柱后衍生用反应流高效液相色谱柱

Summary

Abstract

Introduction

再加上柱后衍生（PCD）的高效液相色谱（HPLC）是一个强大的工具，是在分析实验室解决的一些问题是有用的。它可用于检测与该套件可用^1,2-探测器否则不可检测的化合物，增加目标分析物，这允许检测和定量^3-5的下限或选择性的信号衍生的靶分析物，以避免基质效应^6。常用的PCD反应包括胺类，如氨基酸的反应中，用邻- phthaladehyde ^7-9，茚三酮^9,10-或荧光胺^11,12，活性氧的衍生（ROS）与2,2-二苯基1- picrylhydrazil自由基^{（DPPH•）13,14}或2,2'-连氮基-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸^{（ABTS）15,16，}以及使用碘化物叠氮化物试剂的衍生化磺丙ontaining化合物^17,18。

有，但是，众多的缺点使用PCD反应的高效液相色谱系统^6。在这些主要是添加衍生试剂（S）和所述检测器，其允许时间用于混合和发生⁸反应的点之间的使用反应线圈。这些反应环路通常具有500微升或更多，相对于HPLC系统¹⁹的其余部分的容积是显著的卷。使用这些高容量的反应循环中增加的峰加宽的结果相比，现在将未经反应环的存在下观察到的。这将导致在具有定量和检测的更高的限制更短，....

Protocol

注意:请参考所有材料和试剂材料安全数据表（MSDS）使用前（ 即 MSDS甲醇）。处理溶剂和高效液相色谱法（HPLC）洗脱时，确保使用的所有适当的安全措施。确保适当使用高效液相色谱仪，分析天平和检测仪器仪表工程控制，保证使用个人防护用品（防护眼镜，手套，实验室外套，全长裤，封闭趾鞋）。

注意:此协议描述了特定于感兴趣的化学化合物的性质不同的试剂反应流柱后衍生的3种方法（RF-PCD）技术，每个。对于ROS的分析去一节"1. ROS的检测用^DPPH•"，对于伯胺见的分析"2.检测使用荧光胺伯胺的"，而对酚类化合物的分析，去节"3 。酚的检测使用4 aminoantipyrene和铁氰化钾"，用超纯水（ 如 Milli-Q水）全程。

注意:射频柱的连接是在几乎相同的方式与主要差别是端部装配件的一个射频列的数目的常规HPLC柱来实现。用于连接标准HPLC柱的HPLC系统接头能够被用于一个射频柱连接到HPLC系统。

1. ROS的检测用^DPPH•

1. 设置HPLC仪器的
   1. 制备具有A线100％的水和B线100％甲醇作为流动相的高效液相色谱仪。吹扫泵按照制造商的要求。
   2. 设置HPLC仪器组件和如在图4A中所示的附加 ​​衍生泵。
   3. 设定UV-Vis检测在520纳米....

Results

这是适于通过射频PCD使用第一PCD方法是使用2,2-二苯基-1- picrylhydrazil自由基^{（DPPH•）24}抗氧化剂的衍生。此反应通过Koleva 等人介绍了 ^25，并一直被广泛使用。检测依赖于^DPPH•的脱色活性氧的存在下自由基，因此在观察到的吸光度的下降的抗氧化剂的结果存在。的^DPPH•反应经常采用500微升或更^13-15的大反应循环，但人们发现，使用RF-PCD柱时需要进行无反应循环。 图5示出的短萃取浓缩咖啡的咖啡的样品的两个色谱使用衍生DPPH自由基^•用常规PCD和RF-PCD仪器。

已适于通过射频PCD使用第二PCD方法是德使用荧光胺作为衍生化试剂²³四个氨基酸（甘氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸和色氨酸）ivatization。该方法是从工作适于通过Udenfriend 等人 ^11，

Discussion

RF-PCD允许与HPLC流出柱后衍生化试剂在不使用反应线圈的有效混合，减少频带加宽的影响，并提高分离性能。的RF-PCD方法也示于相对于检测方法的信号响应的改善。 Camenzuli 等 ²⁸是第一个报道的意式咖啡样品中^DPPH•使用反应流列用于检测ROS的。他们的研究中所涉及的分析和射频条件的优化，以达到最大的性能，测试了一系列的^DPPH•浓度与各种^DPPH•试剂流速。得出的结论是0.1毫克毫升^-1 0.5毫升min的^DPPH•试剂流速^DPPH•浓度^-1为最佳下的RF-PCD的改进的分离性能（ 即 ，效率和灵敏度）相比的^DPPH•衍生常规的PCD法的条件。 图5示出了利用^DPPH•抗氧化剂的测定浓咖啡样品中的两个色谱。特别有趣的是具有约5分钟的保留时间的高强度峰。由此可以看出，使用500微升反应循环，这是典型的传统的^DPPH•

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC 仪器	Agilent	1290 系列 HPLC
衍生化系统用附加泵	岛津	LC-20A
RF 色谱柱			非商用
PEEK 管	Sigma Aldrich	Z227307
色谱柱塞			随附色谱柱
PEEK 切管	SigmaAldrich	Z290882
分析天平			4点分析天平
秒表			非科学设备
洗脱液收集瓶			任何平底的小样品瓶都可以，例如 HPLC样品瓶
HPLC样品瓶			将取决于所使用的仪器
用于流动相和衍生化溶液的容器Sigma	Aldrich	Z232211
通用实验室玻璃器皿			容量瓶、移液瓶、等 数量和体积取决于样品制备方法。
甲醇	Sigma Aldrich	34860
DPPH	Sigma Aldrich	D9132
乙酸铵	Sigma Aldrich	17836
氨	Sigma Aldrich	320145	腐蚀性
乙腈	Sigma Aldrich	34998
氟虫	Sigma Aldrich	F9015
4-氨基安替芘	Acros Organics BVBA	AC103151000
铁氰化钾	型号	B10204-30