案已在其他文献中详尽描述16,17，可通过与标准曲线比较，测定转化酵母中异源蛋白的表达水平。为便于演示并展示酵母生物学中一种极为常用蛋白的成功表达，本文采用编码绿色荧光蛋白（GFP）的质粒进行转化，从而可在后续通过荧光显微镜进行检测。

在表达异源蛋白的益生菌制剂的制备过程中，同样重要的是对这些微生物在胃肠道组织内的正确施用与检测，如本文第三和第四部分所述。通过口服灌胃法施用重组酵母，可将精确控制数量的酵母直接递送至胃内，而C57BL/6小鼠天然不具备呕吐能力18。然而，不当的动物操作和灌胃操作可能导致食管损伤与穿孔、胃穿孔、气管给药以及吸入性肺炎19,20。操作技术不佳和经验不足还可能增加小鼠免疫反应和实验结果的变异性，这已被归因于口服灌胃过程中动物所承受的应激21,22。因此，熟练掌握正确的操作技术不仅可减轻动物不适，还可提高实验结果的精确性。本文描述并演示了用于递送可控剂量重组酵母的动物操作与口服灌胃技术。

最后，必须通过检测淋巴组织中是否存在酵母及异源蛋白，以确认重组酵母的成功递送。胃肠道免疫组织中最容易且可重复检测酵母存在的部位是派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches）。派伊尔集合淋巴结是位于小肠的次级淋巴器官，是诱导黏膜免疫应答的关键部位23。肠腔中的抗原通过上皮中的微褶（M）细胞以跨细胞方式转运，并释放至派伊尔集合淋巴结内，从而使包埋其中的抗原呈递细胞暴露于肠腔内容物。尽管杯状细胞也可介导颗粒物穿过肠上皮的摄取，但研究表明其仅能摄取直径小于0.02 µm的颗粒24。CD103+树突状细胞（DC）延伸出的跨上皮树突也可从肠腔摄取小颗粒25；然而，目前尚无报道表明CD103+ DC能够摄取大于细菌的颗粒。因此，平均直径为3–6 µm的完整益生酵母最可能由M细胞摄取并转运至派伊尔集合淋巴结。本文描述了一种用于采集和筛选具有活性的重组酵母的派伊尔集合淋巴结的实验方案，该方法也可简便地适用于益生细菌摄取情况的评估。

总之，评估重组益生酵母向肠道递送治疗性蛋白的能力，需要掌握涵盖分子生物学、动物操作和免疫学等多个领域的实验技术。本文介绍了以下实验方案：1）构建和筛选营养缺陷型酵母菌株的方法，该菌株可在无需抗生素的情况下实现有效的负向筛选；2）转化酵母并实现异源蛋白表达的替代性实验方案；3）规范的动物操作技术和经口灌胃法，用于将重组酵母递送至胃内；4）派伊尔集合淋巴结（Peyer's patch）的分离方法，以及对存活重组酵母和功能性异源蛋白的检测方案。综合这些方法，可实现一种能够向胃肠道递送异源治疗性蛋白的益生酵母菌株的构建与功能验证。

