使用反应流高效液相色谱柱进行柱后衍生化

摘要

本文介绍了一种使用反应流高效液相色谱柱进行柱后衍生化（PCD）方法的实验方案。

摘要

本文介绍了一种使用反应流高效液相色谱柱进行柱后衍生化（PCD）方法的操作方案。将PCD技术应用于现代高效液相色谱系统和色谱柱时，主要难点在于需要使用大体积的反应圈，以实现试剂混合并完成衍生化反应。这种较大的柱后死体积会导致谱带展宽，从而降低实际观测到的分离效率，并影响检测灵敏度。在反应流柱后衍生化（RF-PCD）技术中，衍生化试剂被反向泵入反应流色谱柱的其中一个或两个外侧端口，与色谱柱流出液在柱端接头内含有的烧结片（frit）结构中混合。该技术可实现流出液与衍生化试剂更高效的混合，从而显著减小甚至完全消除反应环所需的体积。研究发现，RF-PCD方法在分离效率和信噪比方面优于传统的PCD方法。RF-PCD技术的另一优势在于，可同时监测中心端口流出的未衍生化状态的流出液。目前RF-PCD仅在相对有限的一类柱后反应中进行了试验，但尚无证据表明该技术不能适用于现有的任何单组分或双组分（前提是两种试剂同时加入）柱后衍生化反应。

引言

高效液相色谱法（HPLC）与柱后衍生化（PCD）联用是一种强大的工具，在分析实验室中可用于解决多种问题。该方法可用于检测那些使用现有检测器组合难以检测的化合物^1,2，增强目标分析物的信号，从而实现更低的检测限和定量限^3-5，或选择性地对目标分析物进行衍生化以避免基质效应⁶。常见的PCD反应包括：胺类物质（如氨基酸）与邻苯二甲醛^7-9、茚三酮^9,10或荧光胺^11,12的反应；活性氧（ROS）与2,2-二苯基-1-苦基肼自由基（DPPH^•）^13,14或2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）^15,16的衍生化反应；以及使用碘化物-叠氮化物试剂对含硫化合物进行衍生化^17,18。

然而，将柱后衍生化（PCD）反应与高效液相色谱（HPLC）系统联用存在诸多缺点⁶。其中最主要的问题是在衍生化试剂添加点与检测器之间需使用反应管路，以提供试剂混合和反应所需的时间⁸。这些反应环路的体积通常达到500 µl甚至更大，与HPLC系统的其余部分体积相比不可忽视¹⁹。使用大体积反应环路会导致峰展宽加剧，相较于无反应环路时的情况更为明显。这将产生更矮、更宽的色谱峰，使定量限和检测限升高，并对色谱分辨率产生负面影响。图1和图2展示了加入不同体积的柱后反应环路后峰形劣化的现象。本分析采用的流动相组成为94%甲醇和6% Milli-Q水，流动相流速为1 ml/min，进样体积为20 µl，检测波长为265 nm。在色谱柱与检测器之间插入了死体积从20 µl到1,000 µl不等的管路，以模拟PCD方法中反应环路死体积的影响。这些管路由内径为0.5 mm的不锈钢管制成。实验所用HPLC系统包括控制器（SCL-10AVP）、低压梯度阀（FCL-10ALVP）、泵（LC-20AD）、进样器（SIL-10ADVP）和光电二极管阵列检测器（SPD-M10ADVP）。流动相在进入HPLC系统前先通过脱气装置。分离过程采用250 mm × 4.6 mm内径、5 µm填料的色谱柱进行。实验条件的选择依据是近期文献中报道的典型PCD反应条件。

