计算机断层扫描和成骨血管生成耦合光学成像评估头盖骨自体移植和移植物的整合

摘要

自体和异体骨移植物植入构成接受的方法来治疗严重颅面骨量丢失。然而接枝组合物对新血管形成，细胞分化和骨形成之间的相互作用的影响还不清楚。我们提出的目的是阐明血管生成骨形成相互依存的移植接近一个多模式成像协议。

摘要

一个主要参数确定一个骨移植过程的成功是包围接枝的区域的血管形成。我们假设一个植骨的是植入会诱发更大的骨再生的丰富的血管形成。调查接枝的对新血管形成在缺损部位的影响，我们开发了一种显微计算机断层摄影术（μCT）的方式来表征新形成的血管，其包括具有聚合的造影剂的动物的全身灌流。该方法，能够将其全部器官的血管详细分析。另外，血液灌注是使用血源性荧光剂的荧光成像（FLI）评估。骨的形成是使用羟基磷灰石针对性的探头和μCT分析FLI量化。干细胞募集是由转基因小鼠的生物发光成像（BLI），该表达骨钙蛋白启动子控制下的萤光素酶进行监测。这里，我们描述和展示制备的同种异体移植物的，颅骨缺损手术，对于新血管形成的研究和骨形成分析（包括体内灌注造影剂），并且协议进行数据分析的μCT扫描协议。

脉管系统的三维高分辨率分析表明在动物中植入自体移植显著更大的血管生成，特别是相对于小动脉的形成。因此，血液灌流是由^第 7天手术后显著高于自体移植小组。我们在接受自体移植动物中观察到优越的骨矿化和测量更大的骨形成。自体移植诱导驻留干细胞募集到移植物宿主骨缝线，其中所述细胞分化成的^第 7和第¹⁰日术后天之间骨形成细胞。这一发现意味着，增强骨形成可能是由于扩充血管饲养的特点自体植入。该方法的描述可作为研究骨组织再生紧密界骨骼的形成和新生血管方面的最佳工具。

引言

颅面骨量丢失，由于外伤，肿瘤切除，开颅减压术，先天性缺陷很少治愈本身，并提出了明确的未满足的临床需求。自体骨移植物和同种异体骨移植物被广泛地用于治疗这些病症^1。

它已被广泛接受的成骨紧密结合与血管生成^2,3。因此，提出了治疗骨再生的完整研究应包括血管树整个缺损部位形成的一个全面的调查。有几种可用的方法研究模型来刻画血管。血管树可以通过组织学分析进行调查。自组织学依赖于切片的组织，存在所得到的图像将被扭曲的可能性高。为了解决这个问题，活体显微镜可以执行将图像的完好的血管^4;然而，这种方法是限制在一个平面上成像。从灌注造影剂的动物获取的样品μCT扫描允许饲料再生网站⁵血管网络的3D影像。这种方法允许器官的脉管作为一个整体的一个非常详细的示范，以及血管分布的细致的分析。此外，μCT使多样直径血管，这表征血管的不同亚型之间的分化。

我们假设一个颅骨自体的该植入会诱发比同种异体移植物的植入更大新血管形成，而这增加了新血管形成将导致反过来增强骨formation.To追求这一假设，我们所采用的各种技术。我们通过执行μCT为基础的分析研究了新成立的血管树的模式。我们用血池荧光探针测量血液灌注。接下来，我们的驴SED骨组织矿化羟基磷灰石定向探头和μCT分析FLI。最后，我们监测干细胞招募和分化，在将荧光素酶表达在骨钙素阳性细胞的转基因小鼠进行的BLI。

方案

该协议遵循耶路撒冷，以色列（申请号MD-12-13524-4），经批准AAALAC设施和由雪松 - 西奈医学中心的希伯来大学的体制动物护理和使用委员会（IACUC）的指导方针IACUC（申请号3770）。这些动物是在严格遵守美国国立卫生研究院的指导方针进行处理。