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方案

1. 紫外线诱变法构建营养缺陷型酵母菌株

  1. 生成生存曲线以确定所需的紫外线照射剂量
    1. 制备YPD（酵母提取物蛋白胨葡萄糖）培养基及其他所列试剂 表1 按照标准操作程序26 并挑取单菌落接种于5-10 ml YPD培养基中。将培养物置于30℃摇床中培养 °C O/N 至少饱和8小时。
    2. 使用分光光度计测定过夜培养物的细胞浓度，方法为将细胞在塑料比色皿中以水按1:10比例稀释。将细胞稀释至浓度为107 细胞/ml，溶于20 ml无菌蒸馏水中。
    3. 将稀释后的细胞倒入无菌塑料培养皿中，移去皿盖，将培养皿置于紫外灯下方14 cm处。
    4. 将细胞暴露于连续的5,000 µJ 和 10,000 µJ 剂量的紫外线照射，提取 500 µ每次增加后取 l 量细胞，使细胞在暴露于 0 后被取样 µJ, 5,000 µJ，10,000 µJ, 15,000 µJ，20,000 µJ, 25,000 µJ, 30,000 µJ, 40,000 µJ，和 50,000 µ紫外照射的 J。将提取的细胞样品转移至无菌的 1.5 ml 离心管中，并用无菌水按 1:10 梯度依次稀释。
    5. 将各稀释度的菌液在微量离心机中以16,000 x g离心1 min收集菌体，吸除上清液后重悬于100 µ适量无菌水用于酵母细胞涂布。将重悬的细胞全部移液至含有YPD固体培养基的平板上，使用无菌涂布棒将细胞均匀涂布于每个平板表面。
    6. 用封口膜包裹平板边缘以防止培养基干燥，并用铝箔覆盖平板以避免光复活作用及修复紫外线诱导的突变。将平板倒置置于30 °C培养 °C培养2-4天，以促进有活力的酵母菌落生长（图1).
    7. 用记号笔标记已计数的菌落，或使用手持式电子计数笔，或使用带放大功能的计数台，对菌落数量进行计数。以每组接种细胞总数的百分比形式绘图。 µJ 剂量的紫外线照射，以生成照射后酵母的存活曲线（图2).
      注意：单倍体酵母菌株达到相同存活率所需的紫外线照射剂量通常低于二倍体菌株。缺乏功能性DNA修复酶的酵母菌株，例如 rad1 S. cerevisiae 突变体可作为阳性对照，用于指示极低剂量的紫外照射。
    8. 参照1.1.7中建立的存活曲线，确定用于筛选的紫外线诱变剂量。存活曲线上y值等于50时对应的x值，即为50%酵母细胞存活的紫外线照射剂量。在此较低存活率下进行突变体筛选，可能获得更高比例的成功突变菌株，尤其是对于二倍体酵母。野生型（WT）的50%存活剂量为 S. boulardii，如所示 图2，约为18,000 µJ.
      注意：尽管高剂量紫外线会增加除目标营养缺陷型标记基因外其他细胞通路基因发生突变的风险，但必须权衡这一缺点与同时诱导两个拷贝的营养缺陷型标记基因突变的需求。对于仅需突变单个基因拷贝的单倍体菌株，在较高存活率（例如90%）条件下进行筛选可降低额外突变的风险，同时仍能有效产生足够的营养缺陷型突变体。
  2. 紫外线诱变及营养缺陷型酵母菌株的筛选
    1. 按照步骤 1.1.1–1.1.3 所述制备酵母。
    2. 将酵母暴露于1.1.8步骤中确定的对应50%存活率的UV照射剂量。对于WT S. boulardii，该剂量被确定为约18,000 µJ图2).
    3. 收集1 ml经紫外线照射的酵母液，于微型离心机中以16,000 × g离心1分钟，沉淀细胞。吸除上清液，将菌体重悬于100 μL溶液中。 µl 无菌水
      1. 突变体筛选
        1. 如果使用筛选，例如 ura3- 营养缺陷型突变体，将经平板照射的酵母接种至含有5-氟乳清酸（5-FOA）的培养基中，以筛选缺失功能性Ura3酶的细胞。
          注意：任何含有功能性 Ura3 基因的酵母均能将 5-FOA 转化为毒性物质 5-氟尿嘧啶，导致细胞死亡，从而便于筛选出 ura3-缺乏功能性 Ura3 的菌落27. 类似的筛选方法也可用于 LYS2 和 LYS5 TRP1 和 MET2 和 MET15 使用含标记物的培养基 α-氨基己二酸285-氟代蒽氨酸29；以及甲基汞30,31分别。