最简单且最常见的柱后反应器装置称为非分段式管状反应器，其本质上是一根细长的管道，液体可流经其中并发生反应。在此系统中，峰展宽不仅取决于系统中增加的死体积，还与管道的内径有关，这一点已被 Iijima 强调。 等⁸此外，线圈的几何形状也会影响观察到的谱带展宽。Stewart ²⁰ 有研究指出，反应器的盘绕方式会改变二次流的分布，从而实现更佳的混合效果，这意味着死体积可以被最小化。已有研究指出，在使用开放式管状编织线圈时，峰展宽现象并不显著。 ²¹ 当峰展宽过大时，也可考虑其他类型的反应器。 ^20,22这些可能包括填充床反应器或分段流动反应器。这类反应器特别适用于反应速率较慢的反应，否则将需要使用较大的反应环路。由于非分段式管状反应器是连续流化学（PCD）应用中最常用的反应器类型，本文其余部分将重点讨论此类反应器的装置。

反应流（RF）柱的设计采用了一种多端口末端接头，允许流动相通过位于柱子径向中心区域的单个端口流出（或流入），或通过位于柱子外壁区域的三个端口流出（或流入）（见图3）。这两个流路通过一种包含中心多孔筛板的末端接头实现分离，该筛板被一个不透膜的环形结构包围，而此环形结构又进一步被延伸至柱壁的外层多孔筛板所包围。由于存在中心不透膜环，两个多孔区域之间无法发生横向流动。

在反应流色谱过程中，衍生化试剂被泵入反应流色谱柱的一个或两个外侧端口，其流动方向与流动相的流动方向相反。色谱柱流出液在外部烧结片中与衍生化试剂混合，然后通过一个未连接的外侧端口流向检测器。反应流可用于单试剂衍生化（一个端口用于衍生化试剂，一个端口将色谱柱流出液导向检测器，一个端口封闭）或双试剂体系（两个端口分别用于两种衍生化试剂，一个端口将色谱柱流出液导向检测器）。中心流路的流出液可用于检测未衍生化的色谱柱流出液，从而实现检测的多重化²³，或将其排入废液。

进行射频-逆流分配色谱（RF-PCD）时，一个重要的调节技术是中心流与外周流的流量比例。每种衍生化反应的最佳比例取决于多种因素，例如中心流是用于检测还是排入废液。因此，一旦确定了最佳比例，每次运行前都必须确保达到正确的流速比例。

研究发现，在RF-PCD中使用烧结混合器来混合色谱柱洗脱液流和衍生化试剂，相较于传统混合技术（通常采用零死体积T型接头或低死体积W型接头来混合两股流体），能够实现更高效的混合效果。这使得可以使用相对较小的反应环，甚至完全省去反应环。减小反应环尺寸可获得比传统柱后衍生化方法更尖锐的峰形。这意味着，尽管并非所有色谱柱洗脱液都被衍生化，但仍能观察到更高的信噪比，从而实现更低的检测限和定量限。

反应流色谱技术的开发旨在克服将柱后衍生（PCD）反应适配到现代高效液相色谱（HPLC）柱和系统时所遇到的困难，特别是由于需要使用大体积反应环，导致柱后死体积增大，从而引起谱带展宽并降低分离效率的问题。与传统PCD相比，反应流-柱后衍生（RF-PCD）具有更高效的混合过程，因此可采用更小的反应环体积，从而提高观测到的分离效率。此外，与传统PCD技术相比，RF-PCD色谱技术表现出更高的信号强度和更低的噪声水平，使得检测限和定量限均低于传统PCD方法。相较于传统PCD方法，RF-PCD的另一优势在于能够同时监测从RF柱中心端口流出的未衍生化流路以及从柱外围区域流出的衍生化流路。RF-PCD是一项相对较新但极具前景的技术，在诸多方面优于传统的PCD方法。

RF色谱柱的连接方式与常规高效液相色谱（HPLC）色谱柱基本相同，主要区别在于RF色谱柱两端接头的数量。用于将标准HPLC色谱柱连接至HPLC系统的接头同样可用于将RF色谱柱连接至HPLC系统。

方案

注意：请在使用所有材料和试剂前查阅其材料安全数据表（MSDS）即，甲醇的材料安全数据表（MSDS））。处理溶剂和高效液相色谱（HPLC）流动相时，应遵守所有适当的安全操作规程。确保正确使用HPLC的工程控制装置、分析天平和检测器仪器，并佩戴个人防护装备（安全眼镜、手套、实验服、长裤和封闭式鞋）。