1.准备骨移植物

1. 安乐死7〜8周龄的Balb / C小鼠，或任何应变来自受体不同，使用的_CO 2的吸入或腹腔注射50微升苯巴比妥（65毫克/毫升; 100毫克/千克）的标准方法。确认没有心跳并执行颈椎脱位。可替代地，从已被保存在-20℃，收获前解冻屠体收获了同种异体移植。
2. 用理发推子，把它应用逆着毛发生长的方向剃须颅骨区域。通过将70％消毒尸体头部isopropano湖使用11号手术刀切开头皮及去除骨膜。
3. 用牙钻和4.5毫米内径的环钻，分离颅骨的圆形片段。转移骨片段含有无菌盐水的100毫米的塑料培养皿中。此时，观察血并附着到骨片段（图1A）的软组织。从22供体获得骨碎片以这种方式。
4. 容纳一个骨碎片，在采用弧形镊子时间。擦拭它彻底用棉签取出所有的脑组织，软组织和血液（ 图1B）。轻轻地切掉了保持连接到用细剪的移植，使移植物将有一个完美的圆形任何碎骨片。
5. 在一个15毫升管含有70％的乙醇和含磷酸盐缓冲盐水洗两次乙醇在15ml试管浸各接枝一次。
6. 冻结在-80℃的冰箱中的移植在冷冻管在至少1周。在这一点上，确保移植是透明（ 图1C）。

2.颅骨缺损手术

1. 对于收件人使用的表达骨钙素子⁶控制下的荧光素酶的转基因小鼠。
2. 消毒的使用玻璃珠加热器30秒的外科手术工具的末端。转移到含有70％的异丙醇保持无菌条件罐子的工具。使用无菌手套。
3. 通过腹膜内注射氯胺酮一个美托咪定的混合物（75毫克/公斤和1毫克/千克，分别）的麻醉一个7〜8周龄的雌性小鼠。捏动物的肢体，以确保其深度麻醉。不要让动物无人看管，直到它重新获得足够的意识，以保持胸骨斜卧。
4. 通过将它逆着毛发生长的方向剃须用理发推子的颅骨区域。适用于毛发去除霜，以消除任何残余的皮毛和擦拭AFTEř使用干纱布随后盐水浸泡的纱布不超过2分钟。应小心，以避免在眼睛上。另外，兽医眼膏可先脱毛应用为保护眼睛额外的一层。当务之急是的脱毛霜所有痕迹，以避免过度暴露于化学试剂可能刺激被除去。通过将5％的氯己定（图1D）消毒头皮。
5. 注入皮下5mg / kg的卡布洛芬稀释在200μl盐水中。应用兽医眼药膏，以防止干燥和保持动物在任何时候一个散热垫。定位在操作望远镜的动物。
6. 请用细剪刀和镊子（ 图1E）1厘米长的椭圆形切割的头皮。按住采用弧形镊子骨膜切除用细剪刀。
7. 用牙钻钻颅骨缺损2毫米前到人字缝第二一块5mm外径环钻（图1F 和G）。为了避免硬脑膜渗透，钻四分之三的方式进入骨和使用刮刀分离骨片段。
8. 植入自体，获取的骨头碎片和含有10ml无菌盐水，清除杂物10毫米塑料板清洗。不要取出软组织。植入同种异体移植物，解冻提前​​同种异体移植物，并将其标准化至室温，然后再清洗。
9. 放置植骨采用弧形镊子，所以它不会触及缺陷利润率（ 图1H）的缺陷。胶接枝使用纤维蛋白胶宿主骨（5微升46毫克/毫升纤维蛋白原，用5微升25单位/毫升凝血酶混合）。
10. 缝合使用4-0薇乔缝合（图1I）的皮肤。应用聚维酮碘的手术切口。应注意，以防止缝合线的污染毛皮。马克小鼠耳，注入0.25毫克/千克Antisedan牛逼Ø扭转美托咪定的麻醉效果。
11. 如果动物没有在10分钟内醒来，确保它坐落在一个温暖垫。注入200μl的无菌盐水，并在需要时注射0.1毫克/公斤Antisedan。不返回已经历手术给其他动物的公司，直到完全恢复的动物。
12. 请分开的笼中的动物了一个星期，以防止他们打开缝线。放置小鼠食物在水中浸泡在培养皿上的箱地板几天术后。注入皮下200微升手术来治疗手术后疼痛后在无菌盐水每天一次稀释3天1mg / ml的溶液卡洛芬。