        2. 用移液器吸取100 µ将重悬的细胞液涂布于含5-FOA的最小培养基上，使用无菌涂布棒均匀涂布。用Parafilm封膜后倒置培养皿，在30 °C条件下培养 °在2-4天内培养以促进有活力的酵母菌落生长。
        3. 确认 ura3- 通过在YPD平板上重新划线，检测在5-FOA平板上出现的任何菌落的表型，尿嘧啶- 和5-FOA平板（图3）。用无菌牙签的尖端挑取单个菌落的一部分，并将细胞轻轻拖过新鲜的YPD、尿嘧啶培养基表面-，以及5-FOA平板。再次将包裹好的平板倒置于30℃培养 °2-4 天，4 ℃
          注意：活细胞菌落呈隆起状、大致圆形的生长形态，而非活细胞仅表现为不透明的 smear，无任何隆起生长结构。图3).
      2. 突变体筛选
        1. 若需构建无法使用选择性方法筛选的营养缺陷型突变株，可用无菌水对经紫外线照射的酵母细胞进行连续10倍系列稀释，取稀释液接种于YPD培养基平板，使用无菌涂布棒均匀涂布。
        2. 用封口膜包裹平板，30℃倒置培养 °在2-4天内于C条件下培养。确定能够形成易于区分的单菌落的稀释度，通常每块平板上的菌落数不超过约100个。
        3. 重复步骤 1.2.1-1.2.3 中所述的酵母样品 UV 诱变，并以此确定的稀释度涂布细胞。将稀释后的酵母用移液器接种至 YPD 培养基上，使用无菌涂布棒均匀分散细胞，将平板封好后倒置，于 30 °C 培养 °2-4 天，4 ℃
        4. 通过影印接种法将菌落转移到缺乏目标代谢物的选择性培养基上，以筛选营养缺陷型菌株。首先，将无菌的绒布垫固定在平板支架上，然后将经紫外线照射处理的菌落平板倒扣在绒布上，并标记平板的方向。
        5. 接下来，将一个不含目标代谢物的新培养皿倒置在绒布上，轻轻按压，以将细胞从绒布转移到培养皿中。将原始培养皿置于4 °C保存。 °C. 将新培养皿倒置，用封口膜包裹后于30℃孵育 °2-4 天，4 ℃
        6. 作为影印平板法的替代方法，可通过将菌落从 YPD 培养基重新划线至选择性培养基上来筛选突变体。用无菌牙签尖端挑取单个菌落的一部分，轻轻将细胞在新鲜的 YPD 平板和缺乏目标代谢物的平板上划线。再次将包好的平板倒置于 30 ℃ 培养 °2-4 天，4 ℃
          注意：必须谨慎挑选单菌落，并多次划线分离菌落，以确认获得均一的真正营养缺陷型细胞群体。
    4. 通过将单菌落接种至5-10 ml YPD培养基及缺乏相应代谢物的培养基中，进一步验证辐照后细胞的表型例如， 在尿嘧啶中- 用于培养基的 ura3- 突变体）。在30℃下于旋转滚筒中孵育 °C O/N 以确认细胞在 YPD 培养基中生长，但在缺乏代谢物的情况下不生长。
      注意：尽管在固体培养基上的生长模式应能明确指示酵母的营养缺陷型状态，但某些酵母可能在固体培养基上耐受压力并形成微小、生长缓慢的菌落，却无法在液体培养基中耐受相同条件（未发表观察结果）。因此，应通过接种液体培养基以充分确认经紫外照射突变株的生长模式。
    5. 对于已确认的营养缺陷型突变株的长期保存，可通过将细胞接种于10 ml YPD培养基中，在30℃恒温摇床中过夜培养，制备甘油菌种保存液。 °离心 3 分钟（2,500 × g）使细胞成团，吸除上清液。用 50% 无菌过滤甘油重悬细胞，转移至冻存管，于 -80 ℃ 保存 °C.
      注意：经紫外线诱变的酵母可能在非目标营养缺陷型标记基因之外的多个基因中存在突变。在确认并使用营养缺陷型突变株之前，应通过基因测序以及对pH、胆汁酸胁迫和其他与益生菌特性相关特征的抗性评估对其进行进一步分析，具体方法见其他文献所述。2此外，应考虑采用基于PCR同源性或CRISPR/Cas9靶向的方法对营养缺陷型标记进行更特异性的突变，以替代紫外线诱变。4-6.