注意：本实验方案描述了3种反应流后柱衍生化（RF-PCD）技术，每种方法使用一种针对目标化合物化学性质不同的特异性试剂。如需分析活性氧（ROS），请参见第 "1. 使用DPPH检测ROS^•"，有关伯胺的分析，请参见第节 "2. 使用荧光胺检测伯胺"，以及酚类化合物分析请参见第几节 "3. 使用4-氨基安替比林和铁氰化钾检测酚类物质". 使用超纯水（例如，全程使用 Milli-Q 水）

注意：RF色谱柱的连接方式与常规高效液相色谱（HPLC）色谱柱几乎相同，主要区别在于RF色谱柱上的端接头数量。用于将标准HPLC色谱柱连接至HPLC系统的接头同样可用于将RF色谱柱连接至HPLC系统。

1. 使用 DPPH^• 检测 ROS

1. HPLC仪器的设置
   1. 将HPLC仪器的A通道设置为100%水，B通道设置为100%甲醇作为流动相。根据制造商的要求对泵进行排气操作。
   2. 按照图4A所示，安装HPLC仪器组件及额外的衍生化泵。
   3. 将紫外-可见检测器（UV-Vis检测器）的检测波长设置为520 nm。
2. RF色谱柱的设置
   1. 将RF色谱柱的入口连接至HPLC仪器。
   2. 使用一段长度为15 cm、内径为0.13 mm的管路，连接RF色谱柱出口的中心端口。
   3. 使用一段长度为15 cm、内径为0.13 mm的管路，将出口的外围端口连接至紫外-可见检测器。
   4. 将DPPH^•泵的管路连接至RF色谱柱出口的一个外围端口。
   5. 使用色谱柱堵头封闭RF色谱柱出口上未使用的外围端口。
   6. 将HPLC泵的流速调节至1 ml min^-1，流动相为100% B通道—100%甲醇。
   7. 使用100%甲醇流动相平衡色谱柱10分钟（适用于内径4.6 mm、长度100 mm的色谱柱）。若使用其他尺寸的色谱柱，此时间应相应调整。
3. DPPH^•试剂的配制
   1. 用甲醇配制浓度为0.1 mg/ml的DPPH^•溶液。
   2. 将盛有DPPH^•试剂的烧瓶超声处理10分钟。
   3. 用铝箔包裹烧瓶，避免光照。
   4. 根据制造商的要求，用配制好的DPPH^•试剂对DPPH^•泵进行排气操作。
4. 调节RF色谱柱出口分流比例
   1. 准确称量两个洁净且干燥的容器。将其中一个标记为“中心”，另一个标记为“外围”。
   2. 收集从中心端口流出的液体至标记为“中心”的容器中，持续1.0分钟。
   3. 重新称量中心端口容器，并按下式计算中心端口流出液体的质量：
      中心端口质量（g）= 中心端口容器最终质量（g）－中心端口容器初始质量（g）
   4. 重复步骤1.4.2和1.4.3，收集从连接RF色谱柱外围端口的紫外-可见检测器流出的液体至标记为“外围”的容器中，并按下式计算外围端口容器中液体的质量：
      外围端口质量（g）= 外围端口容器最终质量（g）－外围端口容器初始质量（g）
   5. 按下式计算来自中心端口和外围端口的流体所占百分比：
      % 中心端口 = 中心端口质量（g）/（中心端口质量（g）+ 外围端口质量（g））× 100
      % 外围端口 = 外围端口质量（g）/（中心端口质量（g）+ 外围端口质量（g））× 100
   6. 确保中心流与外围流的分流比例为30:70（中心:外围）。若中心流比例高于30%，可通过在中心端口出口处增加一段内径为0.13 mm的管路来减少流出量；若中心流比例低于30%，则减少中心端口连接的0.13 mm管路长度。
   7. 重复步骤1.4.1至1.4.6，直至达到30:70（中心:外围）的分流比例。
   8. 将DPPH^•试剂泵的流速设定为0.5 ml min^-1。
      注：RF色谱柱与DPPH^•试剂的系统现已准备就绪，可进行样品分析。现在可以进样。
5. 运行结束后的关机步骤
   1. 所有样品进样完成后，表明运行已结束，停止衍生化试剂泵的流动。
   2. 将DPPH^•试剂泵的管路从外围端口移除，并用堵头封闭该端口。
   3. 使用色谱柱储存所需的流动相，以1 ml min^-1的流速通过色谱柱冲洗10分钟，以平衡色谱柱。
   4. 停止HPLC仪器上流动相泵的流动。
   5. 将DPPH^•试剂更换为甲醇，并对附加泵进行排气冲洗。
      注：此时可关闭HPLC系统。

