帘流柱：效率与灵敏度的优化

摘要

本文介绍了一种在帘流（CF）模式下操作和优化活性流技术（AFT）色谱柱以提高分离性能的实验方案。

摘要

主动流技术（Active Flow Technology，AFT）是一种色谱柱技术，通过使用专门设计的多端口端盖装置，提升高效液相色谱柱的分离性能。幕流（Curtain Flow，CF）色谱柱属于AFT系列色谱柱，其设计特点是将样品注入色谱柱填料的径向中心区域，同时在溶质注入区域周围引入一层流动相的“幕流”，以阻止样品向柱壁发生径向扩散。该色谱柱可发挥“无限直径”色谱柱的功能。该设计旨在克服色谱柱填料的径向非均一性，同时最大化将样品载入色谱柱填料的径向中心区域，从而提高检测灵敏度。本文所述方案详细说明了系统与CF色谱柱的安装步骤，以及优化“无限直径”虚拟色谱柱性能的调节过程。

引言

近年来，高效液相色谱（HPLC）的色谱柱技术取得了显著进展；由于采用了更小的颗粒尺寸以及更高效的核壳型颗粒，色谱峰容量已大幅提升。由于分离效率普遍提高，随之而来的效应是检测灵敏度的提升，因为色谱峰变得更尖锐，因而更高^1-8。

然而，径向床层非均一性仍然是所有色谱柱性能的限制因素，但这并非新问题，因为色谱工作者多年来早已认识到这一点。色谱柱床层在径向^9-12和沿柱轴方向^10,12-15均存在非均一性。其中，壁面效应尤其显著，是导致分离性能下降的重要原因^7,16-18。Shalliker 和 Ritchie⁷ 近期已综述了色谱柱床层非均一性的相关方面，因此此处不再进一步讨论。但需指出的是，柱床填充密度的差异以及壁面效应会导致溶质塞的变形，使得溶质带在通过色谱柱时以类似部分中空的汤碗形状的塞状物出峰，而非基础教学资料中通常描绘的薄而平整的实心圆盘状⁷。当通过实验对溶质在床层中的迁移过程进行可视化观察时，发现柱内溶质塞的剖面呈部分中空状，且谱带拖尾部分主要来源于样品塞在柱壁区域的组分。最终结果是，分离这些“部分中空”的溶质塞所需的理论塔板数，远高于若溶质塞为实心且平整时所需的数量^12,14,17。为克服与壁面效应及径向填充密度变化相关的谱带展宽问题，一种名为主动流体技术（Active Flow Technology, AFT）的新型色谱柱技术被设计出来^7,19。该设计的目的是通过物理方式分离沿柱壁区域流动的流动相与柱体径向中心区域流动的流动相，从而消除壁面效应¹⁹。AFT 柱主要有两种类型：平行分段流（Parallel Segmented Flow, PSF）柱和帘流（Curtain Flow, CF）柱⁷。由于本实验方案旨在介绍 CF 柱的使用与优化，因此不再进一步讨论 PSF 柱。

帘式流（CF）

帘流（Curtain Flow, CF）色谱柱结构在色谱柱的入口和出口均采用AFT端接头。AFT端接头由位于多通道接头内部的环形烧结片组成。该烧结片由三部分构成：一个多孔的径向中心区域，与端接头的中心通道对齐；一个多孔的外周区域，与端接头的外围通道对齐；以及一个不透性的环形隔层，用于分隔上述两个多孔区域，防止烧结片的径向中心区域与外周区域之间发生交叉流动¹⁹。图1展示了AFT烧结片的结构设计，图2展示了CF色谱柱的结构形式。在此操作模式（CF）下，样品通过入口端接头的径向中心通道注入，同时额外的流动相通过入口端接头的外围通道引入，以“帘流”方式包覆溶质在色谱柱径向中心区域的迁移过程。因此，样品仅从色谱柱床层的径向中心区域进入，而色谱柱的外周区域仅有流动相通过。研究表明，对于内径为4.6 mm的色谱柱，其入口端接头中心通道与外围通道的体积流速比约为40:60时效果最佳^6,7,16。CF色谱柱的AFT出口端接头可调节中心通道与外围通道的流速比例，通过压力调控可实现几乎任意所需的比例。优化CF色谱柱可显著提升该技术在分离效率或检测灵敏度等方面的多种功能性能。通过这种方式，可构建一种“无壁”、“无限直径”或“虚拟”色谱柱^6,10,18,20。CF色谱柱的设计目的在于主动调控样品在色谱柱内的迁移路径，防止样品扩散至柱壁区域。因此，当样品流出至检测器时，其溶质浓度达到最大化，与传统色谱柱结构相比，使用紫外（Ultraviolet, UV）检测时灵敏度可提高约2.5倍¹⁶，而使用质谱检测时提升更为显著⁶。