2. 酵母转化

  1. 酵母的LiOAc转化法
    1. 将单个酵母菌落接种至5-10 ml YPD培养基中，于30℃滚筒摇床中培养°C O/N.
    2. 为诱导对数期生长并提高质粒摄取效率，使用分光光度计在塑料比色皿中测定细胞在无菌水中1:10稀释液的吸光度，以确定细胞浓度。将过夜培养物稀释至OD600 0.16–0.2（约 2 × 106- 2.5 × 106 细胞/ml）于50 ml新鲜温热YPD培养基中，并在设定为200 rpm的旋转摇床上培养，直至菌液浓度达到约1 × 107 细胞/毫升，通常约4小时。
      注意：转化效率可以表示为每成功转化的酵母菌落形成单位（CFU）数量的函数 µ微克质粒DNA。效率提高可导致每微克质粒DNA获得更多的转化菌落 µ质粒DNA的量。在对数生长期传代培养并收集酵母细胞是提高转化效率的因素之一12.
    3. 离心收集细胞，2,500 × g 离心 3 分钟。
    4. 吸除上清液，用1 ml无菌水重悬沉淀，将细胞转移至1.5 ml微量离心管中。
    5. 在微量离心机中以16,000 x g离心1分钟收集细胞，吸除上清液，加入1 ml TE/LiOAc（Tris EDTA LiOAc）缓冲液重悬细胞以洗涤。
    6. 重复离心并用 TE/LiOAc 缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度至 2 x 109 细胞/毫升
    7. 分别准备以下每种转化混合物：50 µTE/LiOAc 缓冲液中制备的酵母菌液，5 μL µl 载体DNA（10 µ克/µl），和1 µ质粒DNA的量（l） µg). 质粒DNA的微克量可进行滴定，因为增加DNA用量可能提高也可能不会提高转化效率32
      注意：对于缺失一种营养缺陷型标记的突变酵母菌株，每个样品只能转化一个编码该标记的质粒。此外，使用编码易于检测的蛋白质（如GFP）的质粒，可在转化后有效检测酵母菌株中外源蛋白的正确折叠与表达情况。
    8. 向每份制备物中加入 300 µl PEG/LiOAc/TE 溶液并充分涡旋。完整细胞与 PEG 的孵育对于实现高效转化至关重要。13.
    9. 在30℃下孵育样品 °在200 rpm的轨道摇床上，将微量离心管置于烧杯中，振荡30分钟。
    10. 加入35 µ将1 μL DMSO加入每个反应体系，并在42℃下热激细胞15分钟 °C 水浴。尽管关于DMSO是否具有额外益处存在相互矛盾的报道33，完整酵母细胞的热激处理已被证明可显著提高转化效率12.
    11. 按照2.1.5步骤，通过离心沉淀细胞，吸除或用移液器移去上清液，再重悬于1 ml无菌水中。轻轻吹打混匀以充分分散细胞沉淀。
      注意：必须彻底去除上清液，因为制备感受态细胞时使用的培养基可能会抑制酵母的生长和菌落形成。
    12. 重复步骤 2.1.5 的细胞沉淀操作，吸除上清液，并将细胞重悬于 100 µl 无菌水。用移液器将全部体积转移至选择性培养板上，并使用无菌涂布棒将转化后的酵母均匀涂布于平板表面。
    13. 用 Parafilm 封住包被平板的边缘以防止培养基干燥，并于 30 ℃ 倒置培养 °C培养2天，以促进转化酵母细胞的生长。成功且高效的转化及营养缺陷型筛选 酿酒酵母 每次转化制备可获得大量菌落，尽管其他菌株的产量可能低得多（图4).