2. 使用荧光胺检测伯胺

1. 流动相的制备
   1. 配制1 L的10 mM乙酸铵溶液，在定容前用5 M氢氧化铵调节溶液pH至9.0。
   2. 向乙酸铵缓冲液中加入52.6 ml乙腈（ACN），得到95:05（缓冲液:ACN）的预混流动相。
2. HPLC仪器的设置
   1. 将预混好的缓冲液作为流动相接入HPLC仪器A通道，并根据制造商要求对泵进行排气操作。
   2. 按照图4A所示，安装HPLC仪器各组件及额外的衍生化泵。
   3. 在衍生化泵上连接一段脉冲阻尼线圈。
   4. 设置荧光检测器（FLD），激发波长为390 nm，发射波长为475 nm。
3. RF色谱柱的安装
   1. 将RF色谱柱的入口端连接至HPLC仪器。
   2. 使用一段长度为15 cm、内径为0.13 mm的管路连接RF色谱柱出口中心端口。
   3. 使用一段长度为15 cm、内径为0.13 mm的管路将RF色谱柱出口外围端口连接至FLD检测器。
   4. 将衍生化泵的管路连接至RF色谱柱出口的一个外围端口。
   5. 使用色谱柱堵头封闭RF色谱柱出口端未使用的外围端口。
   6. 将HPLC泵的流速调节至1 ml min^-1，流动相为100% A通道——pH 9的10 mM乙酸铵缓冲液（预先与5% ACN混合）。
   7. 使用100% A通道流动相对色谱柱平衡10 min （适用于内径4.6 mm、长度100 mm的色谱柱）。若使用其他尺寸的色谱柱，可按比例调整平衡时间。
4. 荧光胺试剂的配制
   1. 配制100 ml浓度为0.1 mg ml^-1的荧光胺试剂。
   2. 超声处理1分钟。
   3. 用铝箔包裹以避光。
   4. 根据制造商要求，用配制好的荧光胺试剂对试剂泵进行冲洗排气。
5. 调节RF色谱柱出口分流比例
   1. 准确称量两个洁净且干燥的容器，分别标记为“中心”和“外围”。
   2. 将中心端口流出的洗脱液收集至标记为“中心”的容器中，持续1.0分钟。
   3. 重新称量中心容器，并按步骤1.4.3所示方法计算中心端口的流出液质量。
   4. 对连接至RF色谱柱外围端口的FLD检测器流出的洗脱液重复步骤2.5.2至2.5.3，并按步骤1.4.4所示方法计算外围端口的流出液质量。
   5. 按步骤1.4.5所示方法计算来自中心端口和外围端口的流体百分比。
   6. 确保中心流与外围流的分流比例为43:57（中心:外围）。若中心流高于43%，可通过在中心端口出口处增加一段内径为0.13 mm的管路来减少流量；若中心流低于43%，则缩短中心端口连接的0.13 mm管路长度。
   7. 重复步骤2.5.1至2.5.6，直至达到43:57（中心:外围）的分流比例。
   8. 将流动相泵的流速设定为0.7 ml min^-1。
   9. 将衍生化泵的流速设定为0.1 ml min^-1。
      注：RF色谱柱与荧光胺试剂的系统现已准备就绪，可进行样品分析。现在可以进样。
6. 运行后关机条件
   1. 所有样品进样完成后，表明运行结束，停止衍生化泵。
   2. 将衍生化泵管路从外围端口移除并用堵头封闭。
   3. 使用色谱柱储存所需的流动相以1 ml min^-1的流速通过色谱柱冲洗10分钟，使色谱柱重新平衡。
   4. 停止流动相泵的流动。
   5. 将荧光胺试剂更换为乙腈，并对衍生化泵进行冲洗。
      注：此时可关闭HPLC系统。