图1.颅骨同种异体制备和颅骨缺损外科的骨片段从颅骨区域 （A）中分离。软组织，骨髓和血液被擦拭（B）和接枝漂洗在70％乙醇，随后通过洗涤两次在磷酸盐缓冲盐水（C，AG =同种异体移植物）。收件人鼠标在颅盖区域（D）的手术用剃须和皮肤消毒制备。一个椭圆形的切口在头皮皮肤创建，骨膜被除去（E）。接着，颅骨缺损是使用5毫米直径的环钻（F）的钻孔。骨片段是使用勺形刮刀拆下，留下上矢状窦完好（G）。同种异体移植物，然后放置在缺陷，并使用纤维蛋白胶（H）的固定。最后，皮肤缝合（ 我 ）。 请点击此处查看该图的放大版本。

3.微计算机断层扫描的表征血管树

1. 准备肝素生理盐水。重量2000ü肝素钠，并将其放置于50ml的塑料管。加入20 5ml盐水，摇匀管。填有20毫升的Luer锁注射器用15ml温热肝素生理盐水和注射器连接到一个23-G的头皮静脉集。加盖注射器到注射器泵，并将其设置为泵10混合物在1毫升/分钟。
2. 稳重一个使用腹膜内注射50μl的苯巴比妥（65毫克/毫升; 100毫克/千克）的小鼠。捏动物的肢体，以确保它深深地镇静剂。固定鼠标在它的后面，以一个固定板包裹有吸收性表面衬套（ 图2A）。将鼠标固定在通风橱中，以防止人员暴露在烟气。
3. 切从腹部到使用细剪刀和镊子（图2B）的颈部皮肤。切开腹壁到剑突（图2C）。切割沿其横向方面的肋笼。避免伤及肺部的ð心脏，并确保心脏完全暴露。使用止血钳缩回胸骨（图2D）。
4. 插入蝴蝶针3毫米到左心室（图2E）。胶针用3秒胶（ 图2F）的心脏和胸壁。
5. 立即启动泵。一分钟后，解剖下腔静脉，以减压的血管（ 图2G）。倾斜板，使液体将流入远离头部。成功的灌注将导致清除肝脏和血管。
6. 当肝素盐水灌注完成，灌注10毫升4％的甲醛。避免气泡渗入脉管并避免接触到的甲醛气体。成功的甲醛灌注会导致加劲的尾巴。冲洗用肝素化食盐水10ml甲醛。
7. 根据厂家专业制备不透射线的造影剂urer说明。通常情况下，这将需要的化合物，稀释剂和固化剂的混合。使用血清移液管，混合在15毫升塑料管的解决方案。
8. 以1毫升/分钟的速率灌注与造影剂的混合物的动物。观察冠状动脉，肠和肝脏的血管，并确保他们是枯黄的2灌流后- 3毫升，表示成功灌注（ 图2H）。当灌注完成后，切蝴蝶针的管子，独自一人获得了尸体，并用卫生纸包起来，以防止解决了颅骨区域的泄漏。允许聚合在4°CO / N。
9. 解剖颅骨区域（ 图2I）;首先用手术刀切开皮肤横向越好，避免损伤感兴趣的颅地区。找到骨移植，然后用细剪刀剪开颅骨骨10 mm处的移植。
10. 扫描隔离CALV使用μCT扫描仪宋体骨骼样本;设定的视野到20.5毫米，55 kVp的X射线能量，145微安强度，使用每360°和积分时间的200毫秒1000突起。调整μCT参数⁷图像其他骨缺损模型。
11. 观察由μCT软件中生成的2D重建的切片。确保扫描感兴趣的区域是正确的，然后找到了颅骨缺损。评估灌注的质量。成功鉴定血管（图2J）后，继续和脱钙使用6％三氯乙酸（TCA）稀释在双蒸水（DDW）的样品。
12. 重新扫描使用第3.10节所示的参数样本。定位所重建的二维切片的人字缝。定义在2mm和直径8mm高度的兴趣（VOI）的圆柱形体积，即正切于缝合 - 这是缺陷的解剖部位。
13. 段次鄂骨组织使用一个全局阈值方法软组织;较低的门槛设置为130，并应用约束的3D高斯滤波器（SIGMA] [σ= 2.0，并支持= 2）部分的体积抑制噪声。生成一个三维重建，并确保VOI正确定位（ 图2K）。
14. 生成使用IPL软件和"dt_object_param" 功能 （图2L）的厚度地图。
    注:该函数描述了容器体积为每个血管直径。