    14. 短期（通常为1-3周）将酵母平板倒置并覆盖后于4℃保存 °C. 按照1.2.5节所述方法制备转化酵母的甘油菌种，用于长期保存。
      注意：需要进一步开展转化菌落形成单位（CFU）的测试研究，以确定质粒稳定性并评估外源蛋白的正确表达。关于质粒稳定性的详细描述34，使用免疫印迹法检测从细胞样品中回收的变性蛋白质17酶联免疫吸附测定（ELISA）以检测正确折叠的三维蛋白质 16，以及GFP在酵母研究中的应用35 在其他地方有提供。 图6 显示转化后成功表达GFP的代表性图像 S. cerevisiae 相对于未转染细胞。使用此类荧光蛋白是高效检测异源蛋白表达是否成功的一种方法。
  2. 酵母电穿孔
    1. 将单个酵母菌落接种至5-10 ml YPD培养基中，于30℃在滚筒摇床中培养 °C O/N.
    2. 使用分光光度计测定细胞在无菌水中的1:10稀释液，以确定细胞浓度。将过夜培养物稀释至100 ml新鲜温热YPD培养基中，使OD600 约0.3的等效值。在30℃下孵育亚培养物 °在设定为200 rpm的旋转平台摇床上振荡，直至达到OD600 约为1.6，通常需要4-5小时。每100 ml的继代培养物可产生足够用于两次转化反应的预处理细胞。
    3. 以2,500 × g离心3分钟收集细胞。吸除上清液，将细胞重悬于50 ml冰上预冷的无菌水中进行洗涤。再次离心收集细胞，吸除上清液，并将细胞重悬于新鲜的50 ml冰上预冷的无菌水中，重复洗涤一次。
    4. 再次离心收集细胞，并重悬于50 ml预冷的电穿孔缓冲液（1 M Sorbitol，1 mM CaCl₂）中2).
    5. 重复步骤 2.2.3 的离心操作，吸除上清液，将细胞重悬于 20 ml 0.1 M LiOAc/10 mM DTT 中。将细胞悬液置于 30 °C 摇床中孵育 °30 分钟。细胞在 LiOAc 和 DTT 中的预孵育可协同提高电穿孔效率36.
    6. 离心收集细胞（步骤2.2.3），弃上清，加入50 ml冰上预冷的电穿孔缓冲液重悬洗涤。再次离心后，将细胞重悬于冰上预冷的电穿孔缓冲液中，最终体积为1 ml。
    7. 在冰上准备：诱导后的酵母细胞、无菌电穿孔杯和质粒DNA。在将诱导后的细胞用1 ml电穿孔缓冲液重悬后的立即时刻，取400 µl 条件化酵母细胞，约 1 µ克质粒DNA，加入至预冷的0.2 µm 电穿孔比色皿。增加DNA用量可能会略微提高转化效率11. 将反应物置于冰上孵育5分钟，然后使用电穿孔仪在2.5 kV和25 μF条件下进行电穿孔 µF.
      注意：如2.1.7所述，缺失一种营养缺陷型标记的突变酵母菌株每样品仅可转化一个编码该突变标记的质粒。此外，使用编码易于检测的蛋白（如GFP）的质粒，可在转化后有效判断异源蛋白的正确折叠与表达情况。
    8. 将电穿孔后的细胞转移至8 ml YPD与1 M山梨醇按1:1比例混合的溶液中，于30℃在旋转滚筒中孵育细胞 °60 分钟，C
    9. 按2.2.3步骤收集菌体沉淀，并重悬于100 µl 1:1 YPD:1 M 山梨醇。将全部体积涂布于含1 M山梨醇的选择性培养基上，用Parafilm封住平板边缘，30℃倒置培养 °在30 °C下培养2-5天，以促进转化酵母细胞的生长。
      注意：必须检测转化后的酵母以评估异源蛋白的正确表达，具体方法见2.1.14和2.2.7。

