本文介绍了一套统一的方法，可用于开发、转化、施用和检测益生酵母Saccharomyces boulardii的异源蛋白表达。
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摘要
摘要
开发重组口服疗法可更直接地靶向黏膜免疫系统，增强对抗胃肠道疾病的能力。尤其将益生酵母改造用于此策略具有多项优势。这些菌株不仅能够合成多种复杂的异源蛋白，还能在通过肠道的过程中存活并保护这些蛋白。然而，该策略需要掌握多种通常不常联合使用的实验室技术。此外，尽管常用实验室菌株的酵母转化单个实验方案已有充分表征，但本文重点在于替代性方法，并强调针对特征尚不明确的益生酵母菌株优化转化条件的重要性。详述这些方法将有助于推动关于如何最佳测试益生酵母作为口服药物递送载体的讨论，并促进这一新型胃肠道治疗策略的发展。
引言
益生菌微生物是一种颇具前景的、可高效且经济地将异源蛋白递送至胃肠道的潜在手段。这类微生物能够耐受胃肠道的通过环境，但不会在其内定植1，从而实现可控剂量给药，并限制机体对所表达药物的暴露。此外，这些微生物易于进行遗传改造，可大规模生产异源蛋白，使其成为合成递送颗粒的一种经济替代方案。然而，此类方法的开发——正如近期利用益生酵母Saccharomyces boulardii的营养缺陷型菌株所展示的那样2——需要掌握通常不在同一研究中结合使用的多种实验技术，涵盖从酵母与分子生物学到动物操作技术及免疫学方法等多个领域。因此，尽管本文所述各项具体操作本身并非新颖的实验方案，但本论文的目标是系统性地介绍以小鼠胃肠道为靶点、评估益生酵母作为药物递送载体时所需的关键实验技术。本文提供了一套核心实验流程，包括：1）构建易于遗传操作的酵母营养缺陷型突变菌株；2）转化酵母以表达异源蛋白；3）通过口服灌胃将重组酵母递送至小鼠肠道；以及4）从小鼠肠道中回收具有活性的重组益生酵母，并检测其异源蛋白的表达水平。
首先，尽管目前存在多种用于酵母菌种操作的正向和负向筛选方法，但使用营养缺陷型标记等负向筛选方法能够显著提高酵母转化和筛选的效率与便捷性。相比之下，利用抗生素进行转化子的正向筛选会大幅增加酵母操作的成本。此外，在含抗生素的固体培养基上筛选酵母时，相较于在缺乏必需营养成分的合成限定固体培养基上筛选营养缺陷型酵母，未转化的背....
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方案
1. 紫外线诱变法构建营养缺陷型酵母菌株
- 生成生存曲线以确定所需的紫外线照射剂量
- 制备YPD（酵母提取物蛋白胨葡萄糖）培养基及其他所列试剂 表1 按照标准操作程序26 并挑取单菌落接种于5-10 ml YPD培养基中。将培养物置于30℃摇床中培养 °C O/N 至少饱和8小时。
- 使用分光光度计测定过夜培养物的细胞浓度，方法为将细胞在塑料比色皿中以水按1:10比例稀释。将细胞稀释至浓度为107 细胞/ml，溶于20 ml无菌蒸馏水中。
- 将稀释后的细胞倒入无菌塑料培养皿中，移去皿盖，将培养皿置于紫外灯下方14 cm处。
- 将细胞暴露于连续的5,000 µJ 和 10,000 µJ 剂量的紫外线照射，提取 500 µ每次增加后取 l 量细胞，使细胞在暴露于 0 后被取样 µJ, 5,000 µJ，10,000 µJ, 15,000 µJ，20,000 µJ, 25,000 µJ, 30,000 µJ, 40,000 µJ，和 50,000 µ紫外照射的 J。将提取的细胞样品转移至无菌的 1.5 ml 离心管中，并用无菌水按 1:10 梯度依次稀释。
- 将各稀释度的菌液在微量离心机中以16,00....