CF色谱柱非常适合低浓度样品，因为其检测灵敏度更高。此外，当与流速受限的检测器（如质谱仪（MS））联用时，CF色谱柱尤为理想⁶。例如，一个内径为4.6 mm的AFT色谱柱，通过将出口中心流速调节至21%，在相同线性流速下运行时，可向检测器输送与标准内径2.1 mm色谱柱相同体积的溶剂。同样，通过将出口中心流速调节至43%，该AFT色谱柱也可被调节为向检测器输送与内径3.0 mm色谱柱相同体积的载样量。事实上，可通过调节实现任意“虚拟”色谱柱规格，以满足特定的分析需求^6,18,22。使用这些专门设计的进出口端接头，可确保形成真正的无壁色谱柱结构。

将溶剂输送系统连接到进样口的中心端口和侧端口有两种方式：分流系统⁶和双泵系统^6,7。图3展示了这两种CF系统的配置方式。

分流系统

在分流系统中（图3A泵流在进入进样器之前，使用无死体积的T型接头进行分流，其中一路流动相流路连接至进样器，随后连接至色谱柱入口端接头的中心端口；另一路流动相流路则绕过进样器，直接连接至色谱柱入口的外周端口。在分流过程中，需在管路连接至色谱柱前，将两路流速比例调节为40:60（中心:外周）。 即从进样器到中心，泵到外周。

双泵系统

CF 柱在柱入口接头处需要两股流动相流路。根据高效液相色谱仪自动进样器/进样阀的类型，可能无法实现分流配置，因此可通过两台泵实现 CF（图 3B²¹）。每台泵分别分配并连接至中心端口或外周端口，流速设定为中心端口占总流速的 40%，外周端口占 60%。例如，若总流速为 1.0 ml min^-1，则中心泵的流速设定为 0.4 ml min^-1，外周泵的流速设定为 0.6 ml min^-1。

选择何种操作模式在很大程度上取决于高效液相色谱（HPLC）仪器配置和色谱操作模式。例如，在某些自动进样器中，样品加载位置与样品注入位置之间可能发生压力变化，从而破坏分流比例，因此在这种情况下，建议采用双泵系统以实现毛细管分流（CF）的最佳性能。无论为CF色谱柱入口选择何种溶剂输送系统配置，CF出口的优化原则均保持不变。CF色谱柱的出口中心端口应使用尽可能小体积的管路连接至紫外-可见光（UV-Vis）检测器，以最大限度地减少柱后死体积的影响。由于CF色谱柱模拟的是窄径色谱柱，柱出口与检测器之间的死体积会严重损害CF色谱柱的分离性能。因此，必须确保中心端口与UV-Vis检测器之间的管路体积最小，以降低死体积带来的不利影响，如谱带展宽、柱效和灵敏度下降。为此，建议使用窄径管路（内径0.1 mm），以便在不引入额外死体积的前提下灵活调节压力。同时，外周端口也需连接管路并导向废液。在CF色谱柱出口处，可根据分析人员的具体需求调节分流比例。例如，当使用内径为4.6 mm的CF色谱柱时，通常可将分流比例设置为43:57或21:79（中心:外周），分别模拟“虚拟”内径3.0 mm或2.1 mm的色谱柱，从而便于直接对标分离性能。分流比例可通过称量在一定时间内从中心端口连接的检测器出口流出的液体量以及从外周端口流出的液体量来测定。随后可计算出各端口的流量百分比，并通过调整所连接管路的长度或使用不同内径（i.d.）的管路来调节分流比例。