3. 经口灌胃法向小鼠给予转化酵母

  1. 所有动物护理和操作程序均须依照《实验动物护理与使用指南》以及机构动物护理与使用委员会批准的规程进行。
  2. 通过将转化后的营养缺陷型酵母单菌落接种至5–10 ml选择性培养基中，制备过夜（O/N）酵母培养物。将培养物置于30℃滚筒摇床中孵育至少8小时。 °C直至饱和。
    注意：使用编码测试蛋白（如 GFP）的质粒可便于对灌胃用酵母中的蛋白表达进行检测，具体方法见 4.7 节。
  3. 为最大程度诱导蛋白表达并诱导对数期生长，需从过夜培养物（O/N 培养物）制备转接培养物，将其稀释至 OD600 相当于在50 ml适当培养基中OD600约为0.16–0.2，具体操作见2.1.2节。
  4. 测定继代培养细胞的浓度，方法同1.1.2，并调整至109 细胞/毫升。制备100 µ每只小鼠的剂量，仅需数百个 µ每组额外增加体积，以提高准确性和样品加样的便捷性。
  5. 以 2,500 × g 离心 3 分钟，或在微量离心机中以 16,000 × g 离心 1 分钟，使细胞沉淀。吸除上清液，加入等体积无菌水，轻轻吹打重悬细胞。
  6. 将合适的灌胃针（15–20 g 小鼠使用 22 G）连接至 1 ml 无菌注射器，吸取酵母样品，确保排除所有气泡，并将活塞调整至 100 µl 增量。另准备一注射器无菌水用于对照小鼠灌胃，并检测是否存在污染性酵母。
  7. 用非惯用手抓取需灌胃的小鼠，用食指和拇指紧紧抓住其颈部周围的皮肤（图6A将尾部 tucked 在小指下方，以防止小鼠下身移动。确保抓握牢固，限制小鼠头部活动，以避免灌胃过程中对内部组织造成损伤。
    注意：将灌胃针沿小鼠体表放置，使针头 bulb 部位与胸骨剑突齐平，以此估算灌胃针应插入的深度。以此深度插入通常可使灌胃针的 bulb 部位进入胃内。
  8. 用惯用手将灌胃针沿小鼠口腔顶部和咽喉后部轻轻插入食道，针头方向略偏中线左侧。等待小鼠吞咽针头前端的膨大部分，并使针头继续缓慢下降至步骤 3.7 中估算的位置图6B如果在插入灌胃针时感到任何阻力，或小鼠在任何时候开始喘息，应轻轻拔出针头，并再次尝试寻找食道。
  9. 小鼠吞咽下灌胃针的球部后，轻柔推动注射器活塞，给予100 µ升（108 将酵母菌落形成单位（CFU）直接注入小鼠胃内。
    注意：小鼠在给予灌胃液后无法呕吐出任何溶液18,19，灌胃过程中可能发生反流21,37正确插入灌胃针，以及调整溶液的体积和黏度，有助于减少反流并确保给药剂量准确。
  10. 小心地将灌胃针从小鼠的胃和食道中取出，并将小鼠放回笼中。灌胃后检查小鼠呼吸和活动是否正常，以确保灌胃针在操作过程中正确插入，且无溶液被吸入。