3. 使用4-氨基安替比林和铁氰化钾检测酚类物质

1. 流动相的配制
   1. 配制1 L 100 mM乙酸铵溶液，于定容前用5 M氢氧化铵调节溶液pH至9.0。
   2. 向乙酸铵缓冲液中加入52.6 ml甲醇，得到缓冲液:甲醇比例为95:5的预混流动相。
2. 高效液相色谱仪的设置
   1. 使用预先配制的缓冲液作为流动相，连接至HPLC仪器的A通道。根据制造商要求对泵进行排液。
   2. 安装高效液相色谱仪的各个组件以及两个额外的试剂泵，具体配置如图所示 图4B.
   3. 为每台试剂泵连接一个脉冲阻尼线圈。
   4. 将紫外-可见光检测器设置为在500 nm波长下进行分析。
3. RF 柱的安装
   1. 将RF色谱柱的入口端连接至HPLC仪器。
   2. 将一段15 cm长、内径0.13 mm的管路连接至RF柱的中心出口端口。
   3. 将RF色谱柱的出口侧端口通过一段15 cm长、内径为0.13 mm的管路连接至紫外-可见光检测器。
   4. 连接每种试剂（即，4-氨基安替比林和铁氰化钾）泵管路连接至RF柱出口的侧端口。
   5. 将高效液相色谱泵的流速调至 1 ml min^-1 100% A相 - 100 mM 醋酸铵缓冲液（pH 9），已与5%甲醇预混合。
   6. 用100% A相流动相平衡色谱柱10分钟 对于内径4.6 mm、长度100 mm的色谱柱。该时间可根据用户所使用的其他规格色谱柱的尺寸进行相应调整。
4. 4-氨基安替比林试剂的配制
   1. 按照步骤 3.1.1 配制 pH 为 9 的醋酸铵缓冲液。
   2. 称取150 mg 4-氨基安替比林，溶于100 ml已配制的醋酸铵缓冲液（pH 9）中。
   3. 超声处理1分钟。
   4. 用铝箔覆盖以避免光照。
   5. 根据制造商的要求，用配制好的4-氨基安替比林试剂冲洗第一试剂泵。
5. 铁氰化钾试剂的配制
   1. 称取150 mg铁氰化钾，溶于按步骤3.1.1制备的100 ml醋酸铵缓冲液（pH 9）中。
   2. 超声处理1分钟。
   3. 用铝箔覆盖以避免光照。
   4. 根据制造商的要求，用配制好的铁氰化钾试剂冲洗第二个试剂泵。
6. 射频柱调谐
   1. 准确称量两个洁净且干燥的容器。将其中一个容器标记为中央室，另一个标记为外周室。
   2. 将从中央端口流出的渗出液收集到标记为“central”的容器中，持续1.0分钟。
   3. 重新称量中心容器，并按1.4.3步骤计算中心端口流出液体的重量。
   4. 重复步骤 3.6.2 至 3.6.3，针对从连接至 RF 柱外周端口的 UV-Vis 出口流出的流出液进行操作，并按照步骤 1.4.4 中的方法计算外周部分的重量。
   5. 按照步骤1.4.5中的方法计算来自中央端口和外周端口的流体百分比。
   6. 确保中心流与外周流的分流比例为50:50（中心:外周）。若中心流超过50%，可通过在中心出口端增加一段内径为0.13 mm的管路来减少流出量；若中心流低于50%，则减少中心端口处内径为0.13 mm的管路长度。
   7. 重复步骤 3.6.1 至 3.6.6，直至达到 50:50（中央：外周）的分割比例。
   8. 将4-氨基安替比林泵的流速设置为0.5 ml/min^-1.
   9. 将铁氰化钾泵的流速设置为 0.25 ml min^-1.
      注意：使用双组分试剂建立的RF色谱柱现已准备就绪，可进行分析。现在可以进样。
7. 运行后关机条件
   1. 所有样品注入完成后，运行结束，表明运行已终止，此时停止两个试剂泵。
   2. 从外周端口移除试剂泵管路，并更换为一段15 cm长的0.13 mm管。
   3. 用储存时所用的流动相平衡色谱柱，使流动相以1 ml/min的流速通过色谱柱^-1 10 分钟。
   4. 停止高效液相色谱仪的流动相泵的流动。
   5. 将试剂泵中的两种试剂均更换为甲醇，并根据制造商要求清洗额外的泵。
      注意：现在可以关闭高效液相色谱系统。