图2.通过灌注心脏的方法使用的是不透射线剂，鼠标被固定到固定板（A）中，与皮肤沿腹部到颈部（B）的切断。腹壁沿着内侧排队至剑突PROCE切分类（C），以及胸廓横向（D）的切割。甲蝶针插入左心室，避免插入右心室，这是明显更暗（E中，右心室是由白虚线表示），并且针固定到心脏和胸腔壁（F）的 。肝素化的盐水（2-3毫升）泵入到心脏，并且下腔静脉解剖（G，白色箭头表示下腔静脉）。甲醛（4％），灌注和冲洗掉;这之后是黄染无线电不透明造影剂的灌注。成功灌注将明显受血管，从而改变颜色，黄色（H）的间隙。聚合后，颅盖区域分离（Ⅰ，AG =同种异体移植物），并用μCT扫描器，以确认正确的灌注（J，感兴趣卷被用橙色）成像。该样品脱钙和重新扫描（K），接着是生成的彩色厚度图（L）。 请点击此处查看该图的放大版本。

骨矿化和血液灌注4.荧光成像

1. 重构探针的2纳摩尔/ 100微升的PBS在1.5ml管中的浓度（使用二膦酸 - 共轭荧光探针来监测骨矿化和血源性荧光剂来测量血液灌注）。吸管轻轻几次，以确保探针的均质溶解。
2. 指定的成像会议之前24小时取一次零的图像;麻醉用2升/分​​钟吸入100％医疗级氧的感应腔室补充有3％异氟醚的3只小鼠。经过适当的麻醉已经建立，降低异氟烷浓度为1.5％ - 2％。
3. 应用兽医眼药膏，以防止干燥，并确保散热垫接通时刻。捏动物的肢体，以确保其深度麻醉。不要让动物无人看管，直到它重新获得足够的意识，以保持胸骨斜卧。
4. 用理发推子应用它逆着毛发生长的方向剃须颅骨区域。删除使用毛发去除霜毛皮残余。任何皮草残留会干扰光学成像。取出用细剪刀和镊子缝线。
5. 放置三只动物在IVIS阶段加热到37℃，每个成像会话。置的曝光时间，以自动，查看字段至C，并调整过滤器。 例如，对于二膦酸-共轭荧光探针，其特征与最大激发在680纳米的光波长，使用675纳米的激发滤光片和经Cy5.5的发射滤波器。同样地，使用的是血源性荧光剂，峰值激发时在光波长750nm的使用的710纳米的激发滤光片和780nm的发射滤光片。
6. 图像通过按"获取"按钮生活图象软件的小鼠。确保颅骨区域完全可见（ 图3B）对于一个全面的指南劝廉等人 ²⁰⁰⁹年8月。
7. 让老鼠清醒吸入100％的氧气。
8. 通过静脉注射尾注入2纳摩尔荧光探针。在指定的成像会议，如上所述进行成像。

5.微型计算机断层扫描用于骨骼再生

1. 用于骨形成的定量，麻醉小鼠通过吸入3％异氟烷的，如在步骤4.2中描绘 - 4.3。传输鼠标的μCT扫描仪床上，并将其放置在扫描仪上。
2. 设置μCT扫描器的x射线管势能到55 kVp的和为145微安中等分辨率强度。使用的视图20.5 mm的场中，执行侦察员（单个X射线）扫描和定义从鼠标的眼睛延伸到它的头骨的背面感兴趣的区域。进行CT扫描，使用每200毫秒360°和积分时间1000的预测。
3. 重建使用20μm的标称空间分辨率的二维切片。对齐缺陷利润率使用μCT软件⁹标准化的位置。
4. 类似于步骤3.20中，定义感兴趣的圆柱形体积并应用约束三维高斯滤波器（σ= 0.8和支持= 1），以部分地抑制在卷噪声。段从利用全局阈值的过程的软组织的骨组织。
5. 确定矿化骨组织在感兴趣体积的体积。

干细胞招募和分化6.生物发光成像

1. 准备鼠标成像所描绘的第4.2-4.4和清醒小鼠吸入100％的氧气。
2. 辖126毫克/千克甲虫荧光素经由腹膜内注射各小鼠，并返回动物给感应腔室。 2分钟后，麻醉用3％异氟烷的动物。放置在IVIS小鼠温热阶段。
3. 通过活影像软件，将曝光时间设置为"自动"，并且视场为C.图片荧光素给药后小鼠5分钟。图像如在步骤4.6中描述的动物，使用"生物发光"模态定义感兴趣的区域，因为小鼠之间的转基因表达变化。规范化颅骨信号到尾。