4. 小鼠派伊尔集合淋巴结的收获与可存活酵母菌落的分离

  1. 在灌胃后适当时间点（通常为4小时），采用IACUC批准的方法处死小鼠。通过脚趾夹捏检查小鼠是否无反应，并采用颈椎脱位等辅助方法确保小鼠死亡。也可检测其他时间点，因为已有大量研究表明，颗粒穿过上皮的摄取效率和时间具有颗粒依赖性38,39。
  2. 将小鼠仰卧放置，充分暴露腹部，并用70%乙醇喷洒腹部区域进行消毒。使用剪刀横向剪开毛发和皮肤，注意不要损伤任何内部组织。手动进一步撑开切口以暴露腹膜，即覆盖腹腔器官的薄层浆膜。轻轻提起腹膜并作横向切口，以暴露肠道。
  3. 使用钝头镊子小心地将小肠从肠系膜动脉、脂肪及其他组织中分离出来。从小鼠腹部左上象限的胃部开始，一直暴露至盲肠，即大肠起始处较大的肠组织袋状结构。
  4. 通过观察小肠壁上约1–3 mm、大致呈圆形的不透明组织区域来识别派伊尔结（图7）。使用弯头解剖剪剪除派伊尔结的穹顶部分，保留边缘以确保不收集周围任何固有层组织。
    注：大多数小鼠具有4–8个清晰可见的派伊尔结。在具有直接顶部照明的区域进行操作可更易于观察派伊尔结。
  5. 将分离的派伊尔结收集至完全型Iscove改良杜尔贝科培养基（IMDM）中。
    注：必须采用无菌操作技术，并在收集培养基中添加抗生素，以防止胃肠道细菌污染酵母平板。
  6. 将派伊尔结通过40 µm细胞筛过滤以去除收集培养基。在50 ml离心管上用新鲜完全型IMDM洗涤派伊尔结，并使用1 ml注射器的推杆轻轻研磨破碎派伊尔结。在1,800 rpm条件下离心7分钟，使过滤后的细胞沉淀。吸除上清液，并将细胞重悬于约100 µl的终体积中。
  7. 将过滤后的细胞接种至选择性酵母培养基平板上，使用涂布棒均匀涂布。用Parafilm封住平板边缘，倒置于30 °C培养箱中培养2天，以促进从小鼠派伊尔结中回收的任何存活酵母的生长。
    注：从派伊尔结中回收酵母后，还需进一步研究以确认这些菌株能否向这些免疫组织递送正确折叠的异源蛋白。如2.1.14节所述，此类方法可能包括免疫印迹、ELISA或荧光显微镜检测荧光蛋白（如GFP）2,40。

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结果

在紫外线照射后生成存活曲线，需要接种稀释的酵母细胞，以确保形成可区分的单个菌落形成单位（CFU）。如上所述收集的每个500 µl样品中约含有5 × 106个细胞；然而，每块平板上若菌落数超过100个，则难以准确分辨。因此，将未稀释样品以及经紫外线照射后的细胞进行连续1:10梯度稀释后接种，可确保在每个紫外线剂量下均能准确计数CFU，如图1所示。将CFU计数值乘以稀释倍数后，再除以每个500 µl样品中最初被照射的细胞总数，即可计算出每个剂量下的存活百分比。图2展示了二倍体野生型S. boulardii细胞在0 µJ、5,000 µJ、10,000 µJ、15,000 µJ、20,000 µJ、22,500 µJ、25,000 µJ、35,000 µJ和50,000 µJ照射剂量下能够存活的百分比。这些数据形成了一条清晰的曲线，可用于确定对应50%存活率的照射剂量。

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讨论

综上所述，本文所述的实验方案详细描述了开发和测试营养缺陷型益生酵母菌株以向肠道递送异源治疗性蛋白所必需的关键步骤。对重组益生酵母进行此类操作与测试需要特定的技术和资源，而并非所有实验室目前都熟悉这些技术与资源。尽管已有大量先前研究报道了上述针对多种酵母和小鼠品系的实验方法，但据作者所知，这些方法尚未以详细且统一的形式系统呈现。此外，本论文特别强调对现有标准化实验流程进行优化，以适用于益生酵母的遗传操作——这类酵母菌株的特征表征程度通常低于常用的实验室酵母菌株。无论是用于诱变（第一部分）还是转化（第二部分）的多个实验步骤，均需针对这些二倍体益生酵母分离株的特性进行优化。本文还讨论了动物操作（第三部分）以及小肠派伊尔集合淋巴结免疫组织解剖（第四部分）过程中可能遇到的潜在问题。

由于许多工业和临床相关的酵母菌株无法立即适用于大规模遗传操作，因此首先需要构建营养缺陷型突变株等菌株，使其能够在无需昂贵抗生素的情况下进行培养和筛选。紫外线（UV）诱变是一种可快速非特异性突变营养缺陷基因的方法7,41。可轻松绘制生存曲线（图1和