结果

首个被改造用于射频等离子体化学检测（RF-PCD）的等离子体化学检测（PCD）方法是利用2,2-二苯基-1-苦基肼自由基（DPPH^•）²⁴对抗氧化剂进行衍生化。该反应由Koleva et al.²⁵首次提出，此后被广泛应用。该检测方法基于在活性氧存在下DPPH^•自由基发生褪色，因此抗氧化剂的存在会导致观测到的吸光度下降。传统的DPPH^•反应通常需要使用500 µl或更大的反应环^13-15，然而研究发现，在使用RF-PCD色谱柱时无需反应环。图5展示了采用常规PCD和RF-PCD仪器对意式浓缩咖啡样品进行DPPH^•自由基衍生化后的两个色谱图。

第二种被RF-PCD采用的PCD方法是使用荧光胺作为衍生化试剂对四种氨基酸（甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）进行衍生化²³。该方法改编自Udenfriend et al.¹¹

讨论

RF-PCD 能够在无需使用反应圈的情况下，高效地将衍生化试剂与色谱柱流出的 HPLC 流动相在柱后混合，从而最大限度地减少谱带展宽效应，并提升分离性能。相较于检测方法，RF-PCD 方法在信号响应方面也表现出显著改善。Camenzuli 等²⁸ 首次报道了使用DPPH反应流柱^• 用于检测意式浓缩咖啡样品中的活性氧（ROS）。他们的研究涉及分析和优化射频（RF）条件以获得最佳性能，并测试了一系列DPPH^• 不同DPPH浓度^• 试剂流速。结论是 DPPH^• 0.1 mg/ml 浓度^-1 使用 DPPH^• 试剂流速为0.5 ml/min^-1 可实现更优的分离性能（即，与传统的DPPH法相比，在RF-PCD条件下具有更高的效率和灵敏度^• 衍生化 图5 显示了利用DPPH的两个色谱图^• 意式浓缩咖啡样品中抗氧化剂的检测。特别值得注意的是保留时间约为5 min的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高效液相色谱仪	Agilent	1290 Series HPLC
衍生化系统附加泵	Shimadzu	LC-20A
RF 柱			非商业产品
PEEK 管	Sigma Aldrich	Z227307
色谱柱堵头			随柱提供
PEEK 管切割器	Sigma Aldrich	Z290882
分析天平			四点分析天平
秒表			非科学仪器
洗脱液收集小瓶			任何平底小瓶均可，例如，HPLC 小瓶
HPLC 小瓶			取决于所用仪器
流动相和衍生化溶液用容器	Sigma Aldrich	Z232211
常规实验室玻璃器皿			容量瓶、移液器等，等等，数量和体积取决于样品制备方法
甲醇	Sigma Aldrich	34860
DPPH	Sigma Aldrich	D9132
乙酸铵	Sigma Aldrich	17836
氨水	Sigma Aldrich	320145	腐蚀性
乙腈	Sigma Aldrich	34998
荧光胺	Sigma Aldrich	F9015
4-氨基安替比林	Acros Organics BVBA	AC103151000
铁氰化钾	AnalaR	B10204-30