结果

新血管形成通过μCT体积分析和通过FLI使用荧光血源性剂量化血液灌注进行评估。手术后七天，μCT扫描证实在已经收到自体比在已经收到移植从C57BL / 6（图3A）收获小鼠小鼠显著更高体积的中小直径的血管。有趣的是，移植组中新形成的血管树似乎达到整个缺陷区域，而同种异体移植组中的血管出现穿透从外边缘缺损部位和向内延伸到仅在有限的程度。所述FLI支持了这一观察，示出显著较高血液灌注移植处理的动物（图3B）。通过^第 14天，同种异体移植组中的血管树达成的所有接枝的接近的，但容器体积是显著下比较到移植组中大多数血管直径，我们检查（图3C）。注:当船只0.08- 0.1毫米直径，比较容器体积差异最为突出。手术后二十八天脉管卷回到基线（图3D）。

手术后七天，FLI执行使用羟基磷灰石直接的探针表现出更大的显著骨矿化的移植组（图4A）在。到那个时候，骨骼已经遍布在自体植入动物的移植物接近形成。与此相反，在...

讨论

这里描述的多模成像方法的目的是为了使血管发生成骨轴的颅骨移植的上下文细致的调查。使用μCT协议，这使得血管树的准确高分辨率三维演示喂养整个颅骨缺损新生血管成像。 μCT数据可以使用先进的工具，如IPL的软件很容易分析。例如， 在图3C中示出的厚度的分析显示，自体颅和同种异体移植物之间的主要差别是在容器为0.1至0.08毫米的直径，其表征血液动脉^10。这一结果与在长骨模型¹¹进行的研究是一致的。应当指出的是，直径0.02毫米的最窄可检测船舶不充分，由于不透射线剂的粘度铸造。这种方法的主要缺点是，它需要的事实安乐死的动物，因此，纵向成像是不可能的。几个无线电不透明探头可用于体内血管μCT成像;然而，它们不是作为不透射线的稠密聚合探针，并且图像分辨率不符合由这里¹²所示的离体方法中提供。 μCT分辨率是有限的，并不会是研究血液的毛细血管，例如有用。除此之外，由一个熟练的手辅助该方法提供了一个可再现的技术，研究骨脉管的细节。

在所描绘的协议中的一个关键步骤...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/C 小鼠	Harlan 实验室	57
FVB/n 小鼠	Harlan 实验室	862
苯巴比妥	West waro	NDC 0641-0477-25
啮齿动物理发器	Wahl 动物	8786-451A
手术刀 11	Miltex	27111504
牙科微型电机	马拉松 III
5 毫米环钻	精细科学工具	18004-50
脱毛霜	Veet
KetaVed（氯胺酮）	Vedco	NDC 50989-996-06
Domitor	Zoetis	NADA 141-267
卡洛芬	Norbrook	02000/4229
眼膏	Puralube	NDC 17033-211-38
作双筒望远镜	Kent scientific	KSCXTS-1121
精细剪刀	精细科学工具	14060-11
曲线镊子	精细科学工具	11274-20
勺形刮刀	精细科学工具	10090-13
Tisseel Fibin 凝胶套件	Baxter	718971
针架	精细科学工具	12060-01
vicryl 缝合线 4-0	Ethicon	J392H
Antisedan	Zoetis	NADA#141033
肝素	Sigma	H3393
20 ml luerlock	BD	302830
23G 头皮静脉套装 （蝶针）	BD	367342
止血器	精密科学工具	13008-12
注射泵	哈佛仪器	PHD 2000
3 秒凝胶胶	苏格兰
啮齿动物解剖板	Leica	38DI02313
Microfil MV-122	flow-tech	MV-122
μCT40 扫描仪	Scanco	μCT40
TCA6%	Sigma	T6399
Osteosense 680	PerkinElmar	NEV10020EX
Angiosense750	PerkinElmar	NEV10011
Oxigen 100% 医用级
异氟烷（呋喃烷）	Baxter	1001936040
IVIS 动力学	Xenogen
甲虫荧光素	Promega	E160A