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结果
在紫外线照射后生成存活曲线，需要接种稀释的酵母细胞，以确保形成可区分的单个菌落形成单位（CFU）。如上所述收集的每个500 µl样品中约含有5 × 106个细胞；然而，每块平板上若菌落数超过100个，则难以准确分辨。因此，将未稀释样品以及经紫外线照射后的细胞进行连续1:10梯度稀释后接种，可确保在每个紫外线剂量下均能准确计数CFU，如图1所示。将CFU计数值乘以稀释倍数后，再除以每个500 µl样品中最初被照射的细胞总数，即可计算出每个剂量下的存活百分比。图2展示了二倍体野生型S. boulardii细胞在0 µJ、5,000 µJ、10,000 µJ、15,000 µJ、20,000 µJ、22,500 µJ、25,000 µJ、35,000 µJ和50,000 µJ照射剂量下能够存活的百分比。这些数据形成了一条清晰的曲线，可用于确定对应50%存活率的照射剂量。
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讨论
综上所述，本文所述的实验方案详细描述了开发和测试营养缺陷型益生酵母菌株以向肠道递送异源治疗性蛋白所必需的关键步骤。对重组益生酵母进行此类操作与测试需要特定的技术和资源，而并非所有实验室目前都熟悉这些技术与资源。尽管已有大量先前研究报道了上述针对多种酵母和小鼠品系的实验方法，但据作者所知，这些方法尚未以详细且统一的形式系统呈现。此外，本论文特别强调对现有标准化实验流程进行优化，以适用于益生酵母的遗传操作——这类酵母菌株的特征表征程度通常低于常用的实验室酵母菌株。无论是用于诱变（第一部分）还是转化（第二部分）的多个实验步骤，均需针对这些二倍体益生酵母分离株的特性进行优化。本文还讨论了动物操作（第三部分）以及小肠派伊尔集合淋巴结免疫组织解剖（第四部分）过程中可能遇到的潜在问题。
由于许多工业和临床相关的酵母菌株无法立即适用于大规模遗传操作，因此首先需要构建营养缺陷型突变株等菌株，使其能够在无需昂贵抗生素的情况下进行培养和筛选。紫外线（UV）诱变是一种可快速非特异性突变营养缺陷基因的方法7,41。可轻松绘制生存曲线（图1和
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢儿童免疫学与疫苗中心以及美国国立卫生研究院新创新者奖（1DP2AI112242-01）对Tracey J. Lamb的资助。作者还感谢Natalya P. Degtyareva慷慨提供rad1 S. cerevisiae。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SmartSpec 3000 分光光度计 | BioRad | 170-2501 | 用于测定酵母培养物细胞浓度和 OD600 的分光光度计示例 |
| New Brunswick 滚轴式培养瓶 | Eppendorf | M1053-4004 | 用于酵母培养孵育的滚轴式培养瓶示例 |
| UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075-03 | Stratalinker 示例 |
| Stuart 菌落计数器 SC6PLUS | 11983044 | Fisher Scientific | 带放大功能的平板支架，当笔尖施加压力时可记录菌落数量 |
| Scienceware 菌落计数器 | F378620002 | Bel-Art Scienceware | 手持式菌落计数笔 |
| 复制平板接种装置 | Fisherbrand | 09-718-1 | 复制平板接种架和接种垫示例 |
| 丝绒布方块 | Fisherbrand | 09-718-2 | |
| L 形无菌细胞涂布棒 | Fisherbrand | 14665230 | |
| 鲑鱼精来源单链脱氧核糖核酸 | Sigma-Aldrich | D7656-1ML | 酵母 LiOAc 转化中用作载体 DNA 的示例 |
| 灌胃针头 | Braintree Scientific | N-PK 002 | 适用于 15–20 g 小鼠的推荐针头为 22 号（1.25 mm 球头）、1 英寸长、直型可重复使用灌胃针。对于体重超过 20 g 的小鼠，可使用 20 号或更大规格的直型或弯型灌胃针 |
| 1 ml 无菌滑动式一次性结核菌素注射器 | Becton Dickinson | BD 309659 | |
| 钝头镊子，例如 Electron Microscopy Sciences 7"（178 mm）带锯齿尖端、宽握把镊子 | Electron Microscopy Sciences | 77937-28 | 解剖所需钝头镊子的示例 |
| 直型和弯型解剖剪刀 | Electron Microscopy Sciences | 72966-02 和 72966-03 | 解剖所需剪刀的示例 |
| IMDM | Life technologies | 12440053 |
参考文献
- Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).
- Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al.
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重印与许可