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢儿童免疫学与疫苗中心以及美国国立卫生研究院新创新者奖（1DP2AI112242-01）对Tracey J. Lamb的资助。作者还感谢Natalya P. Degtyareva慷慨提供rad1 S. cerevisiae。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SmartSpec 3000 分光光度计BioRad170-2501用于测定酵母培养物细胞浓度和 OD600 的分光光度计示例
New Brunswick 滚轴式培养瓶EppendorfM1053-4004用于酵母培养孵育的滚轴式培养瓶示例
UV Stratalinker 2400Stratagene400075-03Stratalinker 示例
Stuart 菌落计数器 SC6PLUS11983044Fisher Scientific带放大功能的平板支架，当笔尖施加压力时可记录菌落数量
Scienceware 菌落计数器 F378620002Bel-Art Scienceware手持式菌落计数笔
复制平板接种装置Fisherbrand09-718-1复制平板接种架和接种垫示例 
丝绒布方块Fisherbrand09-718-2
L 形无菌细胞涂布棒 Fisherbrand14665230
鲑鱼精来源单链脱氧核糖核酸Sigma-AldrichD7656-1ML酵母 LiOAc 转化中用作载体 DNA 的示例
灌胃针头Braintree ScientificN-PK 002适用于 15–20 g 小鼠的推荐针头为 22 号（1.25 mm 球头）、1 英寸长、直型可重复使用灌胃针。对于体重超过 20 g 的小鼠，可使用 20 号或更大规格的直型或弯型灌胃针
1 ml 无菌滑动式一次性结核菌素注射器Becton DickinsonBD 309659
钝头镊子，例如 Electron Microscopy Sciences 7"（178 mm）带锯齿尖端、宽握把镊子Electron Microscopy Sciences77937-28解剖所需钝头镊子的示例 
直型和弯型解剖剪刀Electron Microscopy Sciences72966-02 和 72966-03解剖所需剪刀的示例
IMDMLife technologies12440053

参考文献

  1. Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).
  2. Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii. PloS one. 9 (11), 1-12 (2014).
  3. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Guthrie, C., Fink, G. R. , (1991).
  4. DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  6. Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 158, 113-117 (1995).
  7. Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (1), 29-34 (2013).
  8. Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. Transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (4), 1929-1933 (1978).
  9. Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA. Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).
  10. Becker, D., Guarente, L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 182-187 (1991).
  11. Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -M. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein engineering, design & selection : PEDS. 23 (4), 155-159 (2010).
  12. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. Journal of Bacteriology. 153 (1), 166-168 (1983).
  13. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioengineered bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  14. Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique. Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. BioTechniques. 30 (4), 816-831 (2001).
  16. JoVE Science Education Database. The ELISA Method. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2015).
  17. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).
  18. Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
  19. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49 (3), 329-334 (2010).
  20. Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. The rat. Animal Models in Toxicology. , 50-193 (2006).
  21. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).
  22. Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. Biology and diseases of mice. Laboratory animal medicine. , 35-133 (2002).
  23. Schulz, O., Pabst, O. Antigen sampling in the small intestine. Trends in immunology. 34 (4), 155-161 (2013).
  24. McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
  25. Farache, J., Koren, I., et al. Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation. Immunity. 38 (3), 581-595 (2013).
  26. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , Cold Spring Harbor Lab Press. (2000).
  27. Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Molecular & general genetics : MGG. 197 (2), 345-346 (1984).
  28. Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate. Genetics. 93, 51-65 (1979).
  29. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson,, Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16 (6), Chichester, England. 553-560 (2000).
  30. Singh, A., Sherman, F. Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations. Genetics. 81, 75-97 (1975).
  31. Singh, A., Sherman, F. Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast. Journal of Bacteriology. 118 (3), 911-918 (1974).
  32. McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).
  33. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
  34. Zhang, Z., Chisti, Y. Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae. Science. 14 (4), 401-435 (1996).
  35. Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
  36. Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast. 14, 565-571 (1998).
  37. Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review). Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).
  38. Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size. Pharma. 13 (12), (1994).
  39. Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery. Expert opinion on drug delivery. 1 (1), (2004).
  40. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921(2013).
  41. Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis. Applied and environmental microbiology. 71 (1), 312-319 (2005).

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