本视频方案详细介绍了CF色谱柱的操作与优化步骤，以提升色谱性能。

方案

注意：请在使用所有材料和试剂前查阅其材料安全数据表（MSDS）即， 甲醇的安全数据表（MSDS）。处理溶剂和高效液相色谱（HPLC）流动相时，应遵守所有适当的安全操作规程。确保正确使用HPLC的工程控制装置、分析天平和检测器仪器，并佩戴个人防护装备（安全眼镜、手套、实验服、长裤和封闭式鞋）。

注意：本方案包含如何在配备紫外-可见光检测器的高效液相色谱系统上使用CF柱的说明。编写本方案时假定读者已具备色谱学的基本知识和实践经验。

1. 高效液相色谱仪的设置

注意：本部分可根据分析人员的需求进行调整， 即， 溶剂选择、检测波长和流速，需与目标样品相适应。

1. 使用100%超纯水准备高效液相色谱仪（HPLC）仪器（例如，A通道使用Milli-Q水作为流动相，B通道使用100%甲醇作为流动相，并根据仪器制造商的要求冲洗泵。
2. 将紫外-可见光检测器设置为254 nm。
3. 选择预注射分流模式或双泵流动模式进行设置。若采用分流模式，请进入步骤2；若采用双泵模式，请进入步骤3。

2. 分流系统设置

1. 断开自动进样器进样阀上的泵管。
2. 将三通接头连接到泵管线上。
3. 将一段15 cm长、内径为0.13 mm的管路连接到T型接头的每个接口上。
4. 将一根导管从三通管连接至自动进样器的进样阀。
5. 将泵设置为 1.0 ml/min^-1.
6. 在将泵管路连接至CF柱入口之前，按照步骤2.7将流路的分段比例调节至40%:60%（中心管路：外周管路）。
7. 调节分流系统中CF入口比例
   1. 使用分析天平称量两个空的收集容器的质量，并将其中一个标记为“中央”，另一个标记为“外周”（分别用于自动进样器至中心端口的管路和T型接头至外周端口的管路）。
   2. 在1.0分钟内，从进样器出口端（即将连接色谱柱的管路）收集流出的流动相至收集容器中，该容器的质量已在2.7.1中测定。
   3. 在分析天平上重新称量收集容器，确定所收集流动相的质量。
   4. 重复步骤 2.7.2 至 2.7.3，针对从 T 型接头流出并连接至外周端口的洗脱液进行操作。
   5. 测定流速百分比（ml/min）^-1）根据以下公式计算各流速下的数值：
      
   6. 调节流速比例至40%:60%（±2%）（来自进样器的管线至 中央 三通管到管路的连接 外周 端口）。如果从注射器到 中央的 分流流量百分比超过40%时，可通过减小管路内径或增加其长度来提高压力降。若从注射器到 中央的 当端口流量百分比低于40%时，应增大管路的内径或缩短管路长度。
   7. 调节好流速比后，关闭泵的流速。
   8. 将进样器的管路连接至色谱柱进样口的中心端口，将T型接头的管路连接至色谱柱进样口的侧端口。
   9. 缓慢将流速升至1.0 ml/min^-1 在100% B相条件下。
   10. 用1.0 ml/min流速使100%甲醇（B通道）流动相流经色谱柱（内径4.6 mm，长度100 mm）以平衡色谱柱^-1 10分钟。此时间可根据用户使用的其他柱子的尺寸进行相应调整。
   11. 对于CF出口的调节，请进入第4步“CF出口流量调节”。

3. 双泵系统设置

1. 将HPLC系统泵连接至进样器，然后将进样器的出口管线连接至色谱柱的中心入口端口。
2. 将额外的泵直接连接至色谱柱的外周入口端口。注意，该第二台泵绕过进样器。
3. 将连接至中心端口的系统泵流速梯度升至0.4 ml min^-1（相当于总流速1.0 ml min^-1的40%），流动相为100%甲醇（B管线）。
4. 与步骤3.3同时，将外周泵的流速梯度升至0.6 ml min^-1（相当于总流速1.0 ml min^-1的60%），流动相为100%甲醇（B管线）。
5. 使用100%甲醇（B管线）流动相，以1.0 ml min^-1的流速冲洗色谱柱（内径4.6 mm，长度100 mm）10分钟，以平衡色谱柱。若使用其他尺寸的色谱柱，此时间应根据柱体积相应调整。
6. 如需调节CF出口，请进入第4步“CF出口流路的调节”。

4. 调整 CF 出口流速

1. 使用一段长15 cm、内径为0.13 mm的管路将中心出口端口连接至紫外-可见光检测器。
2. 将一段长15 cm、内径为0.13 mm的管路连接至CF色谱柱的外周出口端口。
3. 在分析天平上称量两个空收集容器的质量，并将其中一个标记为“中心”，另一个标记为“外周”。
4. 收集从紫外-可见光检测器流出的流动相（中心流）1.0分钟，并将其导入步骤4.2中已称重并标记为“中心”的收集容器中。
5. 重新称量装有收集洗脱液的容器质量，并确定所收集流动相的质量。
6. 对外周出口端口流出管路的洗脱液重复步骤4.4至4.5。
7. 根据以下公式计算每条流路的流量百分比：
   
8. 调节流速比例至21%:79%（±2%）（来自紫外-可见光检测器的中心出口流速 : 来自管路的外周出口流速）。 如果来自紫外-可见光检测器的中心流速百分比高于21%，可通过减小连接在紫外-可见光检测器出口处管路的内径或增加其长度来提高压降；如果中心流速百分比低于21%，则应增大该管路的内径或缩短其长度。每次更改管路长度后，均需重复步骤4.3至4.7。
   注：CF色谱柱在“虚拟”2.1 mm内径模式下已准备就绪，可用于分析。

结果

AFT色谱柱采用专用的烧结设计制备（图1）以克服色谱柱床的不均匀性并提高分离性能。关于CF色谱柱分离性能的多实验室研究（图2) 采用双泵系统进行图3B如本方案第3节所述²³通过“虚拟”2.1 mm 内径柱对三组分测试混合物进行了分析，其中CF柱中央出口流的21%被导向检测器。三组分测试混合物的分离结果表明，相较于标准色谱柱，CF柱在柱效和灵敏度方面性能更优。该三组分测试混合物包含苯乙醚、丁苯和戊苯，在常规4.6 mm和2.1 mm内径色谱柱，以及分段比为22:78（中心:外围）的4.6 mm内径CF柱上进行分析，以模拟2.1 mm内径柱的性能。图4）。分离效率以理论塔板数（N）和灵敏度进行评价。采用CF色谱柱进行分析时，检测限较低（图5）以及敏感性的提高（图4 和 6相较于传统的柱分析方法，无论使用何种实验室或类型的...

讨论

本研究对CF色谱柱进行了实验室间分析，以检测其在效率和灵敏度方面的分析性能。CF色谱柱采用双泵系统，如“3. 双泵系统设置”部分所述，在CF色谱柱入口处实现40:60（中心:外围）的流速比。通过将每台泵的流速分别设置为总流速的40%和60%，达到40:60（中心:外围）的流速比。CF色谱柱出口通过“4. CF出口流速调节”部分所述的步骤，调节至内径为2.1 mm的“虚拟”色谱柱。使用含有苯乙醚、丁基苯和戊基苯的混合样品作为测试标准品，比较内径为4.6 mm的CF色谱柱（22:78）与传统的4.6 mm和2.1 mm内径色谱柱的分离性能。图4展示了使用三种色谱柱分别对测试混合物进行色谱分离的叠加图。该图中观察到的主要差异是，使用CF色谱柱获得的分离信号响应显著增强。如预期，由于色谱条件已按色谱柱横截面积进行比例缩放，4.6 mm和2.1 mm内径传统色谱柱的信号响应几乎完全相同。

线性关系和检测限也在CF模式与常规操作模式之间进行了评估，其中在不同的高效液相色谱系统上，以不同的流速制备并分析了一系列标准品的重复样品。无论使用哪种高效液相色谱系统或何种...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高效液相色谱仪
附加泵			若使用双泵 Curtain Flow 系统配置，则必须配备。
Curtain Flow 高效液相色谱柱	Thermo Fisher Scientific	未定义	即将商业化
甲醇	任意品牌		色谱纯级
PEEK 管路	任意品牌		多种长度和内径
PEEK 管切割器	任意品牌
分析天平	任意品牌
秒表	任意品牌
洗脱液收集容器	任意品牌		可使用 1–2 ml 样品瓶作为洗脱液收集容器
三通接头	任意品牌